提高比活的α‑淀粉酶BaAmy突变体及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体涉及提高比活的α-淀粉酶BaAmy突变体及其编码基因和应用。
背景技术：
：α-淀粉酶能够能跨越不能切分支点的α-1,6键从淀粉分子内部随机地切开α-1,4糖苷键。α-淀粉酶作为一种重要的水解酶广泛的应用于食品加工、酒精酿造、制药、纺织退浆、造纸、洗涤液及饲料等多种领域。目前工业上广泛使用的商品化α-淀粉酶和糖化酶的最适pH值约为6.5和4.5，因此在液化和糖化过程中期间需要加入酸碱来调节pH。在液化和糖化过程中大量加入酸碱不仅使加工工艺复杂化，而且增加了生产成本。如果能够开发出在酸性条件下稳定的α-淀粉酶，则在液化和糖化过程中不需要额外添加酸碱进行pH调节，不仅可以减少试剂消耗，简化加工工艺，而且可以降低生产成本，节约粮食。对淀粉加工领域具有重大意义。酸居芽胞杆菌α-淀粉酶简称BaAmy，虽然具有很好的酸稳定性，但是其比活低，生产成本高，限制了其工业化应用。因此，提高BaAmy的比酶活，降低其生产成本，是BaAmy工业化应用急需解决的问题。技术实现要素：本发明的目的是通过对来源于酸居芽胞杆菌(Bacillusacidicola)的酸性α-淀粉酶BaAmy进行分子改造，使改造后的酸性α-淀粉酶具有更高的比活，降低生产成本，为酸居芽胞杆菌酸性α-淀粉酶的工业化应用奠定基础。本发明的目的是提供提高比活的α-淀粉酶BaAmy突变体的编码基因。酸居芽胞杆菌(Bacillusacidicola)的酸性α-淀粉酶BaAmy的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.8所示。本发明采用定点饱和突变的方法对SEQIDNO.8所示的α-淀粉酶BaAmy的第37位、第85位、第191位、第279位、第291位、第319位和第333位进行分子改造，经过高通量筛选得到一系列提高比活的α-淀粉酶突变体。这些突变体的核苷酸序列如SEQIDNO.2到SEQIDNO.7所示，氨基酸序列如SEQIDNO.9到SEQIDNO.14所示。本发明通过蛋白理性改造和高通量筛选技术对酸居芽胞杆菌(Bacillusacidicola)的酸性α-淀粉酶BaAmy进行分子改造。相对于原始α-淀粉酶的比活，突变后α-淀粉酶比活的提高幅度为45％-110％，为酸居芽胞杆菌酸性α-淀粉酶的工业化应用奠定基础。附图说明图1原始α-淀粉酶和突变体BaAmy-1至BaAmy-6的最适反应pH图2原始α-淀粉酶和突变体BaAmy-1至BaAmy-6的pH稳定性图3原始α-淀粉酶和突变体BaAmy-1至BaAmy-6的最适反应温度图4原始α-淀粉酶和突变体BaAmy-1至BaAmy-6的热稳定性具体实施方式以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实验材料和试剂：1、菌株与载体酸居芽胞杆菌(Bacillusacidicola)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为21144、大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzαA，Zeocin购自Invitrogen公司。2、酶与试剂盒Q5高保真Taq酶MIX购自NEB公司，质粒提取，胶纯化，限制性内切酶、试剂盒购自上海生工公司。3、培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LBZ为LB培养基加25ug/mLZeocin。酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDZ(YPD+100mg/Lzeocin)。酵母诱导培养基BMGY(I％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。实施例1、酸居芽胞杆菌(Bacillusacidicola)的酸性α-淀粉酶的克隆将酸居芽胞杆菌接入LB培养基，培养24小时后，提取其基因组DNA。根据已报道酸居芽胞杆菌α-淀粉酶的序列(Genebank:JN680873)设计两条引物(R：5'-ATGAATTCAACGGCACCATGATGCAGTAT-3'和F：5'-GCTCTAGACTAAACCGAACCACCATTGACTTTG-3')用于扩增酸居芽胞杆菌α-淀粉酶基因。将扩增的PCR产物纯化回收，连接到表达载体pPICzαA，得到表达载体pPICzαA-BaAmy。实施例2、定点突变以上述pPICzαA-BaAmy为模板，用相应的引物进行PCR扩增，具体地扩增反应体系如下：Q5高保真Taq酶MIX23uL对应突变体引物1uL对应突变体引物1uLpPICzαA-BaAmy(20ng)2uL加水至50uL反应程序如下：琼脂糖电泳检测PCR扩增结果，纯化回收PCR产物。用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物才用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确的转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体。将测序正确的突变体，用SacI线性化，转入毕赤酵母X33。实施例3、高通量筛选高比活突变菌株将实施例2中的酵母重组转化子用牙签逐个挑至24孔板，每个孔中加入1mL含有BMGY培养基，30℃，220rpm培养24h左右，离心去上清。再分别加入1.6mLBMMY培养基进行诱导培养。培养24h后，离心取上清，将上述上清液分别取出200μL至96孔板，进行α-淀粉酶酶活测定。α-淀粉酶酶活检测参照中华人民共和国国家标准《GB/T24401-2009》进行测定。