本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一种菌剂及其在脱除呕吐毒素中的应用、一种饲料或添加剂和一种脱除呕吐毒素的方法。
背景技术：
：呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)，化学名称为3α,7α,15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，由于它可以引起猪的呕吐而得名，主要是由禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)、黄色镰刀菌(fusariumculmorum)感染小麦、大麦、燕麦、玉米等谷物产生的单端孢霉烯族毒素。在全世界范围内，呕吐毒素是粮食、饲料、食品的主要污染霉菌毒素之一，严重影响人和牲畜的健康。人畜摄入了被呕吐毒素污染的食物后，会导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状，严重时损害造血系统造成死亡，其严重危害性已经引起了各国的普遍重视。呕吐毒素对我国谷物类原料的污染相当普遍，其检出率和检出量都是霉菌毒素中最高的一种，据甄阳光等人调查显示，中国饲料和原料呕吐毒素的超标比例接近70％，玉米中呕吐毒素的超标率为57.1％，毒素平均含量为1.01mg/kg，最高含量为2.13mg/kg。由于呕吐毒素在谷物、饲料中的普遍存在性、高含量特性和急慢性毒性，降低或者去除其毒性显得尤为重要与迫切。目前，国内外呕吐毒素脱毒方法主要有物理法、化学处理和生物方法三大类。虽然物理、化学方法脱毒已经取得一定程度的成功，但仍然存在脱毒效果有限、可能造成重要营养物质的丢失、成本较高等缺点。生物方法具有可以在温和的条件下使毒素的毒力降低，而且对原料的感官性状、适口性等影响极小等优点，被认为是最佳脱毒方法。由于微生物种类多，来源广泛，几乎所有的有机污染物都可以被微生物分解，并且具有脱除彻底、无二次污染的优点，所以呕吐毒素的微生物脱毒是一种行之有效的脱毒方法。随着物理、化学脱毒手段的弊端不断出现和对迅猛发展的生物技术优点的认识增加，国内外利用微生物进行毒素脱毒的研究正在逐步展开，虽然有关用微生物脱毒的研究成果还不多，但现有成果均表现了良好的开发和应用前景。综上所述，为解决谷物、饲料等中的呕吐毒素的污染问题，有必要研发一种节能环保且能够高效、安全脱除呕吐毒素的微生物菌剂，以提高谷物和/或饲料利用率，保证畜牧业的安全生产，提高畜牧业经济效益。技术实现要素：本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种菌剂及其在脱除呕吐毒素中的应用以及饲料或添加剂和脱除呕吐毒素的方法。为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种菌剂，该菌剂包括酵母菌和杆菌，以干重计，酵母菌和杆菌的重量比为1：(0.5-15)。第二方面，本发明提供了本发明所述的菌剂在脱除呕吐毒素中的应用。第三方面，本发明提供了一种饲料或添加剂，该饲料或添加剂含有本发明所述的菌剂。第四方面，本发明提供了一种脱除呕吐毒素的方法，该方法包括：将本发明所述的菌剂与呕吐毒素污染的样品接触，以脱除样品中的呕吐毒素。本发明将酵母菌和杆菌进行配合使用，由此得到的菌剂能够高效脱除呕吐毒素，具有成本低、环保易操作、呕吐毒素脱除安全、高效等优点。本发明提供的菌剂可以用于谷物和/或饲料等呕吐毒素污染的样品中呕吐毒素的脱除，对于解决谷物和/或饲料中呕吐毒素污染问题、提高谷物和/或饲料利用率、保证畜牧业的安全生产、提高畜牧业经济效益具有重要的意义。其中，根据本发明的一种优选的实施方式，菌剂中的杆菌为保藏编号为cgmccno.13139的枯草芽孢杆菌和/或保藏编号为cgmccno.13314的地衣芽孢杆菌时，该杆菌与酵母菌配合使用，能够明显提高呕吐毒素的脱除率。本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物保藏本发明的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，于2016年10月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为cgmcc)，保藏编号为cgmccno.13139。本发明的地衣芽孢杆菌(bacilluslincheniformis)，于2016年11月16日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为cgmcc)，保藏编号为cgmccno.13314。具体实施方式以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。第一方面，本发明提供了一种菌剂，该菌剂包括酵母菌和杆菌，以干重计，酵母菌与杆菌的重量比为1：(0.5-15)。此处需要说明的是，本发明所述的菌剂中包括的各微生物既可为各微生物的活菌体，也可为各微生物的死菌体，优选使用各微生物的活菌体。