一种利用纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成柠檬酸酯的方法与流程

本发明涉及酶催化技术领域，具体涉及一种利用纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成柠檬酸酯的方法。

背景技术：

柠檬酸酯是一类国际公认的绿色环保无毒的增塑剂，广泛应用于食品、医药、保健品、玩具、化妆品等领域，是邻苯二甲酸酯类增塑剂潜在的替代品。

目前，柠檬酸酯的生产方法主要是柠檬酸与相应的醇，以强酸如浓硫酸、对甲苯磺酸等为催化剂，以醇等高极性溶剂为狭水剂，通过控制反应温度和反应时间得到粗品，再通过纯化手段得到纯度较好的产品。上述过程反应条件苛刻，其中大量使用的强酸催化剂易对设备产生严重的腐蚀，且产生的废水处理困难易造成环境污染。

酶法合成柠檬酸酯具有反应条件温和、设备耐用性高、环境友好的特点。现有报道采用市售的固定化脂肪酶Novozym435催化合成柠檬酸三乙酯的方法，该工艺省去了产品中和酸值及提纯脱色步骤，工艺简单，适合工业化生产，但该方法仍存在使用的固定化酶催化活力不高，重复使用次数偏低的问题。上述问题也成为制约酶法合成柠檬酸酯大规模工业化生产的关键。

技术实现要素：

本发明公开了一种利用纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成柠檬酸酯的方法。该固定化方法可显著提高脂肪酶的活力，结构稳定性增强，重复使用次数大幅上升。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种利用纳米复合材料固定化脂肪酶催化合成柠檬酸酯的方法，包括如下步骤：

(1)由羧基化碳纳米管(MWNT-COOHs)与金属有机骨架(MOF)原料复合反应制备纳米复合材料，干燥备用；

(2)利用步骤(1)制得的纳米复合材料固定化脂肪酶；

(3)利用步骤(1)制备得到的固定化脂肪酶催化柠檬酸和伯醇生成柠檬酸酯。

步骤(1)中，所述的金属有机骨架原料包括有机酸配体与过渡金属离子的无机盐；其中，所述的有机酸配体为均苯二甲酸、均苯三甲酸、对苯二甲酸重的任意一种(优选均苯二甲酸或均苯三甲酸)；所述的金属离子的无机盐为铜离子、钴离子、锌离子、锰离子中的任意一种(优选铜离子)的无机盐；所述的无机盐包括硝酸盐、硫酸盐或氯盐；其中，羧基化碳纳米管、有机酸配体与过渡金属离子的无机盐的反应质量比3～4∶1～2∶1～3，优选质量比为4∶1∶2、3∶1∶3、4∶2∶2、3∶2∶3、4∶1∶1中的任意一种比例，最优选4∶1∶2。

步骤(1)中，复合反应的反应溶剂为极性溶剂、乙醇和水的混合溶液，其中，所述的极性溶剂DMF、DMSO或甲醇中的任意一种(优选DMF)；极性溶剂、乙醇和水的体积比为1～2∶1～2∶1～2，优选体积比为1∶1∶1、1∶2∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶2、2∶1∶2、2∶2∶1中的任意一种比例，最优选1∶1∶1。

步骤(1)中，复合反应的反应温度为80-150℃(优选85℃)，反应时间为12-36h(优选24h)；干燥温度为80-120℃(优选90℃)。

步骤(1)制备得到的纳米复合材料为MWNT-COOHs表面修饰MOF。

步骤(2)中，所述的脂肪酶为CALB或P450，当然本发明并不局限于这两种脂肪酶，其他脂肪酶家族的酶也可以使用。

本发明所使用的脂肪酶酶活一般为2000-10000U/g，酶活定义为对于酯类合成的活力用每1克酶单位时间内生成的月桂酸丙酯单位(PLU/g)来表示。

步骤(2)中，固定化采用吸附的方式，具体为将脂肪酶溶于缓冲盐溶液中，添加纳米复合材料后搅拌吸附0.5-3h(优选1h)；脂肪酶与纳米复合材料的质量比为1∶10～20(优选1∶10)。其中，所述的缓冲盐溶液为PBS或PBK。

