基于多重PCR的二代测序建库技术的制作方法

文档序号:12110485阅读:来源:国知局

技术特征:

1.二代测序文库的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:

步骤1,将样本DNA进行片段化处理,随后每个片段两端加上特殊的接头;

步骤2,加入第一轮扩增的上游引物混合池,与特殊接头互补的通用引物配制成PCR总体系,进行第一轮扩增;

步骤3,将第一轮PCR产物纯化后,加入第二轮扩增的下游引物混合池,与第二步中使用过的特殊接头互补的通用引物配制成PCR总体系,进行第二轮扩增;

步骤4,将第二轮PCR产物纯化后,配制反应总体系,进行Q-PCR定量,稀释到合适的浓度,即可用于二代测序。

2.根据权利要求1所述的二代测序文库的构建方法,其特征在于,所述步骤2中的PCR总体系具体为:2倍PCR Mix 35uL,10umol/L P7 1uL,1umol/L OP 1uL,DNA 25uL。

3.根据权利要求1所述的二代测序文库的构建方法,其特征在于,所述步骤2中的PCR总体系具体为:2倍PCR Mix 35uL,10umol/L P7 1uL,0.5umol/L OP 2uL,DNA 25uL。

4.根据权利要求1所述的二代测序文库的构建方法,其特征在于,所述步骤3中的PCR总体系具体为:2倍PCR Mix 15uL,10umol/L P7 1uL,1umol/L OP 1uL,DNA 5uL,NFW 5uL。

5.根据权利要求1所述的二代测序文库的构建方法,其特征在于,所述步骤3中的PCR总体系具体为:2倍PCR Mix 15uL,10umol/L P7 1uL,0.5umol/L OP 2uL,DNA 5uL,NFW 5uL。

6.根据权利要求1所述的二代测序文库的构建方法,其特征在于,所述步骤4中的PCR总体系10uL具体为:VAHTS SYBR qPCR Master Mix 5uL,qPCR Primer Mix 1uL,DNA 2uL,ROX Reference Dye 2 0.2uL,NFW 5uL。

7.根据权利要求1所述的二代测序文库的构建方法,其特征在于,所述的第一轮PCR扩增循环数目为10-14。

8.根据权利要求1所述的二代测序文库的构建方法,其特征在于,所述的第二轮PCR扩增循环数目为10-14。

9.根据权利要求2或3所述的二代测序文库的构建方法,其特征在于,所述的步骤2中,第一轮特异性引物是普通的PCR扩增引物,共20个左右的碱基,Tm值设定在60℃,序列根据目标区域设计得到,多个引物混成一个OP引物池做为第一轮PCR的上游引物。

10.根据权利要求4或5所述的二代测序文库的构建方法,其特征在于,所述的步骤3中,第二轮特异性引物是普通的PCR扩增引物,在其5’端加上测序接头

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGC TCTTCCGATCT-3’共80个左右的碱基,其中根据目标区域设计得到的序列长度是20个碱基左右,Tm值设定在60℃,多个引物混成一个IP引物池做为第二轮PCR的上游引物;P7的序列:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 3’。

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