特别的，当所使用的微生物为潜在的致病菌时，优选使用该微生物的死菌体。另外的，当所使用的微生物为潜在的致病菌时，也可以使用常规的技术对其进行减毒处理，从而使用其减毒的活菌体。根据本发明的菌剂，当优选为活菌体时，每克所述菌剂所含的总活菌数优选为0.5×109cfu-1.5×109cfu。为了进一步提高菌剂对呕吐毒素的脱除效果，优选情况下，以干重计，酵母菌和杆菌的重量比为1：(1-10)，进一步优选为1：(2-6)。本发明的菌剂中，优选情况下，杆菌为地衣芽孢杆菌(bacilluslincheniformis)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酪短杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌和保加利亚乳杆菌中的至少一种。其中，本发明的发明人在研究中惊奇发现，菌剂中的杆菌为枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌时，能够进一步提高菌剂对呕吐毒素的脱除效果，而当杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌，且混合菌中以干重计的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的重量比为(0.1-10)：1时，能够更进一步提高菌剂对呕吐毒素的脱除效果；当混合菌中以干重计的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的重量比为(3-8)：1时，能够再进一步提高菌剂对呕吐毒素的脱除效果。因此，优选情况下，杆菌为枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌，进一步优选为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌，其中，混合菌中，以干重计，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的重量比为(0.1-10)：1，更进一步优选为(3-8)：1。同时，本发明的发明人还进一步发现，保藏编号为cgmccno.13139的枯草芽孢杆菌能够在前述基础上更进一步提高菌剂对呕吐毒素的脱除效果，因此，为了在前述基础上更进一步提高菌剂对呕吐毒素的脱除效果，优选情况下，使用保藏编号为cgmccno.13139的枯草芽孢杆菌。同时，本发明的发明人还进一步发现，保藏编号为cgmccno.13314的地衣芽孢杆菌能够在前述基础上更进一步提高菌剂对呕吐毒素的脱除效果，因此，为了在前述基础上更进一步提高菌剂对呕吐毒素的脱除效果，优选情况下，地衣芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.13314。根据本发明的菌剂，其还含有用于培养各微生物的培养基成分。其中，用于酵母菌培养的培养基可以为本领域常规的培养基，例如，ypd培养基(酵母膏10g/l，蛋白胨20g/l，直接将各组分混匀灭菌后加入20g/l灭菌葡萄糖即可，另外根据需要可加入20g/l的琼脂)。用于杆菌培养的培养基可以为本领域常规的培养基，例如，lb培养基(牛肉膏或酵母粉3-8g/l，蛋白胨5-15g/l，氯化钠3-8g/l，ph7.0-7.2，直接将各组分混匀灭菌即可)。本发明中，优选情况下，酵母菌为假丝酵母、亚罗酵母、丝孢酵母、黑酵母、红酵母、地生酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、克鲁维酵母和多型汉逊酵母中的至少一种；进一步优选地，酵母菌为产朊假丝酵母(candidautilis)、解脂亚罗酵母(yarrowialipolytica)、粘性丝孢酵母(trichosporonmucoides)、产普鲁兰酵母(areobasidiumpullulans)、红酵母(rhodotorulaglutinis)、地生隐球酵母(cryptococcusterreus)和季氏毕赤酵母(pichiaguilliermondii)中的至少一种。本发明中，酵母菌和杆菌的各种菌株均可通过商购获得，也可通过正规的其他途径进行获取。本发明中，为了方便使用，优选情况下，所述菌剂为粉剂。其中，菌剂中含有的酵母菌和杆菌可以混合在一起包装，也可以各自独立包装，然后在使用时再进行混合。本发明还提供了上述菌剂的制备方法，该方法包括：分别将如上所述的酵母菌和杆菌接种于相应的培养基中进行培养，将得到的培养物分别制成干粉后按照如上的比例进行复配，得到本发明的菌剂。本发明中，所述酵母菌和杆菌接种于培养基中进行培养的方法可以在很大范围内改变，例如，该方法可以包括：在各自独立的培养体系中分别培养酵母菌和杆菌；并将分别培养得到的酵母菌和杆菌制成干粉后按照比例进行混合，得到所述微生物菌剂。制成干粉的方法为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。