本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种高活性自分泌运动因子(autotaxin,ATX)的高水平表达方法。
背景技术：
：自分泌运动因子ATX是一种最初自黑素瘤细胞上清液中作为自分泌运动性刺激因子而分离获得的分泌型糖蛋白(StrackeML,KrutzschHC,UnsworthEJ,etal.Identification,purification,andpartialsequenceanalysisofautotaxin,anovelmotility-stimulatingprotein.JBiolChem,1992,267(4):2524-2529)。ATX属于外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员(ectonucleotidepyrophos-phatases,ENPPs)，因此又称为ENPP2，具有磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)活性，同时又是ENPPs家族中唯一具有溶血磷脂酶D(lysophospholipaseD,lysoPLD)活性的成员。ATX独特的lysoPLD活性是其发挥重要生物学功能的基础，它可以将溶血磷脂胆(lysophosphatidyl-choline,LPC)水解成溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid,LPA)。而LPA作为细胞内外信号转导最重要的核心脂质信号分子，通过结合特异性G蛋白偶联受体影响细胞增殖、分化、迁移和凋亡，参与多种生理和病理过程，特别是与肿瘤的生存、转移和侵入关系密切。因此ATX作为LPA生成最主要的磷脂酶，成为介导靶向抑制LPA生物合成从而防治肿瘤疾病的重要靶点。ATX基因位于人类8号染色体长臂，包含27个外显子，经选择性剪切产生α(915aa)、β(863aa)、γ(888aa)、δ(859aa)、ε(911aa)五种不同蛋白亚型(GigantiA,RodriguezM,FouldB,etal.Murineandhumanautotaxinalpha,beta,andgammaisoforms:geneorganization,tissuedistribution,andbiochemicalcharacterization.JBiolChem,2008,283(12):7776-7789；HashimotoT,OkudairaS,IgarashiK,etal.Identificationandbiochemicalcharacterizationofanovelautotaxinisoform,ATXδ,withafour-aminoaciddeletion.JBiochem,2012,151(1):89-97；TokuharaY,KuranoM,ShimamotoS,etal.ANewEnzymeImmunoassayfortheQuantitativeDeterminationofClassicalAutotaxins(ATXα,ATXβ,andATXγ)andNovelAutotaxins(ATXδandATXε),PLoSOne，2015,10(6):e0130074)。其中ATXβ最初是从畸形癌细胞系克隆获得，含有863个氨基酸，是最短也是最主要的ATX亚型。ATX分子量约为125kDa，具有一个N-端疏水结构域、两个类生长素B结构域、一个催化结构区域和一个核酸酶样结构域。在翻译过程中，ATX首先以蛋白酶原前体形式合成，随后经N端信号肽切除以及弗林蛋白酶(furin)加工，最后通过经典的内质网-高尔基体途径完成糖基化修饰后，以活化糖蛋白形式分泌至细胞外间隙中。ATX在N53、N410、N524三个位点发生的N-糖基化修饰、特别是N524位点的糖基化是ATX活性所必须(JansenS,CallewaertN,DewerteI,etal.Anessentialoligomannosidicglycanchaininthecatalyticdomainofautotaxin,asecretedlysophospholipase-D.JBiolChem,2007,282(15):11084-11091)。LPA受体繁多，信号途径复杂，通过抑制ATX酶活性达到抑制ATX-LPA功能轴信号通路是肿瘤等相关疾病治疗的有效策略。其中基于ATX空间结构解析是其抑制剂筛选最为直接的手段之一。大量制备具有天然蛋白活性和构象的重组ATX蛋白，是其晶体形成和解析的前提。