具有补体调节活性的重组补体因子H‑免疫球蛋白融合蛋白及其制备方法与应用与流程

本发明属于基因工程领域中的融合蛋白，特别是涉及一种具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性的重组补体因子h(cfh)融合蛋白，其包含全长cfh或具有生物活性的cfh片段或其片段组合的cfh结构域与免疫球蛋白重链恒定区(ch)结构域，还涉及所述融合蛋白的制备方法和用途。
背景技术：
：补体(complement)是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组具有免疫调节功能的蛋白质的总称，包含有c1、c2、……c9等，是先天免疫系统的主要效应物。补体是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统，故称为补体系统(complementsystem)。根据补体系统各成分的生物学功能，可将其分为补体固有成分、补体调控成分和补体受体。补体系统主要参与外源病原体的定靶和清除，也参与免疫复合物和细胞碎片的排除以及增强细胞免疫。补体系统并被证明在多种自身免疫、炎症等疾病的病理学过程中扮演重要角色(ehrnthallerc,ignatiusa,gebhardf,huber-langm.newinsightsofanolddefensesystem:structure,function,andclinicalrelevanceofthecomplementsystem.molmed.2011,17(3-4):317-329.)。补体激活的过程有经典途径(classicalpathway)、凝集素途径(mannose-bindinglectinpathway)和旁路途径(alternativepathway)三种(nesargikarpn,spillerb,chavezr.thecomplementsystem:history,pathways,cascadeandinhibitors.eur.j.microbiol.immunol(bp).2012,2(2):103-111.)。经典途径是由补体成分c1(c1复合体由一个clq分子、二个clr分子、二个cls分子组成)与经典途径激活因子(主要是含有igm、igg1、igg2或igg3的抗原-抗体复合物)的结合而激活的，c1q与单个igm分子或相邻两个igg分子结合，继而激活c1r和c1s，经典补体激活途径的反应顺序是：c1、c4、c2、c3、c5、c6、c7、c8、c9。在凝集素途径中，甘露糖结合凝集素在补体激活过程中扮演的角色类似经典途径的c1q蛋白质，与病原体表面的甘露糖残基和果糖残基结合，另与masp-1和masp-2两种蛋白(类似c1r和c1s)组成激活补体的复合物，继续进行类似经典途径的反应。旁路途径的起始依赖血清c3自然水解成c3a、c3b，继而c3b附着到靶细胞表面与b、d、p因子结合进入类似经典途径的步骤。自c3b产生以后，三条途径的反应非常类似。三条途径在各自形成c5转化酶之后c5裂解成c5a、c5b两部分，c5b则与c6、c7、c8、c9形成所谓膜攻击复合物(membrane-attackcomplex，mac)，在目标细胞的细胞膜上产生10nm左右的穿孔，导致目标细胞因为渗透压无法维持而膨胀破裂。正常情况下，补体系统的激活只发生在入侵病原体的表面，而不会损伤人体细胞本身。补体因子h(complementh，cfh)是在旁路补体激活过程中实现这种“自我”与“非我”识别的关键分子(ferreiravp,pangburnmk,cortésc.complementcontrolproteinfactorh:thegood,thebad,andtheinadequate.molimmunol.2010,47(13):2187-2197.)。在旁路途径中，附着在靶细胞表面的c3b与补体因子b结合，随后补体因子d切割b因子产生具有酶活性c3bbb，c3bbb与p因子结合形成c3bbbp(旁路途径的c3转化酶)。c3bbbp切割c3生成c3b，进一步引起激活，形成急速放大的正反馈环。而cfh可以与c3b结合，竞争b因子的结合位点，从而阻断c3bbb的形成，而且作为辅因子激活因子i对c3b的降解形成ic3b，ic3b则不能与b因子结合，还能加速已经形成的c3bbb复合体的不可逆性衰变，因此通过多重效应对旁路途径的激活施加抑制作用。cfh是一种糖蛋白，在血浆中浓度很高(～500μg/ml)，主要由肝脏产生，成熟的cfh由1213个氨基酸组成，是一个由20个短同源重复序列(shortconsensusrepeats，scr)或补体调控蛋白模块(complementcontrolproteinmodules，ccp)构成的类似串珠状的结构。这些scr按从n端到c端的顺序分别命名为scr1至scr20。每个scr由约60个氨基酸组成，在空间结构上高度相似。cfh与c3b主要通过两个结合位点相互作用，分别位于scr(1-4)(结合完整的c3b)和scr(19-20)(结合c3d部分)，有报道scr(6-14)也有结合c3b的功能(结合c3c片段)(sharmaak&pangburnmk.identificationofthreephysicallyandfunctionallydistinctbindingsitesforc3binhumancomplementfactorhbydeletionmutagenesis.proc.natl.acad.sci.usa1996,93:10996-11001.；jokirantats,etal.eachofthethreebindingsitesoncomplementfactorhinteractswithadistinctsiteonc3b.jbiolchem.2000,275(36):27657-62.)。cfh与固定在细胞表面的c3b结合后，能粘附到细胞表面，抑制c3bbb的形成。现有的研究表明，cfh的补体抑制活性结构域位于scr(1-4)，scr(1-4)具有与c3b结合、补体因子i的辅因子作用和加速c3bbb衰变的作用。cfh还有与细胞表面c3受体cr3和糖胺聚糖(glycosaminoglycans，gags)结合的位点，主要分别位于scr7和scr(19-20)(aslamm&perkinssj.folded-backsolutionstructureofmonomericfactorhofhumancomplementbysynchrotronx-rayandneutronscattering,analyticalultracentrifugationandconstrainedmolecularmodelling.jmolbiol.2001,309(25):1117–1138.)。因gags通常只存在于正常动物个体的细胞表面，而细菌、病毒等病原物的表面不具有这种结构，所以cfh通过这样的特异性识别作用保护自身细胞免受旁路途径引起的攻膜复合体的破坏。cfh结构中scr(6-8)和scr(18-20)还能与固定在组织或细胞表面的c-反应蛋白(crp)结合，在炎症过程中减少补体过度激活对组织造成的损伤(perkinssj,etal.complementfactorh–ligandinteractions:self-association,multivalencyanddissociationconstants.immunobiology2012,217:281-297.)。