锝-99m标记环丙沙星黄原酸盐配合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及放射性药物化学和临床核医学技术领域，具体说是涉及到一种锝-99m标记环丙沙星黄原酸盐配合物及其制备方法和应用。

背景技术：
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炎症是一种常见而又重要的病理过程，而炎症反应与人体健康有着紧密的关系。尽管抗生素的出现使得炎症治疗有了很大的改善，但是随着现代医学的发展，各类化疗药剂使用，使得免疫力低下的病人越来越多。另外抗生素的大量使用也导致机体对这些药物的敏感程度降低，全球抗生素的滥用使得细菌的抗药性越来越强，甚至出现了超级细菌。时至今日，炎症依然成为全人类特别是发展中国家最常见的疾病之一，如何能早期有效区分细菌性炎症和非细菌炎症，让病人得到及时准确的治疗，成为目前迫切需要解决的问题。

核医学显像可以准确地定位病灶区域，反映炎症的病理生理变化，有助于发现病因从而针对性地制定治疗方案，灵敏度高，特异性强。而随着核医学显像的发展，制备和开发安全、有效的炎症显像剂，成为当前临床研究的迫切需要。锝-99m标记的环丙沙星(^99mtc-ciprofloxacin)作为诊断炎症的放射性药物已经应用于临床，它可以区分细菌性炎症和非细菌性炎症，但其仍存在标记率不够高，特异性不高以及造成假阳性等不足，因此开发新型的该类炎症显像剂具有必要性。

本发明将锝-99m标记环丙沙星黄原酸盐配合物写为^99mtcn核标记环丙沙星黄原酸盐配合物，将含有喹诺酮类药效基团的环丙沙星转化为可与^99mtc络合的环丙沙星黄原酸盐配体(cpf2xt)，利用cpf2xt配体中的s原子与[^99mtcn]²⁺核配位制备稳定性好的^99mtcn-cpf2xt配合物来用作新型炎症显像剂，具有重要的现实意义和广阔的临床应用前景，也是本领域面临的重要任务。

技术实现要素：
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本发明的目的在于提供一种放化纯度高、稳定性良好，制备简便，应用于炎症显像领域的^99mtcn核标记的环丙沙星黄原酸盐配合物，同时提供其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种^99mtcn核标记环丙沙星黄原酸盐配合物，分子通式写为一种^99mtcn-cpf2xt配合物，其结构式如下：

^99mtcn-cpf2xt配合物的制备方法如下：

1.配体cpf2xt的合成：

其合成路线为：

称取一定量的环丙沙星，溶解于无水甲醇中，缓慢加入对甲苯磺酸，搅拌至混合均匀并充分溶解；80℃下油浴加热反应12h，冷却至室温之后缓慢加入nahco3溶液，用ch2cl2萃取，无水硫酸镁干燥有机相，过滤，旋蒸，得白色固体，为化合物i；

称取一定量化合物i，碳酸钾与溴乙醇，以乙腈作为溶剂，80℃油浴加热，搅拌回流反应12h；向反应体系加入适量去离子水溶解，用ch2cl2萃取，合并有机相并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸，用ch2cl2/ch3oh进行柱层析纯化，得白色固体，为化合物ii；

称取一定量化合物ii，溶于甲醇-水溶液中，室温下搅拌反应8h；旋蒸除去甲醇，并在剩余溶液中加入适量去离子水；缓慢滴加醋酸溶液，调节ph＝5～6；用ch2cl2萃取，合并有机相并用无水硫酸镁干燥，抽滤，旋蒸，用ch2cl2/ch3oh进行柱层析纯化，得白色固体，为化合物iii；

称取一定量化合物iii，加入koh，100℃条件下反应1h，之后在冰水浴冷却下，滴加二硫化碳(cs2)，搅拌反应2h后，常温搅拌反应过夜；旋蒸除去多余cs2，冷冻干燥，用甲醇/无水乙醚重结晶，将产物放置于真空干燥箱干燥，得淡黄色固体，为化合物cpf2xt；

2.^99mtcn-cpf2xt的制备：

取一支含有丁二酰二酰肼(sdh)、1,2-丙二胺四乙酸、sncl2·2h2o的sdh冻干药盒，将适量新鲜^99mtco4^-淋洗液加入其中，充分摇匀，室温下反应20分钟得到[^99mtcn]²⁺中间体溶液；将5mgcpf2xt配体加入到上述中间体溶液中，在室温下反应30分钟，得到^99mtcn-cpf2xt配合物，其反应路线如下：

^99mtco4^-+sdhkit→[^99mtcn]int²⁺

[^99mtcn]int²⁺+cpf2xt→^99mtcn-cpf2xt。

本发明所述的化学合成试剂均是市售商品，来源广泛，容易获得，sdh冻干药盒已商品化，可以从北京师宏药物研制中心购买获得。

通过上述方法制备的^99mtcn-cpf2xt配合物的放射化学纯度大于90％，其体外稳定性良好。该配合物在金黄色葡萄球菌致炎的小鼠模型中有较高的炎症摄取、炎症/肌肉以及炎症/血比值，可以成为一种新型的细菌性炎症显像剂。

