一种检测糖尿病酮酸中毒因子的探针及其合成和使用方法与流程

本发明涉及糖尿病酮症及其他酮体偏高症状的临床检测领域，尤其涉及一种检测糖尿病酮酸中毒因子的探针及其合成和使用方法。

背景技术：

目前，一般医学上都是通过检测总酮体含量来诊断和治疗酮症酸中毒。对于酮体检测的方法目前最常用的是传统的硝普盐法。这种方法的基本原理是在亚硝基铁氰化钠或者氨基铁氰化钠存在下，乙酰乙酸与之络合生成紫红色的化合物。硝普盐法本身它是一种半定量的方法，准确度很有限。另外氨基铁氰化钠只对酮体中的乙酰乙酸有较好的响应，对于酮体的主要成分D-3羟基丁酸几乎没有反应。病情越重的酮症酸中毒患者，其酮体中D-3羟基丁酸的比例越高，乙酰乙酸越少，很容易造成漏诊。同时，恢复期的患者往往因为D-3羟基丁酸大量转化成乙酰乙酸而造成误诊。

国家知识产权局于2010年12月1日公布的一篇专利申请号为201010104920.X，名称：一种糖尿病酮症及其他酮体偏高症状诊断试纸，此专利提出如下技术方案：将滤纸在第一相浸液中浸泡后，取出迅速温热干燥，再放入第二相浸液中浸泡，取出再次干燥并切割成块，即得测定试剂条。该发明的诊断试纸只能半定量检测尿液或血液中的D-3羟基丁酸的含量，该诊断试纸在临床应用的过程中可能会造成了很多的漏诊、误诊等现象。

目前用于临床的测量方法主要有酮体粉和酮体试纸条等，这类方法虽然操作简单且成本低廉，但是在临床应用的过程中造成了很多的漏诊、误诊等现象。因此，探究有效的D-3羟基丁酸直接检测方法非常必要。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种定量检测、灵敏度高的检测糖尿病酮酸中毒因子的探针及其合成和使用方法，本发明通过将2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉(PIPT)与二甲基亚砜(DMSO)混合配制成1mmol/L的溶液，并将溶液用蒸馏水稀释，将稀释后的溶液用来检测血液或尿液中的D-3羟基丁酸的含量。

为了解决上述技术问题,本发明提供了一种用于检测糖尿病酮酸中毒因子的荧光探针，结构式如下：

本发明提供了一种荧光探针的合成方法，具体步骤如下：

(1)每称取0.001～0.003mol的邻菲罗啉二酮加入到盛有10～15mL冰醋酸的容器中，并加热搅拌至邻菲罗啉二酮完全溶解；

(2)称取0.05～0.08mol的乙酸铵加入到步骤(1)所得完全溶解有邻菲罗啉二酮的容器中，并加热搅拌均匀使其完全溶解；

(3)将0.001～0.003mol的2-吡啶甲醛加入到步骤(2)所得完全溶解有邻菲罗啉二酮和乙酸铵的容器中，加热搅拌并回流1h，即得加热液，待加热液冷却至室温时，向加热液中加入40～50mL的水，并用浓氨水调节加热液的pH范围为6～7，抽滤即得棕色沉淀；

(4)将步骤(3)中所得的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗涤3～5次并抽滤烘干，将洗涤后的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重结晶，即得2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉。

进一步地，所述步骤(3)中加热回流温度为120℃。

进一步地，所述步骤(3)中用浓氨水调节加热液的pH为7。

本发明还提供了一种荧光探针应用于检测糖尿病酮酸中毒因子的方法，具体步骤如下：

(1)将2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉加入盛有二甲基亚砜的容器中配置成1～3mmol/L的溶液；将D-3-羟基丁酸配置成多份体积相同但浓度不同的溶液；

(2)量取多份1.95～2.05mL的蒸馏水分别加到多个荧光比色皿中，并向各个荧光比色皿中加入15～25μL步骤(1)中配置的溶液，再将多份D-3-羟基丁酸溶液分别加到各个荧光比色皿中，即得多份反应液；