目前大鼠的ATX蛋白晶体结构已于2011年被日本和荷兰、美国科学家所解析(HausmannJ,KamtekarS,ChristodoulouE,etal.Structuralbasisofsubstratediscriminationandintegrinbindingbyautotaxin.NatStructMolBiol,2011,18(2):198-204;DayJE,HallT,PeggLE,etal.CrystallizationandpreliminaryX-raydiffractionanalysisofratautotaxin.ActaCrystallogrSectFStructBiolCrystCommun.2010,66(Pt9):1127-1129)。然而人ATX蛋白晶体解析工作因无法获得大量近似于天然状态的重组蛋白而至今无法完成。关于人ATX蛋白的重组表达研究工作已多有报道，包括大肠杆菌原核重组表达(HagaA,HashimotoK,TanakaN,etal.Scalablepurificationandcharacterizationoftheextracellulardomainofhumanautotaxinfromprokaryoticcells.ProteinExprPurif,2008,59(1):9-17)，杆状病毒表达(GigantiA1,RodriguezM,FouldB,etal.Murineandhumanautotaxinalpha,beta,andgammaisoforms:geneorganization,tissuedistribution,andbiochemicalcharacterization.JBiolChem,2008,283(12):7776-7789.)以及BSC-1、COS-7、HEK293等哺乳动物表达(KawagoeH,StrackeML,NakamuraH,etal.ExpressionandtranscriptionalregulationofthePD-Ialpha/autotaxingeneinneuroblastoma.CancerRes,1997,57(12):2516-21;GigantiA1,RodriguezM,FouldB,etal.Murineandhumanautotaxinalpha,beta,andgammaisoforms:geneorganization,tissuedistribution,andbiochemicalcharacterization.JBiolChem,2008,283(12):7776-7789;HausmannJ,ChristodoulouE,KasiemM,etal.Mammaliancellexpression,purification,crystallizationandmicrocrystaldatacollectionofautotaxin/ENPP2,asecretedmammalianglycoprotein.ActaCrystallogrSectFStructBiolCrystCommun,2010,66(Pt9):1130-1135;SongY,DilgerE,BellJ,etal.Largescalepurificationandcharacterizationofrecombinanthumanautotaxin/lysophospholipaseDfrommammaliancells.BMBRep,2010,43(8):541-546)。但作为分子量较大的分泌型糖蛋白，ATX蛋白的重组表达依然存在糖基化修饰不完全、不均一，部分氨基酸位点易断裂，表达水平低等问题(GigantiA1,RodriguezM,FouldB,etal.Murineandhumanautotaxinalpha,beta,andgammaisoforms:geneorganization,tissuedistribution,andbiochemicalcharacterization.JBiolChem,2008,283(12):7776-7789)，大大限制了ATX蛋白抑制剂的研发。技术实现要素：本发明的目的是克服上述已有技术的不足，提供一种可保持较高活性、高水平表达均一性糖基化修饰重组ATX蛋白的表达方法。本发明方法包括以下步骤：1、构建pInsulator4X-IRES-DHFR质粒构建一种新的哺乳动物表达载体pInsulator4X-IRES-DHFR。该载体以商品化pCAGGS哺乳动物表达载体为基本单元，由CAG启动子(CMVearlyenhancerichkenbetaactinpromoter,由AGpromoter和hCMV-IEehhancer组成)启动，引入内部核糖体进入位点(IRES)连接多克隆酶切位点和二氢叶酸(DHFR)重组核酸来共表达外源基因和DHFR基因，表达元件下游插入CN104293737.A中的绝缘子insulator（4X）重组核酸。