将^99mtcn-cpf2xt、^99mtc-ciprofloxacin和^99mtcn核标记环丙沙星氨荒酸盐配合物(^99mtcn-cpfxdtc)在细菌性炎症模型小鼠体内生物分布数据进行比较，结果如表1：

表1^99mtcn-cpf2xt、^99mtcn-cpfxdtc和^99mtc-ciprofloxacin在注射后4h在细菌性炎症模型小鼠体内生物分布[(x±s)％id/g]

以上结果表明，尽管^99mtcn-cpf2xt在炎症中的摄取略低于^99mtcn-cpfxdtc，但是其炎症/肌肉与炎症/血液比值均优于^99mtcn-cpfxdtc，且其肝脏、肺的摄取明显低于^99mtcn-cpfxdtc，降低了腹部的放射性摄取，有利于提高显像效果。与^99mtc-ciprofloxacin相比，^99mtcn-cpf2xt有着更高的炎症摄取、炎症/肌肉与炎症/血液比值，表明^99mtcn-cpf2xt作为一种性能优良的新型炎症显像剂具有广阔的应用前景。实验表明，^99mtcn-cpf2xt配合物的鉴定及性能如下：

1.^99mtcn-cpf2xt配合物的层析鉴定：

薄层层析色谱(tlc)鉴定：用聚酰胺薄膜作为支持体，分别用生理盐水和乙腈作展开剂，测定的层析结果见表2。

表2各组分的层析结果(rf值)

由上述层析鉴定所测得的标记物的放射化学纯度大于90％。

2.^99mtcn-cpf2xt配合物的脂水分配系数的测定

取10ml离心管，分别加入0.9mlpbs缓冲溶液(0.025mol/l)，1.0ml正辛醇，0.1ml^99mtcn-cpf2xt配合物溶液，于旋涡振荡器旋转混匀3min，之后在5000rpm下离心5min。分别取有机相和水相0.1ml，测定两相放射性计数,并计算其分配系数p(p＝有机相的放射性活度/水相的放射性活度)，测得logp＝-0.12，说明^99mtcn-cpf2xt是一种亲水性物质。

3.^99mtcn-cpf2xt配合物的稳定性测定

将标记好的^99mtcn-cpf2xt配合物分别在室温下和在37℃小鼠血清中放置不同时间(1、2、3、4、5、6小时)后测定其放射化学纯度，实验结果表明该配合物在室温下和在37℃小鼠血清中放置6小时后放射化学纯度均大于90％，说明其体外稳定性良好。

4.^99mtcn-cpf2xt配合物的体外细菌竞争结合实验

在一离心试管中加入0.1ml约含金黄色葡萄球菌1×10⁸个的pbs溶液(0.025mol/l，ph＝7.4)、0.8ml生理盐水、0.1ml^99mtcn-cpf2xt配合物溶液，作为实验组；离心试管中加入0.1ml不含细菌的pbs溶液(0.025mol/l，ph＝7.4)、0.8ml生理盐水、0.1ml^99mtcn-cpf2xt配合物溶液，作为空白组。将两组在37℃恒温箱中孵育1h后，离心，得到细菌沉淀与上清液。移取上清液，用1mlpbs溶液(0.025mol/l，ph＝7.4)洗涤沉淀，并振荡使细菌再次悬浮，再次按上述条件离心，合并两次上清液。测定细菌沉淀、上清液、空白组离心管的放射性计数c。细菌结合率％＝(c沉淀-c空白组)/(c沉淀-c空白组+c上清液)×100％，结果以平均结合率±标准偏差表示。为探究^99mtcn-cpf2xt与细菌的结合是否具有特异性，选取环丙沙星标准品与制备的环丙沙星黄原酸盐(cpf2xt)配体为竞争药物，进行细菌结合的特异性竞争实验。将环丙沙星与cpf2xt分别配制成10mg/ml的溶液，各取0.8ml该溶液分别加至离心管中，并加入0.1ml约含金黄色葡萄球菌1×10⁸个的pbs溶液(0.025mol/l，ph＝7.4)，37℃恒温孵育1h。之后加入0.1ml^99mtcn-cpf2xt标记液，继续在37℃下恒温孵育1h，之后按上述方法计算体外细菌结合率。结果表明，^99mtcn-cp2xt在加入环丙沙星和cpf2xt竞争抑制之后，其与细菌结合率分别降低了70.68％和86.00％，说明^99mtcn-cp2xt配合物与细菌结合具有特异性。