第二方面，本发明提供了上述菌剂在脱除呕吐毒素中的应用。第三方面，本发明还公开了一种饲料或添加剂，其中，该饲料或添加剂含有如上所述的菌剂。根据本发明，所述饲料或添加剂中含有的菌剂优选以干粉的形式存在。在优选的实施方案中，饲料或添加剂以至少0.001g/kg、至少0.01g/kg、至少0.1g/kg、至少1g/kg、至少5g/kg、至少7.5g/kg、至少10.0g/kg、至少15.0g/kg、至少20.0g/kg、至少25.0g/kg的水平含有所述菌剂。进一步优选地，相对于1kg的饲料或添加剂，所述菌剂的用量为1-30g。在此均以干重计。根据本发明，所述饲料和添加剂中还含有生理学上可接受的载体，其中，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、na2so4、滑石粉和pva以及它们的混合物。对本领域技术人员显而易见的是，可将这些添加剂添加至污染有呕吐毒素的饲料材料以减少动物消费的饲料中存在的呕吐毒素水平。本发明的饲料材料可以包括：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦、稻谷以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍、玉米或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(ddgs)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳，棕榈仁和柑橘渣；c)青贮饲料；d)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)从植物和动物来源获得的油和脂肪；f)矿物质和维生素。对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明的饲料或添加剂可还包含其他组分如稳定剂和/或增量剂和/或酶类。优选地，制备根据本发明的饲料或添加剂的方法包括混合步骤，该混合步骤包括混合所述菌剂，任选与至少一种生理上可接受的载体一起混合。对技术人员显而易见的是，作为预防步骤，可将添加剂添加至任何饲料材料。例如，所述饲料或添加剂为养殖动物的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、嗜热链球菌和米曲霉中的至少一种。例如，所述饲料为青贮饲料或牛饲料时，所述饲料还含有另外的杆菌，所述另外的杆菌为产丙酸丙酸杆菌(propionibacteriumacidipropionici)、布氏乳杆菌(lactobacillusbuchneri)和副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)中的至少一种。例如，所述饲料或添加剂为肉鸡、生长育肥猪和水产养殖动物的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有另外的杆菌，所述另外的杆菌为凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)。例如，所述饲料或添加剂为肉鸡、肉鸭、猪或虾的饲料或添加剂时，所述饲料或添加剂还含有另外的杆菌，所述另外的杆菌为侧孢短芽孢杆菌(brevibacilluslaterosporu)。第四方面，本发明还提供了一种脱除呕吐毒素的方法，其中，该方法包括：将如上所述的菌剂与呕吐毒素污染的样品接触，以脱除样品中的呕吐毒素。根据本发明，所述接触优选在所述菌剂能够存活的条件下进行。其中，术语“所述菌剂能够存活”是指在呕吐毒素污染的样品中，至少大约20％，优选至少大于40％，更优选至少大于60％的菌体能够存活。术语“菌剂能够存活的条件”是指至少包括碳源、氮源和无机盐的能够维持菌体生命力的条件。根据本发明，所述呕吐毒素污染的样品可以包括任何呕吐毒素污染的样品，例如，可以为谷物和/或饲料等。优选情况下，相对于1kg的谷物和/或饲料，谷物和/或饲料以至少0.001g/kg、至少0.01g/kg、至少0.1g/kg、至少1g/kg、至少5g/kg、至少7.5g/kg、至少10.0g/kg、至少15.0g/kg、至少20.0g/kg、至少25.0g/kg的水平添加所述菌剂。进一步优选地，相对于1kg的谷物和/或饲料，所述菌剂的用量为1-30g。在此均以干重计。其中，谷类可以为小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦、稻谷以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍、玉米或高粱，饲料可以为前述谷物加工而成的饲料。根据本发明，对于加入至所述呕吐毒素污染的样品中的菌剂的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述菌剂能够在所述呕吐毒素污染的样品中起作用并且对所述呕吐毒素有效地脱除即可，加入的所述菌剂的形式，例如，可以为培养至对数期的活化菌体(菌悬液或菌体沉淀)，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉。