技术领域
本发明涉及微生物组合产纤维素酶的方法，具体涉及一种黑曲霉菌丝包裹粪碱纤维单胞菌提高纤维素酶酶活的方法。
背景技术：
纤维素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成。
黑曲霉是一种食品安全菌，产生的纤维素酶具有广阔的应用领域，比如污水处理、垃圾利用、食品等。由于黑曲霉产生的纤维素酶的外切酶酶活低，大大降低了其降解不溶状态纤维素的能力。要提升黑曲霉纤维素酶的降解能力，就需要大幅度提高其外切酶的活性，或者把非可溶的纤维素，变为可溶的纤维素。
粪碱纤维单胞菌具有外切纤维素的能力，如果能共同培养黑曲霉和粪碱纤维单胞菌，这样就能相对提高外切酶的活性，从而提高纤维素酶的催化活性。粪碱纤维单胞菌细胞为非菌丝态，把其细胞从发酵液中取出需要离心或微过滤等高耗费成本的工艺。如果黑曲霉能包裹粪碱纤维单胞菌，这样通过简单的过滤就能除去发酵液中的细胞。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种黑曲霉菌丝包裹粪碱纤维单胞菌提高纤维素酶酶活的方法以及通过该方法得到的黑曲霉菌丝包裹粪碱纤维单胞菌。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种黑曲霉菌丝包裹粪碱纤维单胞菌提高纤维素酶酶活的方法，包括如下步骤：
（1）往洗净、烘干的稻谷壳上均匀喷雾粪碱纤维单胞菌菌液后进行培养，得到粪碱纤维单胞菌固定的内核。
（2）往粪碱纤维单胞菌固定的内核上均匀喷雾黑曲霉孢子液后进行培养，得到黑曲霉孢子与粪碱纤维单胞菌共同吸附在稻谷壳上的固定混合物。
（3）往固定混合物上喷雾培养基后继续培养，得到菌体继续培养的混合物。
（4）菌体继续培养的混合物接入到成菌丝膜培养基中进行培养，使稻谷壳外面形成菌丝薄膜层，得到稻谷壳为固定核心的固定菌体物。所述的成菌丝膜培养基的配方为：胰蛋白胨0.1g，酵母提取物0.1g，氯化钠10g，PDA液体培养基100mL，水900mL。
上述得到的稻谷壳为固定核心的固定菌体物即为黑曲霉菌丝包裹粪碱纤维单胞菌，将其进行培养，所产生的纤维素酶组成更为合理，使纤维素酶酶活得到了提高；而且黑曲霉包裹粪碱纤维单胞菌经简单的帆布或纱布过滤后就能重复利用。
步骤（1）中所述的粪碱纤维单胞菌菌液的浓度优选为（0.8-2）×107 /mL，喷雾量优选为100-300mL/kg；培养的条件优选为20-35℃培养20-30h。
步骤（1）优选为：往洗净、烘干的稻谷壳上均匀喷雾浓度为（0.8-2）×107/mL的粪碱纤维单胞菌菌液，喷雾量为100-300mL/kg；然后再均匀喷雾培养基，喷雾量为10-100mL/kg，20-35℃培养20-30h，得到粪碱纤维单胞菌固定的内核。更优选的，步骤（1）为：往洗净、烘干的稻谷壳上均匀喷雾浓度为1×107/mL的粪碱纤维单胞菌菌液，喷雾量为200mL/kg；然后再均匀喷雾培养基，喷雾量为100mL/kg，30℃培养24h，得到粪碱纤维单胞菌固定的内核。
步骤（2）中所述的黑曲霉孢子液的浓度优选为（0.8-2）×107/mL，喷雾量优选为100-300mL/kg；培养的条件优选为20-35℃培养8-12h。
步骤（2）优选为：往粪碱纤维单胞菌固定的内核上均匀喷雾浓度为（0.8-2）×107/mL的黑曲霉孢子液，喷雾量为100-300mL/kg；然后再均匀喷雾培养基，喷雾量为10-50mL/kg，20-35℃培养8-12h，得到黑曲霉孢子与粪碱纤维单胞菌共同吸附在稻谷壳上的固定混合物。更优选的，步骤（2）为：往粪碱纤维单胞菌固定的内核上均匀喷雾浓度为1×107/mL的黑曲霉孢子液，喷雾量为200mL/kg；然后再均匀喷雾PDA液体培养基，喷雾量为40mL/kg，室温下培养8h，得到黑曲霉孢子与粪碱纤维单胞菌共同吸附在稻谷壳上的固定混合物。
步骤（3）中所述的培养基优选为PDA液体培养基。