补体旁路途径的异常激活或cfh基因的异常如单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)被证实会引起多种自身免疫性疾病和炎症反应，直接涉及cfh异常的疾病包括年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration，amd，位于cfhscr7的y402h单核苷酸多态性)、缺血性卒中(ischemicstroke)、非典型溶血性尿毒综合症(atypicalhemolyticuremicsyndrome，ahus)、精神分裂症(schizophrenia)等。涉及补体旁路途径的病理过程还包括局部的缺血及再灌注之后的远端组织损伤、狼疮肾炎、ii型膜增生性肾小球肾炎(membranoproliferativeglomerulonephritistypeii,mpgn-ii)或者致密物沉积病(densedepositdisease,ddd)、类风湿性关节炎、阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria，pnh)等。通过靶向抑制或下调过度激活的补体旁路途径已经被证明对于相关疾病是有效的。例如，多个专利文献描述了含有cfh的组分用于治疗多种疾病，包括amd等眼底病(wo2006/062716.hohj&kleinr.methodsandcompositionsfortreatingoculardisorders.；wo2007/056227.fungsc&yaoz.useofcomplementpathwayinhibitorstotreatoculardiseases.)、溶血性尿毒综合症(hus，us2008/0318841.chtourouas,etal.methodforpreparingafactorhconcentrateandtheusethereofintheformofadrug.)，自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和肾小球肾炎(us4,883,784.kanekoi.humancomplementfactorsandtheirtherapeuticuse.)等。专利文献wo/2007/149567(cn101563363b)公开的cr2-cfh融合蛋白对湿性和干性amd动物模型均有显著的症状缓解作用。另有公开的抗b因子抗体(wo/2005/077417.holersvm,etal.inhibitionoffactorb,thealternativecomplementpathwayandmethodrelatedthereto.)、抗d因子抗体(cn103724433a.阿瑟.j.黄.人源化抗体因子d抗体及其用途；wo2007/056227.fungsc&yaoz.useofcomplementpathwayinhibitorstotreatoculardiseases.)、抗bb抗体(wo/2013/152020.bansalr.humanizedandchimericanti-factorbbantibodiesandusesthereof.)和crig融合蛋白(cn103349777.阿维.阿什克纳齐.用于预防和治疗补体紊乱的crig多肽.)等也各自被证实对于相关疾病是有效的。以上研究中大部分选择了补体系统中不同于cfh的靶点如b因子、d因子和bb等，而cfh是目前认为最重要的补体旁路途径的调节因子，具有多重补体调节功能，而且能在液相(如血液)和固相(如细胞表面)都有调节作用，因此成为一个研究方向。虽然有些专利文献选择了cfh，或是全长cfh，或是不同cfh片段(如专利文献wo/2007/149567(cn101563363b)中的scr(1-5)，但仍然存在功能单一、生物利用方面的缺憾。技术实现要素：本发明的目的是提供一种具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性且能延长该活性物质在生物体内半衰期的重组补体因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白。本发明所提供的重组补体因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白，简称为cfh-ig融合蛋白，为具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性的重组补体因子h(cfh)和免疫球蛋白(ig)的融合蛋白，其包含：a)含有cfh或其片段或其片段组合的补体因子h部分，和b)含有免疫球蛋白重链恒定区(ch)的免疫球蛋白部分，其中，所述补体因子h部分具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性，即具有抑制或调控补体旁路途径过度激活的作用，或同时具有靶向被补体过度激活的组织的作用；其中，所述免疫球蛋白部分具有延长其在生物体内半衰期的作用。本发明的cfh-ig融合蛋白是在已知c3b的功能和已知cfh的三维空间结构以及其与c3b和其它配体相互作用的模型的基础上设计和发明的，其中含有具有补体因子i的辅因子作用和加速c3bbb衰减作用的片段，或同时具有与c3b有效结合和与组织细胞或颗粒表面糖胺聚糖(gags)以及crp结合的片段，或者其片段组合。已知补体旁路途径自发产生的c3b是一种重要的调理素(opsonin)，更是补体系统四种转化酶中的三种转化酶的成分之一，如形成的c3bbb复合体是一种c3转化酶，能切割c3产生更多的c3b，从而促进补体的级联反应；进一步形成的c3bbbc3b复合体则是一种c5转化酶，切割c5产生的c5b最终参与形成膜攻击复合物(mac)，过度的补体旁路途径激活会引起正常组织的损伤而导致组织炎症或者细胞变性或死亡。因此有效调控c3b的含量或活性能减少、防止甚至逆转由于补体旁路途径过度激活所造成的组织损伤。在一实施例中，本发明的cfh-ig融合蛋白中cfh部分含有与c3b有效结合的片段，同时含有补体因子i的辅因子作用和加速c3bbb衰变作用的片段；在另一个实施例中，本发明的cfh-ig融合蛋白中cfh部分还具有与组织细胞或颗粒表面糖胺聚糖(gags)以及c-反应蛋白(crp)结合的片段，或者其片段组合，以达到有效抑制或者调控补体旁路途径过度激活，或同时具有靶向补体过度激活的组织的作用。在本发明中，“具有生物活性的任何cfh片段”是指全长cfh的部分或具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性的cfh片段。具体来讲，具有生物活性的cfh片段具有以下一种或多种活性：与细胞表面补体受体(cr3、cd11b/cd18或integrinαm/integrinβ2)结合活性、与c3b结合活性、与gags结合活性、与crp结合活性、与病原体结合活性、补体因子i切割c3b辅因子活性和c3bbb衰变加速活性。本发明的cfh-ig融合蛋白，其重组补体因子h(cfh)部分可以是cfh全长序列，也可以是具有生物活性的任何cfhn-端短同源重复序列(scr)中scr1-scr17之间的任一片段，如scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)或其不同片段的组合，或者是scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)和scr(1-17)中的任一片段与cfh分子c-端序列中scr(18-20)或scr(19-20)任意组合的产物。优选地，本发明cfh-ig融合蛋白的重组补体因子h(cfh)部分可以是cfh全长序列，也可以是cfhscr(1-4)或scr(1-7)，或者是scr(1-4)或scr(1-7)与scr(18-20)或scr(19-20)任意组合的产物。