实施例4、组合突变将实施例2中酶比活提高的单突变位点T37N，T37L，T37P，T37W，T37K，T85R，T85G，T85Q，T85E，T85A，N191F，N191L，N191P，N191V，N191I，S241F，S241A，S241T，S241V，S241N，N279D，N279V，N279P，N279Q，N279F，S291N，S291K，S291I，S291W，S291R，T319H，T319C，T319G，T319E，T319Y，V333G，V333P，V333N，V333A，V333D，分别进行组合，实验过程同实施例2相同。通过实验最终得到6个组合突变分别命名为BaAmy-1、BaAmy-2、BaAmy-3、BaAmy-4、BaAmy-5、BaAmy-6其中BaAmy-1包含的突变位点为：T37L，T85G，N191P，S241A，N279D，S291N，T319H，V333G。其中BaAmy-2包含的突变位点为：T37N，T85A，N191F，S241F，N279D，S291N，T319H，V333G。其中BaAmy-3包含的突变位点为：T37P，T85R，N191L，S241V，N279V，S291K，T319C，V333P。其中BaAmy-4包含的突变位点为：T37W，T85Q，N191V，S241T，N279P，S291K，T319E，V333A。其中BaAmy-5包含的突变位点为：T37K，T85E，N191I，S241N，N279V，S291W，T319Y，V333P。其中BaAmy-6包含的突变位点为：T37W，T85Q，N191V，S241N，N279H，S291K，T319Y，V333G。实施例5、原始α-淀粉酶BaAmy及α-淀粉酶突变体的比活分析分别将原始α-淀粉酶BaAmy和突变体α-淀粉酶进行纯化，纯化方法为镍柱纯化。将纯化好的α-淀粉酶和突变体α-淀粉酶分别测定相应的酶活并计算出比活。以突变体比活除以原始α-淀粉酶比活，来计算突变体比活的提高幅度。相比原始BaAmy，突变后的BaAmy比活提高幅度为45％-110％(具体结果见表1)。表1原始α-淀粉酶和突变体α-淀粉酶相对比活编号相对比活(％)原始α-淀粉酶100BaAmy-1145BaAmy-2150BaAmy-3180BaAmy-4175BaAmy-5210BaAmy-6195实施例6、原始α-淀粉酶BaAmy及α-淀粉酶突变体BaAmy-1至BaAmy-6最适反应pH及pH稳定性参照国标方法测定原始α-淀粉酶BaAmy及α-淀粉酶突变体BaAmy-1至BaAmy-6的最适反应pH。BaAmy及BaAmy-1至BaAmy-6的最适反应pH如图1所示。由图1可知，突变体BaAmy-1至BaAmy-6的最适pH并没有发生太大变化，最适反应pH值均为4.5，几乎和BaAmy一样。将BaAmy及α-淀粉酶突变体BaAmy-1至BaAmy-6分别在pH4-8条件下室温处理2小时，然后参照国标的方法测定酶活。BaAmy及α-淀粉酶突变体BaAmy-1至BaAmy-6的pH稳定性如图2所示。相比BaAmy，突变体BaAmy-1和BaAmy-5具有更好的耐酸性，在pH4条件下，剩余酶活分别为95％和96％。而突变体BaAmy-2、BaAmy-3、BaAmy-4和BaAmy-6的pH稳定性与BaAmy一致。实施例7、原始α-淀粉酶BaAmy及α-淀粉酶突变体BaAmy-1至BaAmy-6最适反应温度及热稳定性参照国标方法测定BaAmy及突变体BaAmy-1至BaAmy-6的最适反应温度。BaAmy及突变体BaAmy-1至BaAmy-6的最适反应温度如图3所示。由图3可知，BaAmy及突变体BaAmy-1至BaAmy-6的最适反应温度均为60℃。将BaAmy及突变体BaAmy-1至BaAmy-6分别在50℃-90℃条件下水浴处理30分钟，然后参照国标的方法测定酶活。BaAmy及突变体BaAmy-1至BaAmy-6的热稳定性如图4所示。由图4可知，突变体BaAmy-2和BaAmy-6热稳定性要好于BaAmy。在90℃条件下水浴处理30分钟后，突变体BaAmy-2和BaAmy-6的剩余酶活分别为85％和80％，而BaAmy的剩余酶活为50％。突变体BaAmy-1、BaAmy-3、BaAmy-4和BaAmy-5的热稳定性与BaAmy一致。<110>广东溢多利生物科技股份有限公司<120>提高比活的α-淀粉酶BaAmy突变体及其编码基因和应用<160>14<210>1<211>1446<212>DNA<213>酸居芽胞杆菌<400>1ccgtttaacggcaccatgatgcagtattttgaatggtacttgccggatgatggcacgtta60tggaccaaagtggccaatgaagccaacaacttatccagccttggcatcaccgctctttgg120ctgccgcccgcttataaaggaacaagccgcagcgacgtagggtacggagtatacgacttg180tatgacctcggcgaattcaatcaaaaagggaccgtccgcacaaaatacggaacaaaagct240caatatcttcaaaccattcaagccgcccacgccgctggaatgcaagtgtacgccgatgtc300gtgttcgaccataaaggcggcgccgacggcacggaatgggtggacgccgtcgaagtcaat360ccgtccgaccgcaaccaagaaatctcgggcacctatcaaatccaagcatggacgaaattt420gattttcccgggcggggcaacacctactccagctttaagtggcgctggtaccattttgac480ggcgttgattgggacgaaagccgaaaattgagccgcatttacaaattccgcggcatcggc540aaagcgtgggattgggaagtagacacggaaaacggaaactacgactacttaatgtatgcc600gaccttgatatggatcatcccgaagtcgtgaccgagctgaaaaactgggggaaatggtat660gtcaacacaacgaacattgatgggttccggcttgatgccgtcaagcatattaagttcagt720tcttt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