(3)用荧光分光光度计检测步骤(2)中所配置的多份反应液的荧光强度，并以D-3-羟基丁酸溶液的浓度为横坐标C、荧光强度F为纵坐标绘图，即得反应液的荧光强度F关于D-3-羟基丁酸溶液浓度C的曲线，并求出该曲线的线性回归方程；

(4)用荧光分光光度计测定样品溶液的荧光强度，并将测得的荧光强度带入步骤(3)中所求出的线性回归方程中，即可求出样品中D-3-羟基丁酸溶液的浓度。

进一步地，所述步骤(1)中配置的溶液的浓度为1mmol/L。

进一步地，所述步骤(2)中量取1.98mL的蒸馏水加入荧光比色皿中。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：

(1)本发明中2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉能溶于二甲基亚砜，并且二甲基亚砜能与水混溶，使得D-3-羟基丁酸分子能与2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉分子充分接触，加快整个反应的速度；本发明中将D-3-羟基丁酸溶液加入到PIPT-DMSO溶液中，探针分子对D-D-3-羟基丁酸识别度很高，因此，探针分子识别D-3-羟基丁酸的反应十分迅速，在临床应用的过程中不会出现误诊、漏诊的现象。

(2)本发明中绘制反应液的荧光强度关于D-3-羟基丁酸溶液浓度的工作曲线，并求出曲线的线性回归方程，只要测出样品溶液中的荧光强度并带入线性回归方程即可知道样品溶液中的D-3-羟基丁酸溶液浓度，并判断出人们是否酮症酸中毒。

(3)本发明中的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗涤3次并抽滤烘干，乙醇是介于水和有机溶剂之间的溶剂，用乙醇洗涤是为了除去脂类杂质，用乙醚洗涤棕色沉淀一方面可以除去乙醇，另一方面乙醚易挥发，即可得到纯净的沉淀；本发明中的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重结晶，进一步对2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉进行提纯，本发明中制备的2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉产率高达42.4％。

(4)本发明中对盛有2-吡啶甲醛、邻菲罗啉二酮和乙酸铵的容器进行加热搅拌并回流1h，加热是整个反应的反应条件，并且可以加快整个反应的反应速度加快；回流是为了保证有机溶剂不会挥发。

综上所述，本发明中检测D-3羟基丁酸的方法具有灵敏度高、定量检测且操作简单等优点。

附图说明

以下结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

图1是本发明中探针分子的荧光强度随D-3-羟基丁酸溶液浓度的变化曲线图；

图2是本发明中探针分子的荧光强度随时间的变化曲线图；

图3是本发明中PIPT—D-3-HB的滴定曲线图；

图4是本发明中多种阳离子滴定PIPT的柱状图；

图5是本发明中多种阴离子滴定PIPT的柱状图。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

一种用于检测糖尿病酮酸中毒因子的荧光探针，结构式如下：

一种荧光探针的合成方法，具体步骤如下：

(1)称取0.002mol的邻菲罗啉二酮加入到盛有10mL冰醋酸的容器中，并加热搅拌至邻菲罗啉二酮完全溶解；

(2)称取0.05mol的乙酸铵加入到步骤(1)所得完全溶解有邻菲罗啉二酮的容器中，并加热搅拌均匀使其完全溶解；

(3)将0.002mol的2-吡啶甲醛加入到步骤(2)所得完全溶解有邻菲罗啉二酮和乙酸铵的容器中，加热搅拌并回流1h，且加热回流的温度为120℃，即得加热液，待加热液冷却至室温时，向加热液中加入40mL的水，并用浓氨水调节加热液的pH为7，抽滤即得棕色沉淀；

(4)将步骤(3)中所得的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗涤3次并抽滤烘干，将洗涤后的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重结晶，即得2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉。