5.^99mtcn-cpf2xt配合物在炎症小鼠模型中的生物分布实验：

为验证^99mtcn-cpf2xt是否能够区分细菌性炎症与非细菌性炎症，需要分别建立细菌性致炎和非细菌性致炎两种小鼠模型。细菌性致炎小鼠模型的建立：将0.1ml金黄色葡萄球菌(1×10⁹/ml)注射到18～22g的昆明小鼠的左后腿肌肉部位，24h后取感染明显的模型小鼠进行生物分布实验。非细菌性炎症小鼠模型的建立：将0.1ml松节油注射到18～22g的昆明小鼠的左后腿肌肉部位，定期观察小鼠炎症生长情况，取致炎明显的模型小鼠进行生物分布实验。对上述两种模型小鼠分别经尾静脉注射0.1ml(约7.4×10⁵bq)配合物，于注射后0.5h、2h、4h断颈处死。取不同脏器、脓肿肌肉和对侧大腿肌肉称重，并在fm-2000型锝分析仪上测其放射性计数，每个时相的小白鼠数为5只。计算各组织的每克百分注射剂量(％id/g)。结果见表3。

表3^99mtcn-cpf2xt配合物在不同炎症小鼠模型中的生物分布(n＝5,％id/g)

由以上结果可知，^99mtcn-cpf2xt在炎症部位有较高的摄取和良好的滞留，炎症/肌肉、炎症/血比值好，且其在细菌性致炎模型的炎症摄取值更高，表明其可以区分细菌性炎症和非细菌性炎症。

本发明所述的^99mtcn-cpf2xt配合物为亲水性物质，放化纯度高、稳定性良好，制备简便，在细菌性炎症部位有较高的摄取与良好的滞留，炎症/肌肉、炎症/血比值好，可以区分细菌性炎症和非细菌性炎症，可作为新型细菌性炎症显像剂推广应用，达到了发明目的。

具体实施方式：

下面通过实施例详述本发明：一种^99mtcn-cpf2xt配合物，其结构式如下：

a.配体cpf2xt的合成

称取环丙沙星2.00g(6.00mmol)，溶解于100ml无水甲醇，缓慢加入1.72g(8.90mmol)对甲苯磺酸，搅拌至混合均匀并充分溶解。80℃下油浴加热，搅拌回流反应12h，冷却至室温。缓慢加入nahco3溶液，用ch2cl2萃取(100ml×3)，合并有机相并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸，得白色固体，化合物i；

称取化合物i1.00g(2.88mmol)，k2co31.20g(8.64mmol)与溴乙醇0.72g(5.76mmol)，加入50ml乙腈作溶剂，80℃油浴加热，搅拌回流反应12h；向反应体系加入适量去离子水溶解，用ch2cl2萃取(100ml×3)，合并有机相并用无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸。用ch2cl2：ch3oh＝9：1(v/v)进行柱层析纯化，得化合物ii；

称取化合物ii1.00g(2.60mmol)，lioh·h2o0.53g(12.80mmol)溶于40ml甲醇和10ml去离子水中，室温下搅拌反应8h；旋蒸除去甲醇，并在剩余溶液中加入适量去离子水；缓慢滴加醋酸溶液，调节ph＝5～6；用ch2cl2萃取(100ml×3)，合并有机相并用无水硫酸镁干燥，抽滤，旋蒸。用ch2cl2：ch3oh＝9：1(v/v)进行柱层析纯化，得化合物iii；

取化合物iii0.50g(1.33mmol)，加入koh0.15g(2.66mmol)溶液，100℃条件下反应1h，冰水浴冷却至5℃以下，滴加约0.5ml二硫化碳(cs2)，搅拌反应2h后，常温搅拌反应过夜；旋蒸除去多余cs2，冷冻干燥。用甲醇/无水乙醚重结晶，将产物放置于真空干燥箱干燥，得到化合物cpf2xt0.21g。

¹h-nmr(d2o,δ):8.41(s,1h),7.81(d,j＝13.5hz,1h),7.55(d,j＝7.4hz,1h),3.73(t,j＝6.1hz,2h),3.57(s,1h),3.25(s,4h),2.73(s,4h),2.61(t,j＝6.1hz,2h),1.32–1.22(m,2h),1.06(s,2h).

¹³c-nmr(d2o,δ):207.16,175.40,172.63,154.53,152.08,146.71,144.01,138.61,122.27,117.06,111.51,111.29,106.76,58.89,58.17,52.22,49.47,48.91,34.77,7.42

质谱ms(es^-)：m/z＝527.4

b.^99mtcn-cpf2xt的制备

取一支含有丁二酰二酰肼(sdh)、1,2-丙二胺四乙酸、sncl2·2h2o的sdh冻干药盒，将37～370mbq的^99mtco4^-淋洗液0.5-1ml加入其中，充分摇匀，室温下反应20分钟得到[^99mtcn]²⁺中间体溶液；将5mgcpf2xt配体加入到上述中间体溶液中，在室温下反应30分钟，即得到所述的^99mtcn-cpf2xt配合物。

上述所述^99mtcn-cpf2xt配合物作为细菌性炎症显像剂在核医学领域的应用。