实施例以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但并不因此限制本发明。以下制备例、实施例和对比例中，如无特别说明，各材料均可商购获得，各方法均为本领域的常规方法。ypd培养基：酵母膏10克，蛋白胨20克，补足水分至900毫升115℃灭菌20min，然后加入100毫升灭菌后的葡萄糖溶液(浓度为20g/100ml)，混匀。lb培养基：牛肉膏5克，蛋白胨10克，氯化钠5克，补足水分至1000毫升115℃灭菌20min备用，ph7.0-7.2。粘性丝孢酵母cicc32858、解脂亚罗酵母cicc1441、产朊假丝酵母cicc1314、乳酪短杆菌cicc23944均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。枯草芽孢杆菌bncc188062、地衣芽孢杆菌bncc337190购自苏州北纳保藏中心(benaculturecollection)，隶属于苏州北纳创联生物技术有限公司。制备例将活化的酵母菌以1体积％的接种量接种在液体ypd培养基中，于150rmp、30℃条件下培养，培养的时间使酵母菌浓度为(1±0.1)×109cfu/ml。将活化的杆菌以1体积％的接种量接种在液体lb培养基中，于150rmp、30℃条件下培养，培养的时间使杆菌浓度为(1±0.1)×109cfu/ml。然后分别制成干粉，每克各自的干粉中所含的总活菌数为(1±0.1)×109cfu，并按表1所述各配比进行复合菌剂的配制。表1实施例1-9用于说明本发明提供的菌剂对呕吐毒素的脱除作用。按照表1中各实施例的配比进行菌剂的配制，向1kg污染有20ppm呕吐毒素的玉米粉中加入30g各实施例配制的菌剂作为试验组，以不加入菌剂的1kg污染呕吐毒素的相同玉米粉作为对照组，并向各试验组和对照组分别加入1kg蒸馏水，每组做三个重复，混合均匀后于37℃、ph7下脱毒1天。分别从各试验组和对照组称量样品，按照《gb/t30956-2014饲料中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定免疫亲和柱净化－高效液相色谱法》测定处理1天后各样品中呕吐毒素的含量，并计算脱除率，结果见表2。其中，对照组无任何降解脱除现象。其中，呕吐毒素脱除率＝(样品中呕吐毒素初始浓度-处理后样品中呕吐毒素浓度)/样品中呕吐毒素初始浓度×100％。实施例10按照实施例1的方法，不同的是，被污染的玉米粉中呕吐毒素的含量为10ppm。呕吐毒素脱除率见表2。实施例11按照实施例1的方法，不同的是，被污染的玉米粉中呕吐毒素的含量为100ppm。呕吐毒素脱除率见表2。对比例1本对比例用于说明参比的菌剂对呕吐毒素的脱除作用。按照实施例1的方法，不同的是，所使用的菌剂完全由粘性丝孢酵母cicc32858组成。结果见表2。对比例2本对比例用于说明参比的菌剂对呕吐毒素的脱除作用。按照实施例1的方法，不同的是，所使用的菌剂完全由乳酪短杆菌cicc23944组成。结果见表2。表2编号呕吐毒素脱除率(％)实施例1100实施例2100实施例3100实施例490.4实施例594.3实施例687.6实施例792.5实施例890.2实施例985.1实施例10100实施例1188.9对比例155.6对比例251.8由以上表2的数据可以看出，将酵母菌和杆菌进行组合使用，能够高效地脱除呕吐毒素，且本发明的菌剂能够简便地处理或者添加到呕吐毒素污染的谷物和/或饲料中，从而能够有效降低呕吐毒素污染的谷物和/或饲料中呕吐毒素的含量，能够提高谷物和/或饲料利用率、有利于饲养动物的健康，保证畜牧业的安全生产。将表1中实施例1与实施例4的结果比较可知，以干重计，酵母菌和杆菌的重量比为1：(2-6)时，能够更进一步提高对呕吐毒素的脱除率。将表1中实施例1与实施例5、7-8的结果比较可知，菌剂中杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌，且混合菌中以干重计的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的重量比为(3-8)：1时，能够更进一步提高对呕吐毒素的脱除率。将表1中实施例1与实施例6、9的结果比较可知，菌剂中杆菌为枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，且枯草芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.13139，地衣芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.13314时，能够更进一步提高对呕吐毒素的脱除率。将表1中实施例1与实施例10-11的结果比较可知，本发明的菌剂对于不同含量的呕吐毒素，均有优异的脱除效果。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。当前第1页12