步骤（3）中喷雾培养基的总量优选为40-80mL/kg，培养的条件优选为20-35℃培养2-3d。
步骤（3）优选为：室温下，先往固定混合物上喷一次PDA液体培养基，培养12h后再喷一次PDA液体培养基，培养12h；翻面喷一次PDA液体培养基，培养12h后再喷一次PDA液体培养基，培养12h。每次喷雾量均为10mL/kg。
步骤（4）中菌体继续培养的混合物接入到成菌丝膜培养基中的接入量优选为5-20g/1000mL；培养的条件优选为100-200r/m、20-35℃培养1-2d。
步骤（4）优选为：菌体继续培养的混合物以10g/1000mL的接入量接入到成菌丝膜培养基中，140r/m、25℃培养36h。
一种黑曲霉菌丝包裹粪碱纤维单胞菌，通过上述方法得到。
本发明具有如下优点和有益效果：将本发明的黑曲霉菌丝包裹粪碱纤维单胞菌进行培养，所产生的纤维素酶组成更为合理，提高了纤维素酶酶活。黑曲霉菌丝包裹粪碱纤维单胞菌回收方便，可重复利用，生产成本低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、菌种和材料
菌种：粪碱纤维单胞菌（Cellulomonas fimi）ATCC 484；黑曲霉（Aspergillus niger）ATCC 6275。
麸皮：市购；稻谷壳：市购。
2、方法
（1）粪碱纤维单胞菌固定内核的制备
稻谷壳预处理：稻谷壳用自来水冲洗干净，然后在烘箱中70℃烘24h，冷却到室温。
粪碱纤维单胞菌的培养：粪碱纤维单胞菌接种到LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，自来水1L，在115℃灭菌20min）中，接种量为2接种环/100mL，30℃培养24h，得到粪碱纤维单胞菌扩培液。用LB培养基稀释扩培液使菌体浓度为1×107细胞/mL，用于接种稻壳。
稻壳接种粪碱纤维单胞菌：在超净工作台中将稻谷壳放在一张灭菌的纱布上，用灭菌的培养皿压平稻谷壳，尽可能使稻谷壳铺为一层。1×107细胞/mL的粪碱纤维单胞菌菌液用喷雾器喷雾到稻谷壳上表面；然后用灭菌的平铲翻转稻谷壳，使其另外一面向上，再喷雾1×107细胞/mL的粪碱纤维单胞菌菌液得到接种的稻壳，每面的喷雾量为100mL/kg稻谷壳。
往接种的稻壳上喷雾LB培养基，每面喷雾LB培养基50mL/kg，然后装入500mL三角瓶内，放在培养箱30℃培养24h得到粪碱纤维单胞菌固定的内核。
（2）黑曲霉孢子的制备
将保存的黑曲霉斜面孢子接种到PDA平板上，30℃培养5d，用接种环刮去孢子，用灭菌的滤纸收集孢子，得到黑曲霉孢子。
（3）黑曲霉孢子喷雾粪碱纤维单胞菌固定内核
黑曲霉孢子加入到PDA液体培养基中，用血球计数板计数，调节孢子的浓度大约为1×107/mL，得到孢子液。用喷雾器喷雾孢子液到粪碱纤维单胞菌固定内核上。粪碱纤维单胞菌固定的内核铺到灭菌的纱布上，用灭菌的锅铲压粪碱纤维单胞菌固定内核，让粪碱纤维单胞菌固定内核形成一层薄层，然后喷雾孢子液，喷雾均匀，按照100mL/kg粪碱纤维单胞菌固定内核的量喷雾。用灭菌的铁铲把粪碱纤维单胞菌固定内核铲起，让没有喷雾孢子液的面向上，用灭菌的铲子平铺均匀，喷雾孢子液，喷雾均匀，喷雾量为100mL/kg粪碱纤维单胞菌固定内核。
黑曲霉孢子液喷雾完成后，再继续喷雾PDA液体培养基，每面喷雾PDA液体培养基20 mL/kg粪碱纤维单胞菌固定内核，在室温下培养8h，得到黑曲霉孢子与粪碱纤维单胞菌共同吸附在稻谷壳上的固定混合物。
（4）黑曲霉孢子丝包裹层面成形
黑曲霉孢子与粪碱纤维单胞菌共同吸附在稻谷壳上的固定混合物继续在室温下培养1d，培养期间每间隔12h喷雾一次PDA液体培养基，每次喷雾量为10mL/kg。然后在继续培养的第2d，用灭菌的锅铲铲起黑曲霉孢子与粪碱纤维单胞菌共同吸附在稻谷壳上的固定混合物，反铺在灭菌纱布上，在室温下培养1d，培养期间每间隔12h喷雾一次PDA液体培养基，得到菌体继续培养的混合物。整个过程具体为：先往固定混合物上喷一次PDA液体培养基，培养12h后再喷一次PDA液体培养基，培养12h；翻面喷一次PDA液体培养基，培养12h后再喷一次PDA液体培养基，培养12h。一共培养48h，喷4次PDA液体培养基，每面喷两次，每次喷雾量为10mL/kg。