绝缘子insulator单元重组核酸序列为SEQIDNO:1；2、构建pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR表达载体从人的畸胎癌细胞中利用Trizol试剂盒提取总RNA，利用逆转录试剂盒以总RNA为模板合成cDNA；以cDNA为模版，特异性引物hATX-For：5’-GTCAGCGGCCGCCACCATGGCAAGGAGGAGCTC-3’（含NotI酶切位点）、hATX-Rev：5’-GGCCCAATTGTTAGTGGTGATGGTGATGGTGATGATGGGCGCTGCCAATCTCGCTCTCATATGTATG-3’（含MunI酶切位点，C端引入8Histag），扩增ATXβ基因。PCR扩增产物和pInsulator4X-IRES-DHFR质粒经NotI和MunI双酶切，T4DNA连接酶连接后转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌，提取重组质粒pinsulator4X-ATXβ-8His-DHFR，NotI和MunI双酶切鉴定，DNA测序。ATXβ重组核酸序列为SEQIDNO:2；3、重组HEK293-(pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR)细胞株的构建和筛选鉴定正确的重组表达质粒pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR经SwaI酶线性化处理后，利用Lippfectin2000TM阳离子转染试剂介导进入HEK293宿主细胞内。转染后无血清不完全DMED培养基更换为含10%胎牛血清（FBS）DMEM完全培养基，获得重组表达细胞株。按照10%～20%接种量接种培养，分别用10nM、50nM、250nM、500nM、1000nM氨甲喋呤(amethopterin,MTX)梯度加压筛选，采用有限稀释法亚克隆获得稳定高表达ATX单克隆细胞株。4、重组ATX蛋白的表达经MTX加压筛选获得的重组HEK293-(pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR)细胞株，采用分批补料培养方式，利用FreeStyle293expressionmedium培养基扩大培养：按照10～15%的细胞接种量接种至2.5L体积转瓶培养；初始培养体积为200ml，第24h补料200ml，第48h补料300ml，第60h补料500ml，总体积至1.2L体积；培养条件为转速140～160rpm，35～37℃，5%CO2；培养过程中监测谷氨酰胺和葡萄糖含量不低于0.5mmol/L和1.2mmol/L，pH保持在7.0～7.4之间。5、重组ATX蛋白纯化及lysoPLD、PDE活性检测收集细胞培养上清，6800rpm、4℃离心20min后经0.22µM滤膜过滤后经30000DaMWCO超滤管超滤浓缩至平衡液（20mMTris、500mM氯化钠、1%Trionton、10mM咪唑，pH7.8），NiSepharoseTMexcel亲和层析纯化。目的蛋白再经超滤浓缩至储存液（20mMTris,150mM氯化钠,15%甘油，pH8.0）后，SDS-PAGE、Westernblot鉴定。分别利用溶血磷脂酸胆碱LysoPC和对硝基苯基磷酸钠底物Bis-pNPP对重组人ATX蛋白的lysoPLD、PDE活性进行检测。所述质粒pInsulator4X-IRES-DHFR是以商品化pCAGGS哺乳动物表达载体为基本单元，由CAG启动子(CMVearlyenhancerichkenbetaactinpromoter,由AGpromoter和hCMV-IEehhancer组成)启动，引入内部核糖体进入位点(IRES)连接多克隆酶切位点和二氢叶酸(DHFR)重组核酸来共表达外源基因和DHFR基因，表达元件下游插入CN104293737.A中的绝缘子insulator（4X）重组核酸。绝缘子insulator单元重组核酸序列为SEQIDNO:1；所述pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR表达载体是通过基因工程手段将ATXβ重组核酸序列亚克隆到pInsulator4X-IRES-DHFR质粒上。ATXβ重组核酸序列为SEQIDNO:2；所述重组HEK293-(pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR)细胞株是以HEK293哺乳动物细胞作为宿主细胞筛选获得。