更加优选地，本发明cfh-ig融合蛋白的重组补体因子h(cfh)部分可以是cfhscr(1-7)，也可以是scr(1-7)与scr(18-20)组合的产物。本发明cfh-ig融合蛋白中的人全长cfh、人cfhscr(1-4)、scr(1-7)、scr(18-20)和scr(19-20)的氨基酸序列分别如序列表中seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4和seqno.5所示，或与序列表中seqno.1、seqno.2、seqno.3、seqno.4和seqno.5具有至少90％同源性的氨基酸序列。此外，本发明的cfh-ig融合蛋白，其重组补体因子h(cfh)部分也可以是含有2个或多个cfh全长序列，或2个或多个具有生物活性的任何cfhn-端scr片段，如2个或多个scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)或其不同片段的组合，或者是2个或多个scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)与scr(18-20)和/或scr(19-20)任意组合的产物。优选地，本发明cfh-ig融合蛋白的重组补体因子h(cfh)部分可以是2-4个cfh全长序列，也可以是2-4个cfhscr片段，即2-4个scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)或其不同片段的组合，或者是2-4个scr(1-3)、scr(1-4)、scr(1-5)、scr(1-6)、scr(1-7)、scr(1-8)、scr(1-9)、scr(1-10)、scr(1-11)、scr(1-12)、scr(1-13)、scr(1-14)、scr(1-15)、scr(1-16)或scr(1-17)与scr(18-20)和/或scr(19-20)任意组合的产物。本发明cfh-ig融合蛋白的重组补体因子h(cfh)部分可以来源于人类。为了验证本发明的cfh-ig融合蛋白在其它物种中的药理作用，其cfh部分也可以来源于其它物种如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、狗、猪、羊和非人灵长类动物。优选地，cfh部分来源于人类、小鼠、大鼠和非人灵长类动物。更优选地，cfh部分来源于人类。本发明cfh-ig融合蛋白的免疫球蛋白(ig)部分可以是来源于人类或者其它物种如大鼠或小鼠的免疫球蛋白，优选地，是来自于人类的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白(ig)部分含有免疫球蛋白恒定区，所述免疫球蛋白恒定区是免疫球蛋白重链恒定区(ch)，所述免疫球蛋白重链恒定区可以选自不同的免疫球蛋白，如iga、igd、ige、igg和igm；优选地，免疫球蛋白重链恒定区选自igg，可以选自igg的不同亚型igg1、igg2(igg2a、igg2b)、igg3和igg4，以及不同亚型之间的组合(如igg2/igg4)；更优选地，免疫球蛋白重链恒定区来自于igg1、igg2和igg4。为了减少或避免免疫球蛋白fc结构域的效应器功能如激活补体和/或与抗体受体(fc受体)结合，选用的igg1的fc结构域中与fc受体结合位点的氨基酸可以被删掉或者被置换，或直接选用不激活补体的igg4(taomh,smithri,morrisonsl.structuralfeaturesofhumanimmunoglobulingthatdetermineisotype-specificdifferencesincomplementactivation.j.exp.med.1993,178:661-667；smithri,colomamj,morrisonsl.additionofamu-tailpiecetoiggresultsinpolymericantibodieswithenhancedeffectorfunctionsincludingcomplement-mediatedcytolysisbyigg4.j.immunol.1995,154:2226-2236.)或不与fc受体结合的igg2(canfieldsm&morrisonsl.thebindingaffinityofhumaniggforitshighaffinityfcreceptorisdeterminedbymultipleaminoacidsinthech2domainandismodulatedbythehingeregion.j.exp.med.1991,173:1483-1491；burtondr&woofjm.humanantibodyeffectorfunction.adv.immunol.1992,51:1-84.)或igg2和igg4的组合。igg重链恒定区可以包括ch1区、铰链区、ch2区和ch3区，至少包括fc片段(铰链区、ch2区和ch3区)。所述fc部分，可以是来源于人类或者其它物种如大鼠或小鼠的免疫球蛋白fc结构域，优选地，是来源于人类的免疫球蛋白fc结构域。本发明cfh-ig融合蛋白中的大鼠、小鼠和人的免疫球蛋白igg1fc部分对应的氨基酸序列分别如序列表中seqno.6、seqno.7和seqno.8所示，或分别与seqno.6、seqno.7和seqno.8具有至少90％同源性的氨基酸序列。本发明的cfh-ig融合蛋白中的cfh部分和fc部分的连接顺序可以是fc部分在n端，cfh部分在c端，即fc-cfh；或者，cfh部分在n端，fc部分在c端，即cfh-fc。在一些实施方式中，cfh部分和fc部分以共价键方式连接：其共价连接方式可以是肽段接头，如(gly4ser)n，n应满足最大程度保证cfh部分和fc部分的正确装配以实现其补体活性调节功能，优选地，n在1-6之间；其共价连接方式也可以是cfh部分和fc部分直接以肽键连接；其连接方式还可以是其它能够满足最大程度保证cfh片段和fc片段的正确装配以实现其补体活性调节功能的任意共价连接方式(如化学交联剂)。本发明实验中，cfh-ig融合蛋白中的cfh部分和fc部分之间直接以肽键连接。在一些实施方式中，所述cfh部分和所述fc部分可以是非共价连接的，例如，这两部分可以通过两个相互作用的桥接蛋白(如生物素和链霉抗生物素蛋白，或者亮氨酸拉链)介导而连接，每个桥接蛋白连接到cfh部分或fc部分。本发明中，cfh-ig融合蛋白由人scr(1-7)和人fc融合而成，从n-端到c-端的顺序为hfc-l-hscr(1-7)或hscr(1-7)-l-hfc，其中h代表人，l代表肽段接头，例如，从n-端到c-端的顺序为hscr(1-7)-l-hfc。在另一些实施例中，cfh-ig融合蛋白由人scr(1-7)和小鼠fc融合而成，从n-端到c-端的顺序为mfc-l-hscr(1-7)或hscr(1-7)-l-mfc，其中m代表小鼠，l代表肽段接头，例如，从n-端到c-端的顺序为hscr(1-7)-l-mfc。再在另一些实施例中，重组cfh-ig融合蛋白由人scr(1-7)、人scr(18-20)和人fc融合而成，从n-端到c-端的顺序为hfc-l-hscr(1-7)-hscr(18-20)或hfc-l-hscr(18-20)-hscr(1-7)或hscr(1-7)-hscr(18-20)-l-hfc或hscr(18-20)-hscr(1-7)-l-hfc，例如，从n-端到c-端的顺序为hscr(1-7)-hscr(18-20)-l-hfc。