一种突变型Tn5转座酶及其制备方法和应用与流程

文档序号:12411652阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种突变型Tn5转座酶,其特征在于,所述突变型Tn5转座酶的氨基酸序列为EK/LP Tn5转座酶的氨基酸序列定点突变所得,所述定点突变是指D97E、D188E、E326D中的至少两个;其中,

突变位点1:D97E,即EK/LP Tn5转座酶基酸序列中第97位的丙氨酸突变为谷氨酸;

突变位点2:D188E,即EK/LP Tn5转座酶基酸序列中第188位的丙氨酸突变为谷氨酸;

突变位点3:E326D,即EK/LP Tn5转座酶基酸序列中第326位的谷氨酸突变为丙氨酸。

2.编码权利要求1所述突变型Tn5转座酶的基因。

3.根据权利要求1所述的突变型Tn5转座酶,其特征在于,所述突变型Tn5转座酶包含3个定点突变:D97E、D188E、E326D,氨基酸序列如SEQ NO.2所示。

4.编码权利要求3所述的突变型Tn5转座酶的如SEQ NO.3所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的突变型Tn5转座酶,其特征在于,所述突变型Tn5转座酶包含2个定点突变:D97E、D188E,编码所述突变型Tn5转座酶的核苷酸序列如SEQ NO.4所示。

6.根据权利要求1所述的突变型Tn5转座酶,其特征在于,所述突变型Tn5转座酶包含2个定点突变:D188E、E326D,编码所述突变型Tn5转座酶的核苷酸序列如SEQ NO.5所示。

7.根据权利要求1所述的突变型Tn5转座酶,其特征在于,所述突变型Tn5转座酶包含2个定点突变:D97E、E326D,编码该突变型Tn5转座酶的核苷酸序列如SEQ NO.6所示。

8.如权利要求1或3或5-7任一项所述的突变型Tn5转座酶在DNA建库中的应用。

9.如权利要求1或3或5-7任一项所述的突变型Tn5转座酶的制备方法,包括如下步骤:

1)构建含编码所述突变型Tn5转座酶的核苷酸序列的载体

利用含有突变位点信息的引物,对含有EK/LP Tn5转座酶基因的质粒进行PCR扩增;PCR扩增得到目的条带后切胶回收,利用Dpn1酶消化原始模板质粒;扩增产物转化到感受态细胞中,涂板挑单克隆摇菌抽提质粒进行鉴定,即可得到含突变型Tn5转座酶基因的载体;

2)得到重组细胞

将步骤1)得到的正确载体转化到B121宿主细胞中,利用抗生素筛选得到正确转化的重组细胞,并挑单克隆;

3)培养并收集重组细胞,提取纯化突变型Tn5转座酶;

其中,步骤1)中所述引物包括:

引入三个突变位点D97E,D188E、E326D的引物序列,包括:

A97-f:gccattgaggaaaccacct;

A97-r:aggtggtttcctcaatggc;

B188-f:gcggtctgtgaacgcgaagc;

B188-r:gcttcgcgttcacagaccgc;

C326-f:cggatcgacgagttccata;

C326-r:tatggaactcgtcgatccg;

或,引入二个突变位点D97E、D188E的引物序列,包括:

A97-f:gccattgaggaaaccacct;

A97-r:aggtggtttcctcaatggc;

B188-f:gcggtctgtgaacgcgaagc;

B188-r:gcttcgcgttcacagaccgc;

或,引入二个突变位点D188E、E326D的引物序列,包括:

B188-f:gcggtctgtgaacgcgaagc;

B188-r:gcttcgcgttcacagaccgc;

C326-f:cggatcgacgagttccata;

C326-r:tatggaactcgtcgatccg;

或,引入二个突变位点D97E、E326D的引物序列,包括:

C326-f:cggatcgacgagttccata;

C326-r:tatggaactcgtcgatccg;

A97-f:gccattgaggaaaccacct;

A97-r:aggtggtttcctcaatggc。

10.一种利用权利要求1或3或5-7任一项所述突变型Tn5转座酶进行基因组DNA片段化的反应体系为:10~25mM HEPES缓冲液,pH 7.2~7.6;0.1~5mM beta-巯基乙醇;10~80μg/ml牛血清白蛋白;0.1~0.2M谷氨酸钾;0.2~0.5mM MnSO4;0.2~1mM KCl;100~500nM所述突变型Tn5转座酶;50~100ng基因组DNA;0.1~1ng含有19bp转座子序列的接头引物;反应程序:37℃,10min~1h;

其中,所述接头引物包括:转座酶识别序列:AGATGTGTATAAGAGACAG;第一接头序列:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC;第二接头序列:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG。

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