所述的重组HEK293-(pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR)细胞株是经过10nM、50nM、250nM、500nM、1000nM氨甲喋呤(amethopterin,MTX)梯度加压筛选获得；所述的重组ATX蛋白的表达，采用分批补料培养方式，利用FreeStyle293expressionmedium培养基扩大培养：按照10～15%的细胞接种量接种至2.5L体积转瓶培养；初始培养体积为200ml，第24h补料200ml，第48h补料300ml，第60h补料500ml，总体积至1.2L体积；培养条件为转速140～160rpm，35～37℃，5%CO2；培养过程中监测谷氨酰胺和葡萄糖含量不低于0.5mmol/L和1.2mmol/L，pH保持在7.0～7.4之间。所述的重组ATX蛋白的纯化是经30000DaMWCO超滤管超滤浓缩至平衡液（20mMTris、500mM氯化钠、1%Trionton、10mM咪唑，pH7.8）后上样，所用层析柱为NiSepharoseTMexcel亲和层析柱。与现有技术相比，本发明通过构建pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR重组表达载体，利用CAG启动子和双顺反子IRES共表达ATX和DHFR基因，引入绝缘子insulator（4X）避免了基因之间的相互影响，通过MTX阶梯式梯度加压筛选大大增加了ATX的重组表达水平；通过控制重组细胞株的接种量、补料方式、培养温度和转速、谷氨酰胺和葡萄糖含量监测及pH值控制，使重组蛋白获得了较为均一性的糖基化修饰，最终ATX蛋白获得12mg/L的高收率，且保持较高的lysoPLD和PDE活性。附图说明图1为重组人ATX蛋白的真核表达质粒图谱；图2为重组人ATX蛋白的SDS-PAGE分析结果；图中，M为标准蛋白质分子量，1为重组人ATX蛋白纯化样；图3为重组人ATX蛋白的WesterBlot分析结果；图中，M为标准蛋白质分子量，1、2为重组人ATX蛋白纯化样；图4为重组人ATX蛋白lysoPLD活性分析结果；图5为重组人ATX蛋白PDE活性分析结果。具体实施方式、构建pInsulator4X-IRES-DHFR质粒pCAGGS-IRES-DHFR-AscI载体（专利CN104293737.A已构建）经SalⅠ和AscI双酶切后，胶回收酶切产物3469bp；MauBI和BpiI双酶切pinsulator4X（东北师范大学郑耀武教授提供），胶回收酶切产物8445bp。酶切后胶回收上述两目的片段按1：3比例连接反应，构建pInsulator4X-IRES-DHFR质粒，4℃过夜连接，将连接反应液转入感受态DH5a细胞中，37℃过夜培养，挑取单菌落，37℃，180rpm过夜摇菌。收集菌体，提取重组质粒，酶切鉴定。、构建pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR表达载体（1）克隆ATX基因从人的畸胎癌细胞中利用TRIzole试剂盒提取总RNA，1%的琼脂糖凝胶分析RNA的完整性。用逆转录试剂盒以RNA为模板合成cDNA，然后加入hATX-For，hATX-Rev引物，扩增ATXβ基因。PCR反应体系：10µM引物分别各取1.5µl，cDNA模板1µl，PrimeSTARMaxPremix25µl，H2O21µl，总反应体系为50µl。PCR反应条件：94℃预变性2min;94℃变性30s,60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃再延伸10min；1%琼脂糖电泳胶回收2623bp目的片段。引物设计：hATX-For：5’-GTCAGCGGCCGCCACCATGGCAAGGAGGAGCTC-3’（含NotI酶切位点）；hATX-Rev：5’-GGCCCAATTGTTAGTGGTGATGGTGATGGTGATGATGGGCGCTGCCAATCTCGCTCTCATATGTATG-3’（含MunI酶切位点，C端引入8Histag）；PCR扩增产物和pInsulator4X-IRES-DHFR质粒经NotI和MunI双酶切，T4DNA连接酶连接后转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌，提取重组质粒pinsulator4X-ATX-8His-DHFR，NotI和MunI双酶切鉴定，DNA测序。、重组HEK293-(pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR)细胞株的构建和筛选鉴定正确的重组表达质粒pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR经SwaI酶线性化处理：SwaI酶切质粒，25℃酶切8h，然后加入1/10体积的3M的乙酸钠和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃孵育2h，14000rpm低温离心10min。