还有在另一些实施例中，cfh-ig融合蛋白由人scr(1-7)、人scr(18-20)和小鼠fc融合而成，从n-端到c-端的顺序为mfc-l-hscr(1-7)-hscr(18-20)或mfc-l-hscr(18-20)-hscr(1-7)或hscr(1-7)-hscr(18-20)-l-mfc或hscr(18-20)-hscr(1-7)-l-mfc，例如，从n-端到c-端的顺序为hscr(1-7)-hscr(18-20)-l-mfc。以上l表示的肽段接头可以为(gly4ser)n，n应满足最大程度保证cfh部分和fc部分的正确装配以实现其补体活性调节功能，优选地，n为0或在1-6之间；n为0时，表示的是融合蛋白的两部分以肽键连接而未使用肽段l连接，故实施例中与上述命名对应的融合蛋白表示形式均省略“l”，分别为hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc和hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc，其氨基酸序列分别如序列表中seqno.9、seqno.10、seqno.11所示，或是分别与seqno.9、seqno.10、seqno.11具有至少90％同源性的氨基酸序列。本发明中，以“scr(1-3)”或“scr1-3”的表述为例，其含义为“scr1至scr3的片段”。其它数字的类似表示含义与此相同。术语“价”在本发明使用时，是指单个融合蛋白中所包含的cfh片段的具体数量，比如术语“二价”，指在单个融合蛋白中存在两个cfh或两个cfh片段。本发明的cfh-ig融合蛋白至少是“二价”的，成熟重组人补体因子cfh-ig融合蛋白(二价)的结构如图1之b所示，也可以是“多价”的(例如“三价”、“四价”等)。所述“二价”，由两个fc片段之间以二硫键配对实现，最终所形成的是一个对称的类似抗体形状的融合蛋白。在一些实施方式中，所述cfh-ig融合蛋白中的cfh部分可以由两个或多个cfh片段(相同或不同)相互串联(例如通过融合表达，或者通过桥接蛋白介导的非共价连接)而成，从而形成“多价”，成熟重组人补体因子cfh-ig融合蛋白(多价)的结构如图1之c所示。本发明的cfh-ig融合蛋白还包括但不限于以下所述的变体：(i)在保留补体调节活性的前提之下，cfh部分和/或免疫球蛋白fc部分的一个或多个氨基酸被保守或非保守氨基酸(优选为保守氨基酸)置换，而且置换的氨基酸可以是遗传密码编码的氨基酸，也可以是不被遗传密码编码的氨基酸，还可以是人工合成的非天然氨基酸；或(ii)有其它氨基酸序列被融合到所保护的融合蛋白中，以便于提纯(如his标签、gst标签蛋白等)，或者便于分泌表达(如信号肽序列)，或者是便于靶向到特定组织或部位的序列如cr2或crig，或者是其它提高半衰期的部分(如血清白蛋白)；或(iii)被化学修饰的变体，包括但不限于聚乙二醇(peg)修饰、生物素修饰和糖链修饰，修饰后的重组人补体因子cfh-ig融合蛋白的示意图如图1之d所示。编码上述具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性的重组补体因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白(cfh-ig)的基因也属于本发明的保护范围。含有本发明重组补体因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白(cfh-ig)编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种制备重组补体因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白(cfh-ig)的方法。具体来讲，本发明cfh-ig融合蛋白的制备方法，可包括以下步骤：1)合成编码cfh-ig融合蛋白的cdna序列；2)将编码cfh-ig融合蛋白的cdna序列插入工具载体，构建可在宿主细胞中表达的重组表达载体，其结构示意图如图1之a所示；3)将所述重组表达载体转化宿主细胞，使其在宿主细胞中表达；4)分离、纯化表达的cfh-ig融合蛋白。在上述cfh-ig融合蛋白的制备方法中，所述步骤2)中的工具载体为市售商业化载体或自行构建的可供表达的载体；所述宿主细胞包括大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞。在一个实施例中，所述哺乳动物细胞是cho细胞。本发明具有补体调节活性尤其是补体旁路途径调节活性的重组补体因子h(cfh)-免疫球蛋白(ig)融合蛋白(cfh-ig)作为活性成分在制药中的应用也属于本发明的保护范围。本发明各种结构类型的cfh-ig融合蛋白通过药学可接受的、适合于给药的药物载体制备成药物组合物，合适的药物载体为本领域技术人员熟知的，包括但不限于生理盐水、磷酸缓冲液、水、脂质体、纳米载体等。含有cfh-ig融合蛋白的药物载体可通过常规方法制备。本发明含有各种结构类型的cfh-ig融合蛋白的药物组合物可以通过各种给药途径施用有效剂量于人类或其它哺乳动物，给药途径包括但不限于静脉注射(iv)、静脉滴注(infusion)、肌肉注射(im)、皮下注射(sc)、玻璃体内注射(ivt)、结膜下注射(scj)、经巩膜注射(ts)、通过玻璃体内植入装置给药、口服(po)、舌下给药(sl)、喷雾(spray)和滴眼剂外用(eyedrop)。对于不同的疾病，可以选择不同的给药途径。在一些实施例中，cfh-ig融合蛋白可以通过玻璃体内注射(ivt)、结膜下注射(scj)、经巩膜注射(ts)、通过玻璃体内植入装置给药或滴眼剂外用(eyedrop)给药；在另一些实施例中，cfh-ig融合蛋白可以通过静脉注射(iv)、静脉滴注(infusion)、肌肉注射(im)或皮下注射(sc)给药。本发明含有各种结构类型的重组cfh-ig融合蛋白的药物组合物可以通过上述给药途径单独使用或者与其它药物联合使用，或者与其它药物偶联后用于人类或其它哺乳动物。所述其它药物为抗血管内皮生长因子-a(vegf-a)抗体或抗体片段、重组vegf受体融合蛋白或抗c5抗体。本发明含有各种结构类型的重组cfh-ig融合蛋白的药物组合物可以用于制备治疗人类或者其它哺乳动物中由补体旁路途径介导、失调或缺陷所致的自身免疫性疾病或其它疾病的药物。所述疾病包括年龄相关性黄斑变性(amd)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)、非典型溶血性尿毒综合症(ahus)、ii型膜增生性肾小球肾炎(membranoproliferativeglomerulonephritistypeii,mpgn-ii)、致密物沉积病(densedepositdisease,ddd)。本发明含有各种结构类型的重组cfh-ig融合蛋白的药物组合物还可以被涂在医疗装置尤其是与组织或体液直接接触的可植入式医疗装置如人工器官和心脏支架、或血液体外分流系统表面，以抑制其表面的因补体过度激活而引起的血栓形成。本发明提供的由重组补体因子h(cfh)部分和含有免疫球蛋白重链恒定区(ch)的免疫球蛋白(ig)部分组成的融合蛋白cfh-ig，一方面通过cfh部分的作用抑制补体旁路途径过度激活，使本发明的cfh-ig融合蛋白具有补体调节活性，该活性包括：(1)c3b结合活性；(2)补体因子i切割c3b辅因子活性；(3)c3bbb衰变加速活性；(4)抑制补体旁路途径活性。除了补体调节活性以外，所述cfh-ig融合蛋白，尤其是含有cfh分子c-端scr(18-20)或scr(19-20)片段的融合蛋白还具有同时靶向融合蛋白至补体异常激活组织的作用。本发明的cfh-ig融合蛋白可以用于缓解或治疗由于补体旁路途径介导、失调或缺陷导致的相关疾病，如自身免疫性疾病或其它疾病，尤其是amd、pnh、ahus和mpgn-ii。