一种荧光探针应用于检测糖尿病酮酸中毒因子的方法，具体步骤如下：

(1)将2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉加入盛有二甲基亚砜的容器中配置成1mmol/L的溶液；将D-3-羟基丁酸配置成6份体积相同但浓度不同的溶液；

(2)量取多份1.98mL的蒸馏水分别加到多个荧光比色皿中，并向多个荧光比色皿中分别加入20μL步骤(1)中配置的溶液，再将多份D-3-羟基丁酸溶液分别加到多个荧光比色皿中，即得多份反应液；

(3)用荧光分光光度计检测步骤(2)中所配置的多份反应液的荧光强度，并以D-3-羟基丁酸溶液的浓度C为横坐标、荧光强度F为纵坐标绘图，即得反应液的荧光强度F关于D-3-羟基丁酸溶液浓度C的曲线，并求出该曲线的线性回归方程F＝54.49+46.89C；

(4)用荧光分光光度计测定样品溶液的荧光强度，并将测得的荧光强度带入步骤(3)中所求出的线性回归方程中，即可求出样品中D-3-羟基丁酸溶液的浓度。

实施例2

一种用于检测糖尿病酮酸中毒因子的荧光探针，结构式如下：

一种荧光探针的合成方法，具体步骤如下：

(1)称取0.001mol的邻菲罗啉二酮加入到盛有10mL冰醋酸的容器中，并加热搅拌至邻菲罗啉二酮完全溶解；

(2)称取0.05mol的乙酸铵加入到步骤(1)所得完全溶解有邻菲罗啉二酮的容器中，并加热搅拌均匀使其完全溶解；

(3)将0.001mol的2-吡啶甲醛加入到步骤(2)所得完全溶解有邻菲罗啉二酮和乙酸铵的容器中，加热搅拌并回流1h，并且加热回流温度为120℃，即得加热液，待加热液冷却至室温时，向加热液中加入40mL的水，并用浓氨水调节加热液的pH范围为7，抽滤即得棕色沉淀；

(4)将步骤(3)中所得的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗涤3次并抽滤烘干，将洗涤后的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重结晶，即得2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉。

一种荧光探针应用于检测糖尿病酮酸中毒因子的方法，具体步骤如下：

(1)将2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉加入盛有二甲基亚砜的容器中配置成2mmol/L的溶液；将D-3-羟基丁酸配置成7份体积相同但浓度不同的溶液；

(2)量取多份1.95mL的蒸馏水分别加到多个荧光比色皿中，并向多个荧光比色皿中分别加入15μL步骤(1)中配置的溶液，再将多份D-3-羟基丁酸溶液分别加到多个荧光比色皿中，即得多份反应液；

(3)用荧光分光光度计检测步骤(2)中所配置的多份反应液的荧光强度，并以D-3-羟基丁酸溶液的浓度C为横坐标、荧光强度F为纵坐标绘图，即得反应液的荧光强度F关于D-3-羟基丁酸溶液浓度C的曲线，并求出该曲线的线性回归方程F＝54.49+48.89C；

(4)测定样品溶液的荧光强度，并将测得的荧光强度带入步骤(3)中所求出的线性回归方程中，即可求出样品中D-3-羟基丁酸溶液的浓度。

实施例3

一种用于检测糖尿病酮酸中毒因子的荧光探针，结构式如下：

一种荧光探针的合成方法，具体步骤如下：

(1)称取0.003mol的邻菲罗啉二酮加入到盛有15mL冰醋酸的容器中，并加热搅拌至邻菲罗啉二酮完全溶解；

(2)称取0.08mol的乙酸铵加入到步骤(1)所得完全溶解有邻菲罗啉二酮的容器中，并加热搅拌均匀使其完全溶解；

(3)将0.003mol的2-吡啶甲醛加入到步骤(2)所得完全溶解有邻菲罗啉二酮和乙酸铵的容器中，加热搅拌并回流1h，并且加热回流温度为120℃。即得加热液，待加热液冷却至室温时，向加热液中加入50mL的水，并用浓氨水调节加热液的pH范围为6，抽滤即得棕色沉淀；