弃上清，加入70%乙醇500µL，14000rpm低温离心1min。重复以上步骤，弃上清，加入10µL无菌水。采用Lippfectin2000TM阳离子转染试剂转染HEK293细胞：常规培养HEK293细胞，至对数生长期时，按照2×105/L接种至6孔板，2ml/L，培养至细胞长成50%～70％单层时弃去培养液，用无血清培养基洗涤细胞2次，将lipofectin脂质体和pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR质粒按照1：1的比例混合，形成DNA-脂质体复合体，室温静止30min后均匀滴入细胞孔中，轻柔摇匀细胞板，37℃培养，5～6h后换新鲜培养液。24h后将细胞分至培养皿中，48h后更换含10%胎牛血清DMEM完全培养基。采用MTX梯度加压和有限稀释法筛选高表达稳定细胞株：获得的细胞集落按照15%的接种量接种培养，先用20nMMTX筛选，7天左右换液，待细胞生长状态好时，再提高MTX浓度进一步筛选。分别经10nM、50nM、250nM、500nM、1000nMMTX梯度加压筛选，采用有限稀释法亚克隆获得稳定高表达ATX单克隆细胞株。、重组ATX蛋白的表达及纯化经MTX加压筛选获得的重组HEK293-(pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR)细胞株，采用分批补料培养方式、利用FreeStyle293expressionmedium培养基扩大培养：按照15%的细胞接种量接种至2.5L体积转瓶培养；初始培养体积为200ml，第24h补料200ml，第48h补料300ml，第60h补料500ml，总培养体积至1.2L体积；培养条件为转速150rpm，37℃，5%CO2培养；培养过程中监测谷氨酰胺和葡萄糖含量不低于0.5mmol/L和1.2mmol/L，pH保持在7.0～7.2之间。细胞培养上清经6800rpm，4℃离心20min后，经0.22µM滤膜过滤后30000DaMWCO超滤管超滤浓缩至平衡液（20mMTris、500mM氯化钠、1%Trionton、10mM咪唑，pH7.8）后利用NiSepharoseTMexcel亲和层析纯化。首先用平衡缓冲液洗至基线，然后用洗脱缓冲液（20mMTris、500mM氯化钠、50mM咪唑，pH7.8）洗脱杂蛋白，最后用洗脱缓冲液（20mMTris、500mM氯化钠、250mM咪唑，pH7.8）洗脱目的蛋白峰。、重组ATX蛋白的鉴定及活性检测重组ATX蛋白纯化样30000DaMWCO超滤管超滤浓缩至储存液（20mMTris,150mMNaCl,15%glycerol，pH7.8），SDS-PAGE、Westernblot鉴定。纯化样品经12%SDS-PAGE电泳分析后，电转仪(Bio-Rad)将蛋白转至PVDF膜上,用封闭液(PBST+5%脱脂奶粉)封闭过夜,PBST洗膜4次，10min/次，加入1:500稀释的抗8Histag鼠多抗作为一抗，4℃过夜，PBST洗膜4次后，加入1:5000稀释的AP标记的羊抗鼠IgG，室温反应2h，用PBST洗膜4次后，最后用BCIP/NBT显色试剂盒避光显色并拍照，结果见图2和图3。利用bradford法测蛋白浓度（以BSA作为标准蛋白），计算重组ATX蛋白的表达水平和产率，结果如表1。表1重组ATX蛋白的表达水平和产率样品蛋白含量（mg/ml）体积（ml）培养规模（L）蛋白收率（mg/L）重组ATX1.410.31.212.0利用溶血磷脂酸胆碱LysoPC为底物检测重组人ATX蛋白的lysoPLD活性：以LysoPC（18:1）为底物，利用释放胆碱的量测定ATX酶活性，50µl的TRIS-HCL(pH8.0)缓冲体系含有150µM的LysoPC（18:1）和不同浓度的ATX蛋白，37℃孵育3h，分别加入5mM的OPD、10µg/ml的HRP和4U/ml的胆碱氧化酶各25µl，加入25µl的2M的H2SO4至酶标板终止反应，酶标仪测定490nm的吸光值。结果见图4。利用化学发光法测定ATX的PDE活性：以对硝基苯基磷酸钠Bis-pNPP为底物，100µlTris-HCl缓冲液中加入1mM的Bis-pNPP和不同浓度的ATX，室温反应30min，酶标仪410nM检测产物的吸光值。结果见图5通过构建pInsulator4x-ATXβ-8His-DHFR表达载体，通过脂质体转染、MTX加压筛选，最后经亚克隆筛选最终获得一株高表达ATX的宿主细胞。采用重组细胞株的接种量、补料方式、培养温度和转速、谷氨酰胺和葡萄糖含量监测及pH值控制，获得12mg/L的高产率，且重组ATX具有良好的纯度和活性。当前第1页1 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