另一方面通过免疫球蛋白重链恒定区fc作用延长在生物体内的半衰期，以减少给药次数，增加病人的用药顺应性。本发明将在人类或者其它哺乳动物中由补体旁路途径介导、失调或缺陷所致的自身免疫性疾病或其它疾病以及因补体过度激活而引起的血栓的治疗中发挥作用，具有应用前景。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明图1为重组人补体因子cfh-ig融合蛋白表达载体及其成熟蛋白，以及修饰后的重组人补体因子cfh-ig融合蛋白的示意图：a.重组人补体因子cfh-ig融合蛋白表达载体示意图，b.成熟重组人补体因子cfh-ig融合蛋白(二价)的结构，c.成熟重组人补体因子cfh-ig融合蛋白(多价)的结构，d.经修饰过的重组人补体因子cfh-ig融合蛋白。图2中a幅为人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-hfc-6×his-xbai基因序列的1％琼脂糖电泳检测结果。图2中b幅为人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-mfc-6×his-xbai基因序列的1％琼脂糖电泳检测结果。图3中a幅为人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-hfc-6×his-xbai表达载体阳性克隆筛选的1％琼脂糖电泳检测结果。图3中b幅为人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-mfc-6×his-xbai表达载体阳性克隆筛选的1％琼脂糖电泳检测结果。图4中a幅为hscr(1-7)-hfc融合蛋白纯化后样品的电泳图。图4中b幅为hscr(1-7)-mfc融合蛋白纯化后样品的电泳图。图5中a幅为hscr(1-7)-hfc融合蛋白的westernblot图谱。图5中b幅为hscr(1-7)-mfc融合蛋白的westernblot图谱。图6为人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his-xbai基因序列的1％琼脂糖电泳检测结果。图7为人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his-xbai表达载体阳性克隆筛选的1％琼脂糖电泳检测结果。图8为hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白纯化后样品的电泳图。图9为hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的westernblot图谱。图10为hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh与c3b亲和力比较结果，其中qbc7007指的是hscr(1-7)-hfc，qbc7004指的是hscr(1-7)-mfc，qbc7008指的是hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc。图11为hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh的溶血抑制活性曲线，其中qbc7007指的是hscr(1-7)-hfc，qbc7004指的是hscr(1-7)-mfc，qbc7008指的是hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc。图12为hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh辅助factori切割c3b活性比较结果：a.切割后样品电泳检测结果，b.不同样品切割率对比。具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(w/w，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(w/v，单位g/100ml)百分比浓度或体积/体积(v/v，单位ml/100ml)百分比浓度。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。所用基因序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1、hscr(1-7)-hfc融合蛋白的设计与制备一、scr(1-7)-hfc融合蛋白的核酸序列设计与合成从genbank分别获得人cfh(序列号：aai42700.1)和人igg1重链(序列号：caa75032.1)的氨基酸序列，截取人cfh中scr(1-7)和人igg1中fc结构域的序列，按照从n端至c端方向直接以肽键连接，为便于纯化，在c端引入tev(tobaccoetchvirusprotease)酶切位点(氨基酸序列为enlyfqg)和6×his标签，得到分子a1；然后将分子a1融合到人cfh信号肽3’端，得到分子b1(融合蛋白人cfh信号肽-hscr(1-7)-hfc-6×his，其中，“h”是单词“human”的首字母，代表来源于人类)；再在分子b1编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点xhoi和xbai，得到分子c1(融合基因人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-hfc-6×his-xbai)。将分子c1的基因序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在cho细胞中表达的核苷酸序列，如序列表中序列seqno.12所示，合成该基因序列。合成基因序列的1％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2a所示，获得了2079bp的基因条带，与预期结果相符。二、scr(1-7)-hfc融合蛋白的表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选将测序正确的融合基因人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-hfc-6×his-xbai通过xhoi和xbai双酶切连接到pci-neo载体(购自promega)中，通过pcr法筛选阳性克隆，结果如图3a所示，取3个阳性克隆经dna测序分析，与设计完全一致。然后将阳性克隆转染cho-dg44贴壁细胞(购自invitrogen)，添加0.5mg/mlg418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过western方法筛选到表达水平(产量)较高的稳定细胞株，产量为5mg/l-100mg/l。三、hscr(1-7)-hfc融合蛋白的分离与纯化收集培养液上清，按顺序用ni-nta螯合层析和proteina亲和层析进行分离。具体的说，将培养基上清1000g离心10min，留上清。然后将上清上样到用溶液ⅰ(20mmtris·cl+150mmnacl，ph8.0)预平衡的ni-nta亲和层析柱(购自gehealthcare)，用溶液ⅰ洗涤5-10个柱体积，然后用溶液ⅱ(20mmtris·cl+150mmnacl+30mm咪唑，ph8.0)洗脱杂质。再用溶液ⅲ(20mmtris·cl+150mmnacl+300mm咪唑，ph8.0)洗脱，收集洗脱峰。