步骤(3)中，催化反应条件为pH5.5-8，催化温度为30-70℃，催化时间为6-18h，催化缓冲盐溶液采用PBS或PBK；固定化酶与柠檬酸质量比为1∶25～50(优选1∶30)，伯醇过量。

步骤(3)中，伯醇位乙醇、丁醇、辛醇中的任意一种。

步骤(3)中，使用的狭水剂即为选择的伯醇。

有益效果：本发明方法可以显著提高脂肪酶的活力，固定化酶结构稳定性增强，重复使用次数大幅上升。

附图说明

图1为原料MWNT-COOHs的TEM照片；

图2实施例1制备得到的纳米复合材料MWNT-COOHs-MOF的TEM照片。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例的检测方法如下：

柠檬酸酯的测定采用通用的气相色谱检测法。DB-1301(15m*0.53mm*1μm)；柱温采用程序升温：先80℃保持0.5min，然后以20℃/min的速度增加到220℃并保持10min；采用氢火焰离子化检测器(FID)，检测器温度：275℃；进样口温度：225℃；载气：氮气，流速：2.3mL/min；分流比：20∶1；进样量：1.0μL。

固定化酶量测定：总酶量一定的前提下分别测定固定化前后游离酶的总量，相减得到固定化酶量。酶检测方法采用布拉德福德比色法。

实施例1：

5g均苯三甲酸与10gCu(NO₃)₂溶于500ml溶剂(DMF∶乙醇∶水＝1∶1∶1)中超声处理30min。20g MWNT-COOHs溶于150mlDMF中超声处理30min。上述两种溶液混合后85℃反应24h后90℃烘干制成纳米复合材料。1g CALB(酶活5000U/g)溶于50mL PBS溶液，加入上述材料10g，搅拌1h后离心回收纳米复合材料，并用PBS清洗，得到固定化CALB，将100g柠檬酸、100mL无水乙醇及3g固定化CALB，pH7加热搅拌50℃下反应8h，过滤去除固定化酶，50℃减压蒸馏出过量的乙醇，得柠檬酸三乙酯成品141.0g，摩尔转化率98.1％。固定化酶重复利用20次，催化活力仍保持85％以上。

图1为原料MWNT-COOHs的TEM照片，表面光滑，可固载的酶蛋白数量有限且不牢固。图2为纳米复合材料MWNT-COOHs-MOF的TEM照片，表面突起为MOF修饰的部位，结构比表面积增加，固定化酶量更多，且结构稳定。

实施例2：

10g对苯二甲酸与20gZn(NO₃)₂溶于1L溶剂(DMSO∶乙醇∶水＝1∶2∶1)中超声处理30min。40g MWNT-COOHs溶于300mlDMSO中超声处理30min。上述两种溶液混合后100℃反应18h后105℃烘干制成纳米复合材料。1g P450(4530U/g)溶于50mL PBK溶液，加入上述材料15g，搅拌2h后离心回收纳米复合材料，并用PBK清洗。将200g柠檬酸、200mL无水丁醇及8g固定化P450，pH6.8加热搅拌60℃下反应12h，过滤去除固定化酶，80℃减压蒸馏出过量的丁醇，得柠檬酸三丁酯成品358.2g，摩尔转化率95.6％。固定化酶重复利用18次，催化活力仍保持80％以上。

对比例1：

将100g柠檬酸、100mL无水乙醇及0.3g游离CALB(与3g实施例1制备的固定化CALB总量相同)，pH7加热搅拌50℃下反应12h，离心去除游离酶，50℃减压蒸馏出过量的乙醇，得柠檬酸三乙酯成品110.5g，摩尔转化率76.9％。

对比例2：

将200g柠檬酸、200mL无水丁醇及1g游离P450(与8g实施例2制备的固定化P450总量相同)，pH6.8加热搅拌60℃下反应16h，离心去除游离酶，80℃减压蒸馏出过量的丁醇，得柠檬酸三丁酯成品304.2g，摩尔转化率81.1％。