菌体继续培养的混合物接入到成菌丝膜培养基中，菌体继续培养的混合物接入量为10g/1000mL。250mL接入混合物的成菌丝膜培养基装在500mL烧杯中，用磁力搅拌器以140r/m的速度搅拌，在25℃培养36h，这时候稻谷壳外面已经形成菌丝薄膜层，即得到稻谷壳为固定核心的固定菌体物。其中，成菌丝膜培养基的配方为：胰蛋白胨0.1g，酵母提取物0.1g，氯化钠10g，PDA液体培养基100mL，灭菌的自来水900mL。
（5）产纤维素酶连续发酵
产纤维素酶培养基的配制：胰蛋白胨0.01g，酵母提取物0.01g，PDA液体培养基100mL，麸皮浸提液900mL。其中，麸皮浸提液的制备为：100g麸皮加入到5L自来水中，混合均匀，在121℃灭菌15 min后，三层纱布过滤，得到麸皮浸提液。
往500mL三角瓶装入280mL产纤维素酶培养基，接入10g稻谷壳为固定核心的固定菌体物，100r/m、30℃培养48h，得到第一批次发酵的料液。
过滤第一批次发酵的料液后，加滤液同体积的产纤维素酶培养基，100r/m、30℃培养48h，得到第二批次发酵的料液。
过滤第二批次发酵的料液，加滤液同体积的产纤维素酶培养基，100r/m、30℃培养48h，得到第三批次发酵的料液。按照相同操作，重复发酵5批次。
每次发酵的料液用滤纸过滤，过滤得到的滤液测定纤维素酶活。酶活测定方法为按照文献（梁新红. 产纤维素酶菌株产酶条件的研究. 《江苏调味副食品》, 2003(4):10-13.）的方法测定第一批次到第五批次滤液的纤维素酶活为：0.52U/mL，0.53U/mL，0.53U/mL，0.50U/mL，0.40U/mL。
对比试验1
（1）稻谷壳的预处理，同实施例1。
（2）黑曲霉孢子的制备，同实施例1。
（3）黑曲霉孢子喷雾稻谷壳形成固定的内核
黑曲霉孢子加入到PDA液体培养基中，用血球计数板计数，调节孢子的浓度大约为1×107/mL，得到孢子液。用喷雾器喷雾孢子液到稻谷壳上，得到喷雾孢子液稻谷壳。稻谷壳铺到灭菌的纱布上，用灭菌的锅铲压稻谷壳，让稻谷壳形成一层薄层，然后喷雾孢子液，喷雾均匀，按照100mL/kg稻谷壳的量喷雾。用灭菌的铁铲把稻谷壳铲起，让没有喷雾孢子液的面向上，用灭菌的铲子平铺均匀，喷雾孢子液，喷雾均匀，喷雾量为100mL/kg稻谷壳。
黑曲霉孢子液喷雾完成后，再继续喷雾PDA液体培养基，每面喷雾PDA液体培养基20 mL/kg稻谷壳，在室温下培养8h，得到黑曲霉孢子吸附在稻谷壳上的固定混合物。
（4）黑曲霉孢子丝包裹层面成形，同实施例1，得到稻谷壳为固定核心的固定菌体物。与实施例1相比，该固定菌体物中没有粪碱纤维单胞菌。
（5）产纤维素酶连续发酵，同实施例1。测定第一批次到第五批次滤液的纤维素酶活为：0.38U/mL，0.43U/mL，0.43U/mL，0.40U/mL，0.35U/mL。
对比试验2
用直径为0.5cm塑料圆粒代替稻谷壳，其于操作同实施例1，测定第一批次到第五批次滤液的纤维素酶活为：0.33U/mL，0.33U/mL，0.35U/mL，0.30U/mL，0.28U/mL。
对比试验3
成菌丝膜培养基的配方改为：葡萄糖15g，酵母提取物0.15g，氯化钠10g，PDA液体培养基100mL，灭菌的自来水900mL。其于操作同实施例1，测定第一批次到第五批次滤液的纤维素酶活为：0.38U/mL，0.39U/mL，0.45U/mL，0.40U/mL，0.35U/mL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。