将其上样至用溶液ⅳ(pbs，配方：135mmnacl,1.5mmkh2po4,and8mmk2hpo4，ph7.4)预处理过的proteina层析柱(购自millipore)，用溶液ⅳ洗涤5-10个柱体积,再用溶液ⅴ(0.1m甘氨酸，ph3.0)洗脱，收集目的流出峰。用bca方法进行定量。对经分离、纯化的表达产物进行8％sds-page检测，结果如图4之a所示，获得了151kd的蛋白条带，与预期结果相符，纯度>95％。对表达的hscr(1-7)-hfc融合蛋白进行测序，其氨基酸序列如序列表中seqno.9所示。四、hscr(1-7)-hfc融合蛋白的westernblot鉴定取步骤三纯化的蛋白样品进行8％sds-page电泳，然后通过电转仪(bio-rad)转印到pvdf膜上，用tbs(50mmtris·cl，150mmnacl,ph7.5)洗膜三次，然后用5％脱脂牛奶封闭1h，然后分别以抗人cfh鼠单抗(购自santacruz)和羊抗鼠单抗-hrp(购自碧云天)为一抗和二抗各在常温孵育2h，最后以tmb(购自碧云天)显色并记录，期间用tbs洗涤三次。westernblot检测结果如图5之a所示，可以看出条带呈阳性，且条带单一，表明所获得的蛋白确为hscr(1-7)-hfc。实施例2、hscr(1-7)-mfc融合蛋白的设计与制备一、scr(1-7)-mfc融合蛋白的核酸序列设计与合成从genbank分别获得人cfh(序列号：aai42700.1)和小鼠igg1重链(序列号：aac08348.1)的氨基酸序列，截取人cfh中scr(1-7)和小鼠igg1中fc结构域的序列，按照从n端至c端方向方式连接，连接方式为肽键直接连接，为便于纯化在c端引入tev酶切位点和6×his标签，得到分子a2。然后将分子a2融合到人cfh信号肽3’端，得到分子b2(融合蛋白人cfh信号肽-hscr(1-7)-mfc-6×his，其中，“h”和“m”分别是单词“human”和“mouse”的首字母，分别代表来源于人类和小鼠)，再在分子b2编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点xhoi和xbai，得到分子c2(融合基因人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-mfc-6×his-xbai)，将分子c2的基因序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在cho细胞中表达的核苷酸序列，如序列表中序列seqno.13所示，合成该基因序列。合成基因序列的1％琼脂糖凝胶电泳图谱如图2之b所示，获得了2064bp的基因条带，与预期结果相符。二、scr(1-7)-mfc融合蛋白的表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选将测序正确的融合基因人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-mfc-6×his-xbai通过xhoi和xbai双酶切连接到pci-neo载体(购自promega)中，通过pcr法筛选阳性克隆，结果如图3之b所示，取2个阳性克隆经dna测序分析，与设计完全一致。然后将阳性克隆转染cho-dg44贴壁细胞(购自invitrogen)，添加0.5mg/mlg418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过western方法筛选到表达水平(产量)较高的稳定细胞株，产量为5mg/l-100mg/l。对表达的hscr(1-7)-mfc融合蛋白进行测序，其氨基酸序列如序列表中seqno.10所示。三、hscr(1-7)-mfc融合蛋白的分离与纯化收集培养液上清，按顺序用ni-nta螯合层析和proteina亲和层析进行分离。具体的说，将培养基上清1000g离心10min，留上清。然后将上清上样到用溶液ⅰ(20mmtris·cl+150mmnacl，ph8.0)预平衡的ni-nta亲和层析柱(购自gehealthcare)，用溶液ⅰ洗涤5-10个柱体积，然后用溶液ⅱ(20mmtris·cl+150mmnacl+30mm咪唑，ph8.0)洗脱杂质。再用溶液ⅲ(20mmtris·cl+150mmnacl+300mm咪唑，ph8.0)洗脱，收集洗脱峰。将其上样至用溶液ⅳ(pbs，ph7.4)预处理过的proteina层析柱(购自millipore)，用溶液ⅳ洗涤5-10个柱体积,再用溶液ⅴ(0.1m甘氨酸，ph3.0)洗脱，收集目的流出峰。用bca方法进行定量。对经分离、纯化的表达产物进行8％sds-page检测，结果如图4之b所示，获得了151kd的蛋白条带，与预期结果相符，纯度>95％。四、hscr(1-7)-mfc融合蛋白的westernblot鉴定取步骤三纯化的蛋白样品进行8％sds-page电泳，然后通过电转仪(bio-rad)转印到pvdf膜上，用tbs(50mmtris·cl，150mmnacl，ph7.5)洗膜三次，然后用5％脱脂牛奶封闭1h，然后分别以抗人cfh鼠单抗(购自santacruz)和羊抗鼠单抗-hrp(购自碧云天)为一抗和二抗各在常温孵育2h，最后以tmb(购自碧云天)显色并记录，期间用tbs洗涤三次。westernblot检测结果如图5之b所示，可以看出条带呈阳性，且条带单一，表明所获得的蛋白确为hscr(1-7)-mfc。实施例3、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的设计与制备一、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的核酸序列设计与合成从genebank分别获得人cfh(序列号：aai42700.1)和人igg1重链(序列号：caa75032.1)的氨基酸序列，截取人cfh中scr(1-7)、scr(18-20)和人igg1中fc结构域的序列，按照从n端至c端方向方式连接，scr(1-7)和scr(18-20)之间以及scr(18-20)和fc之间都通过肽键直接连接。为便于纯化在c端引入6×his标签，得到分子a3。然后将分子a3融合到人cfh信号肽3’端，得到分子b3(融合蛋白人cfh信号肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his，其中，“h”是单词“human”的首字母，代表来源于人类)，再在分子b3编码序列的5’和3’端分别引入酶切位点xhoi和xbai，得到分子c3(融合基因人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his-xbai)，将分子c3的基因序列委托南京金斯瑞公司进行序列密码子优化获得易于在cho细胞中表达的核苷酸序列，如序列表中序列seqno.14所示，合成该基因序列。合成基因序列的1％琼脂糖凝胶电泳图谱如图6所示，获得了2640bp的基因条带，与预期结果相符。二、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的表达载体的构建、转化及稳定表达株筛选将测序正确的融合基因人xhoi-cfh信号肽-hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc-6×his-xbai通过xhoi和xbai双酶切连接到pci-neo载体(购自promega)中，通过pcr法筛选阳性克隆，结果如图7所示，取3个阳性克隆经dna测序分析，与设计完全一致。然后将阳性克隆转染cho-dg44贴壁细胞(购自invitrogen)，添加0.5mg/mlg418加压，并通过有限稀释方法分离稳定表达株。通过western方法筛选到表达水平(产量)较高的稳定细胞株，产量为5mg/l-100mg/l。