(4)将步骤(3)中所得的棕色沉淀用乙醇和乙醚各洗涤3次并抽滤烘干，将洗涤后的棕色沉淀用乙醇和水的混合液重结晶，即得2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉。

一种荧光探针应用于检测糖尿病酮酸中毒因子的方法，具体步骤如下：

(1)将2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉加入盛有二甲基亚砜的容器中配置成3mmol/L的溶液；将D-3-羟基丁酸配置成8份体积相同但浓度不同的溶液；

(2)量取多份2.05mL的蒸馏水分别加到多个荧光比色皿中，并向多个荧光比色皿中分别加入25μL步骤(1)中配置的溶液，再将多份D-3-羟基丁酸溶液分别加到多个荧光比色皿中，即得多份反应液；

(3)用荧光分光光度计检测步骤(2)中所配置的多份反应液的荧光强度，并以D-3-羟基丁酸溶液的浓度C为横坐标、荧光强度F为纵坐标绘图，即得反应液的荧光强度F关于D-3-羟基丁酸溶液浓度C的曲线，并求出该曲线的线性回归方程F＝54.49+47.89C；

(4)测定样品溶液的荧光强度，并将测得的荧光强度带入步骤(3)中所求出的线性回归方程中，即可求出样品中D-3-羟基丁酸溶液的浓度。

将实施例1中合成的荧光探针2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉和二甲基亚砜混合配置成1mmol/L的溶液；将D-3-羟基丁酸配置成10份体积相同、浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5mmol/μL的溶液；量取10份1.98mL的蒸馏水分别加到10个荧光比色皿中，并向10个荧光比色皿中分别加入20μL的PIPT-DMSO溶液，再将10份D-3-羟基丁酸溶液分别加到10个荧光比色皿中，即得10份反应液，用荧光分光光度计检测10份反应液的荧光强度为70.61、95.63、112.10、129.52、141.21、163.72、184.21、198.08、219.21，并以D-3-羟基丁酸溶液的浓度C为横坐标、荧光强度F为纵坐标绘图，即得反应液的荧光强度F关于D-3-羟基丁酸溶液浓度C的曲线，并求出该曲线的线性回归方程F＝54.49+48.89C，如图1所示。

将实施例2中合成的化合物荧光探针2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉与二甲基亚砜混合配置成浓度为3mmol/L的溶液，将D-3-羟基丁酸溶液加入到PIPT-DMSO溶液中，用荧光分光光度计检测荧光强度，荧光强度在30s后趋于不变，如图2所示，本实施例中的探针分子对D-3-羟基丁酸分子的识别度很高，因此，在临床的使用过程中不会出现漏诊或误诊的现象。

将实施例3合成的化合物荧光探针2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉配成浓度为1.0×10^-4mol/L的溶液，将2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉溶液加入盛有1.98mL的水中，并搅拌均匀，然后向溶液中多次滴加浓度为1.0×10^-4mol/L的D-3-羟基丁酸溶液，每次滴加5μL。如图3所示，随着D-3-羟基丁酸的不断加入，418nm处的荧光强度逐渐减弱，而494nm处的荧光强度逐渐增强。当体系中D-3-羟基丁酸的浓度达到2.25×10^-6mol/L以后，体系的荧光强度不再增加。

将实施例1合成的化合物荧光探针2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉配成浓度为1.0×10^-4mol/L的溶液，将D-3-羟基丁酸、阳离子及阴离子均配成浓度为1.0×10^-5mol/L的溶液，将20μL浓度为1.0×10^-4mol/L的2-吡啶-4,5-咪唑并-1,10-邻菲罗啉溶液加入盛有1.98mL的水中，然后一次性滴加D-3-羟基丁酸溶液或阴离子溶液或阳离子溶液。如图4及图5所示，探针分子对D-3-羟基丁酸的灵敏度很高，并且不论是阴离子还是阳离子都不会影响探针分子对D-3-羟基丁酸的检测。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。