对表达的hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白进行测序，其氨基酸序列如序列表中seqno.11所示。三、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的分离与纯化收集培养液上清，按顺序用ni-nta螯合层析和proteina亲和层析进行分离。具体的说，将培养基上清1000g离心10min，留上清。然后将上清上样到用溶液ⅰ(20mmtris·cl+150mmnacl，ph8.0)预平衡的ni-nta亲和层析柱(购自gehealthcare)，用溶液ⅰ洗涤5-10个柱体积，然后用溶液ⅱ(20mmtris·cl+150mmnacl+30mm咪唑，ph8.0)洗脱杂质。再用溶液ⅲ(20mmtris·cl+150mmnacl+300mm咪唑，ph8.0)洗脱，收集洗脱峰。将其上样至用溶液ⅳ(pbs，ph7.4)预处理过的proteina层析柱(购自millipore)，用溶液ⅳ洗涤5-10个柱体积,再用溶液ⅴ(0.1m甘氨酸，ph3.0)洗脱，收集目的流出峰。用bca方法进行定量。对经分离、纯化的表达产物进行8％sds-page检测，结果如图8所示，获得了199kd的蛋白条带，与预期结果相符，纯度>95％。四、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc融合蛋白的westernblot鉴定取步骤三纯化的蛋白样品进行8％sds-page电泳，然后通过电转仪(bio-rad)转印到pvdf膜上，用tbs(50mmtris·cl，150mmnacl,ph7.5)洗膜三次，然后用5％脱脂牛奶封闭1h，然后分别以抗人cfh鼠单抗(购自santacruz)和羊抗鼠单抗-hrp(购自碧云天)为一抗和二抗各在常温孵育2h，最后以tmb(购自碧云天)显色并记录，期间用tbs洗涤三次。westernblot检测结果如图9所示，可以看出条带呈阳性，且条带单一，表明所获得的蛋白确为hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc。实施例4、hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh与c3b亲和力比较用elisa法检测hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh与c3b亲和力，具体方法为：用100μl终浓度为5μg/mlc3b包被96板4℃过夜，次日用pbst(pbs+0.1％tween20)洗涤三次，加200μl5％脱脂牛奶封闭2h，再pbst洗涤三次，然后以60nm为初始浓度的连续对半稀释(稀释后浓度梯度为60nm，30nm，15nm，7.5nm)的待测样品(hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc和hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc)孵育2h，pbst洗涤三次，再用1:5000一抗(抗人cfh鼠单抗)孵育2h，pbst洗涤三次，再用1:5000二抗(hrp偶联的羊抗鼠单抗)孵育2h，最后pbst洗涤，tmb显色，2m硫酸终止，测450nm波长吸收值，以人cfh作为阳性对照，以pbs作为阴性对照，每样三个复孔。结果如图10所示，其中qbc7007指的是hscr(1-7)-hfc，qbc7004指的是hscr(1-7)-mfc，qbc7008指的是hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc，可以看出，scr(1-7)-hfc和scr(1-7)-mfc与c3b结合的亲和力相当，且显著高于人cfh与c3b结合的亲和力，而scr(1-7)-scr(18-20)-hfc与人cfh接近。实施例5、hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh的溶血抑制活性比较一、实验材料准备5×vbs(500ml)配制：称取1.15g巴比妥酸，200ml沸水溶解；称取1.15g巴比妥酸钠及20.95gnacl，250ml水溶；冷却后加水至500ml，最终溶液用naoh调至ph在7.2-7.4之间。0.1mmgegta(100ml)：准确称取3.80gegta(sigma),2.03gmgcl2·6h2o(amersco)，加90ml水，最终溶液用naoh调至ph在7.2-7.4之间,定容至100ml。gvb(200ml，现配现用)：取40ml5×vbs，0.2ggelatin(fluka)，溶入150ml超纯水，45℃水浴至于gelatin完全溶解，调节ph至7.2-7.4，定容至200ml，0.22μm过滤后使用。gvbe(100ml，现配现用)：取20ml5×vbs，0.1ggelatin(fluka)，0.37gedta-na2(amresco)，溶入70ml超纯水，45℃水浴至gelatin完全溶解。调节ph至7.3，定容至100ml，0.22μm过滤后使用。兔红细胞的处理与计数：取脱纤维兔血，gvbe洗涤一次，gvb洗涤两次之后计数，然后稀释至5×108/ml。取25μl，加1ml纯水溶血之后测412nm吸收值为1.3左右。nhs(1/2)(健康人血清)制备：取出nhs，gvb对半稀释后冰浴备用。二、nhs(1/2)50％溶血剂量的确定正常情况下，涎酸可抑制b因子活性。家兔红细胞所含涎酸量低于其它动物的红细胞，可以激活血清中的b因子，引起旁路途径激活，导致兔红细胞溶解。在红细胞量一定时，在给定反应条件下，溶血程度与血清中参与旁路活化的补体量及活性呈正相关。按表1所示顺序及剂量依次在2ml圆底离心管(tube)中加入各种试剂，每一组做2个平行样，单位为μl。按顺序在冰浴中混合。转到37℃水浴，孵育30分钟，每5分钟振荡混匀一次。加入1ml冰冷的gvbe，混合并1000g离心3分钟。将上清转出，测量412nm吸收值。其中，tube1为背景样，其它结果要减去这个结果。tube2为100％溶血时的结果。tube3作为空白对照。每个管所得吸收值除以tube2吸收值即为溶血百分比。采用graphprism6进行曲线拟合，求得50％溶血所需nhs(1/2)体积为18μl。补体介导的红细胞溶血实验在50％溶血附近，“s”形曲线最陡，在此点附近溶血程度对补体活性的变化有最敏感的响应，因而取此点对应的nhs(1/2)使用量18μl作为以下溶血抑制活性实验的加入量。表1确定nhs(1/2)50％溶血剂量的实验方案三、溶血抑制活性实验cfh是一种重要的补体旁路途径的负调控因子，它决定补体c3b的命运，不论是在血管内或在细胞表面，控制c3转化酶的形成和其稳定性。因此在上述实验中，加入cfh会抑制血清中补体介导的旁路途径溶血活性。兔红细胞溶血抑制实验方法与上述实验相同，nhs的加入量以达到50％的溶血时的加入量为准。在100μl的反应体系中加入不同浓度的样品，30min反应结束后在412nm波长下测定吸光度值。对hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc、和人cfh的溶血抑制活性的比较结果如图11所示，根据曲线拟合结果，可获得各自的ic50值，如表2所示，其中7007指的是hscr(1-7)-hfc，7004指的是hscr(1-7)-mfc，7008指的是hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc。由实验结果可知，hscr(1-7)-hfc活性最高，为人cfh的5倍，其次为hscr(1-7)-mfc，也显著高于人cfh活性，hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc与人cfh活性相当，表明所设计的重组蛋白均具有预期的生物活性。表2溶血抑制活性实验结果(ic50值)检测样品ic5070070.074μm70080.33μm70040.086μm人cfh0.37μm实施例6、hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh辅助factori切割c3b活性比较cfh可辅助factori切割c3b的亚基(101kd)，在电泳图上形成68kd和43kd大小的条带。本实验比较hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc、hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc和人cfh辅助factori切割c3b活性，实验方法为：按表3所示实验方案在离心管(tube)中添加样品(添加过程保持冰浴)，混匀后37℃水浴，分别在5min和30min取10μl，加dtt至终浓度100mm，再加电泳上样缓冲液终止反应，然后进行8％sds-page电泳检测。以人cfh作为阳性对照，以pbs代替样品作为阴性对照。8％sds-page电泳结果如图12之a所示，以光密度分析c3bα亚基的切割率，并对各样品进行比较，比较结果如图12之b所示，可以看出，融合蛋白hscr(1-7)-hfc、hscr(1-7)-mfc的辅助factori切割c3b的活性均不低于对照人cfh，但在本实验中hscr(1-7)-hscr(18-20)-hfc的活性低于对照人cfh。表3辅助factori切割c3b活性比较的实验方案根据实施例4、实施例5和实施例6的结果，得出以下结论：hscr(1-7)-hfc和hscr(1-7)-mfc是本发明最优选的cfh-ig融合蛋白。综上所述，本发明将人cfh片段与免疫球蛋白fc片段融合形成新的结构，相比于自然的cfh，优选的cfh-ig融合蛋白具有更高的补体旁路途径抑制作用；而且融合蛋白中含有免疫球蛋白重链恒定区fc片段，能延长其在生物体内的半衰期，以减少给药次数，增加病人的用药顺应性。因此，本发明的cfh-ig融合蛋白可用于制备治疗人类由补体旁路途径介导、失调或缺陷所致的各类疾病，如自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎)或其它疾病(如缺血再灌注)，尤其是年龄相关性黄斑变性(amd)，阵发性睡眠性血红蛋白尿(pnh)，非典型溶血性尿毒综合症(ahus)和ii型膜增生性肾小球肾炎(membranoproliferativeglomerulonephritistypeii,mpgn-ii)或者致密物沉积病(densedepositdisease,ddd)，也可被涂在医疗装置尤其是与组织或体液(包括但不限于血液)直接接触的可植入式医疗装置如人工器官、心脏支架、起搏器、植入式传感-遥测系统、血液体外分流系统，以抑制其表面的补体过度激活而引起的血栓形成。现有技术中，虽然有些专利文献选择了cfh，或是全长cfh，或是不同cfh片段(如专利文献wo/2007/149567(cn101563363b)中的scr(1-5)，而本发明设计的cfh部分既含有能调节补体旁路途径的片段，或同时含有具有靶向被补体过度激活组织的作用的片段，具有双重作用，scr(1-7)其中的scr7和scr(18-20)其中的scr(19-20)是gag和crp结合域，可以与由于补体过度激活、c3b在其表面沉积的组织或细胞的gag或/crp结合，有效调节补体激活，，因此能把抑制补体激活的部分(scr1-4)靶向到有过度补体激活的组织或细胞表面。再者，本发明公开的cfh融合蛋白还含有免疫球蛋白重链恒定区fc片段，能延长其在生物体内的半衰期，以减少给药次数，增加病人的用药顺应性。总之，本发明利用补体因子h的多重功能公开了一种融合蛋白，既含有能调节补体系统尤其是补体旁路途径的片段，或同时含有具有靶向被补体过度激活组织的作用的片段，又含有免疫球蛋白重链恒定区fc片段以延长其在生物体内的半衰期。序列表<110>江苏匡亚生物医药科技有限公司<120>具有补体调节活性的重组补体因子h-免疫球蛋白融合蛋白及其制备方法与应用<130>cgcnb165189w<160>14<210>1<211>1213<212>prt<213>人全长cfh<400>1gluaspcysasngluleuproproargargasnthrgluileleuthr151015glysertrpseraspglnthrtyrprogluglythrglnalailetyr202530lyscysargproglytyrargserleuglyasnvalilemetvalcys354045arglysglyglutrpvalalaleuasnproleuarglyscysglnlys505560argprocysglyhisproglyaspthrpropheglythrphethrleu65707580thrglyglyasnvalpheglutyrglyvallysalavaltyrthrcys859095asngluglytyrglnleuleuglygluileasntyrargglucysasp100105110thraspglytrpthrasnaspileproilecysgluvalvallyscys115120125leuprovalthralaprogluasnglylysilevalserseralamet130135140gluproaspargglutyrhispheglyglnalavalargphevalcys145150155160asnserglytyrlysilegluglyaspgluglumethiscysserasp165170175aspglyphetrpserlysglulysprolyscysvalgluilesercys180185190lysserproaspvalileasnglyserproileserglnlysileile195200205tyrlysgluasngluargpheglntyrlyscysasnmetglytyrglu210215220tyrsergluargglyaspalavalcysthrgluserglytrpargpro225230235240leuprosercysgluglulyssercysaspasnprotyrileproasn245250255glyasptyrserproleuargilelyshisargthrglyaspgluile260265270thrtyrglncysargasnglyphetyrproalathrargglyasnthr275280285alalyscysthrserthrglytrpileproalaproargcysthrleu290295300lysprocysasptyrproaspilelyshisglyglyleutyrhisglu305310315320asnmetargargprotyrpheprovalalavalglylystyrtyrser325330335tyrtyrcysaspgluhisphegluthrproserglysertyrtrpasp340345350hisilehiscysthrglnaspglytrpserproalavalprocysleu355360365arglyscystyrpheprot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