本发明涉及微生物领域，具体地，涉及一株枯草芽孢杆菌、含有该菌的菌剂及其应用、降解玉米赤霉烯酮的方法和试剂盒。
背景技术：
玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)是由镰刀菌产生并释放到土壤环境中的真菌毒素，它是世界上污染范围最广泛的一种镰刀菌毒素。1999年，d.mello等人研究发现，zen能够降低怀孕动物的胚胎成活率及新生胎儿的出生率。zen对人体的影响主要是引发肿瘤、诱导dna收缩、导致染色体失常等。此外，zen可与17β-雌二醇受体结合，导致脂肪氧化反应、细胞凋亡并导致蛋白质和dna合成的抑制，还可以抑制其它大分子的生物合成。
玉米赤霉烯酮作为世界上污染粮油或饲料最广泛的真菌毒素之一，在欧洲、非洲、北美洲、南美洲等世界各地的谷物中以及农副产品中都检测到了zen的存在。zen可以通过污染谷类等农作物，进而进入人或动物体内，危害人和动物的健康，造成巨大的经济损失。同时，zen本身具有分布广、繁殖快、耐热、毒性大、残留时间长等问题，已经引起了全世界的关注。目前，大部分国家对粮油或饲料中的zen含量都作了十分严格的规定，例如，澳大利亚规定谷物中zen的含量不能超过50ng/g；意大利规定在谷物和谷类产品当中zen的含量不能超过100ng/g；在法国，植物油和谷类当中zen的含量必须低于200ng/g。
目前，去除zen毒素的方法主要分为物理法、化学法和生物法。物理法包括机械分离处理、高温失活、放射处理或吸附剂等；化学法是通过酸碱溶液或其它化合物对毒素进行处理。然而，通过物理和化学处理以去除zen的方法具有局限性。例如，通过热处理，不能有效地使zen钝化；通过挤出和使用氧化剂进行处理，虽然可以在一定程度上降低zen的含量，但是在饲料和食品的制备过程中采用挤出方法和使用氧化剂(如臭氧或过氧化氢)，由于成本较高、处理样品的品质损失、效率和特异性较低而受到限制。总之，由于物理法存在着成本高、操作难、处理后的产物可能对粮油、饲料或环境造成污染等缺点，化学法可能会改变饲料的性状，产生有害残留物，从而存在食品安全问题等缺陷，从而限制了这两种方法在实际生产中的应用。
生物法主要是利用微生物或其降解产物进行毒素降解的过程，具有对原料的感官性状、适口性、营养物质影响较小等优点，同时，还具有安全、环保、高效的特点，因此，利用生物法去除粮油或/饲料中zen的研究具有良好的应用前景。目前，研究报道表明多种真菌(例如，粉红粘帚霉、米根霉、匍枝根霉、少根根霉、黑曲霉、解毒毛孢酵母等)能够生物降解zen，但是关于细菌降解zen的报道仍较少。
在现有技术中，cn103937681a公开了一株食品级黑曲霉及其在玉米赤霉烯酮降解中的应用，将该黑曲霉在适宜的条件(28℃，菌液接种量2％)与终浓度为2ppm的zen共培养48h，zen的降解率为89.56％。cn103981134a公开了一株枯草芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用，将该枯草芽孢杆菌在适宜的条件(28℃)下与终浓度为2ppm的zen共培养72h，zen的降解率为92.75％。cn103981133a公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的应用，将该株解淀粉芽孢杆菌在适宜的条件(28℃)下与终浓度为5ppm的zen共培养72h，zen的降解率为95.99％。可见，现有的微生物降解zen的方法降解时间均较长，且降解率尚有待提高。
另外，现有的降解zen的微生物大多是在温和的条件(如28℃，ph为7左右)下进行，然而，在较高的温度负荷下(如在容器中进行运输期间或在饲料粒化期间的情况下)或苛刻的酸碱性条件下尚无较好的解决办法，这就限制了生物法在降解zen中的应用范围。
因此，有必要寻找一种高效的且安全性高的，并且在较高的温度负荷或苛刻的酸碱条件下可以快速降解zen毒素的微生物。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有的玉米赤霉烯酮降解过程中存在的上述缺陷，提供了一株枯草芽孢杆菌、含有该菌的菌剂及其应用和降解玉米赤霉烯酮的方法。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，其中，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.13138。
第二方面，本发明还提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有上述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。
第三方面，本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌和/或菌剂在降解玉米赤霉烯酮毒素中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种降解玉米赤霉烯酮的方法，其中，该方法包括：将上述枯草芽孢杆菌和/或上述菌剂与玉米赤霉烯酮污染的样品接触，以降解样品中的玉米赤霉烯酮。
第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述枯草芽孢杆菌和/或上述菌剂。
本发明提供的枯草芽孢杆菌可以高效且快速地降解粮油和/或饲料中的zen，特别是，即使粮油和/饲料中的zen含量高达50ppm时，该枯草芽孢杆菌也可以高效且快速地降解zen，并且对粮油和/或饲料的适口性无影响(即处理前后口味基本无差异)；同时，将该枯草芽孢杆菌添加至受zen污染的粮油和/或饲料中，具有安全性。因此，该枯草芽孢杆菌具有良好的应用前景。
此外，本发明提供的枯草芽孢杆菌还具有高温和酸碱稳定性，这进一步扩大了其应用的范围。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明提供的菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，并于2016年10月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为cgmcc)，保藏编号为cgmccno.13138。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，其中，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为cgmccno.13138。
本发明提供的枯草芽孢杆菌分离自受zen污染的土壤样本(例如，采集地为北京)。所述枯草芽孢杆菌的分离可以采用本领域常规的用于新菌株分离的方法，例如可以为液相富集法或土壤环流法。
液相富集法具体可以包括：称取适量受zen污染土壤样品加入到装有lb液体培养基的三角瓶中，加入适量玻璃珠。将三角瓶在28-37℃，160-180rpm下振荡；将土壤混合液转入离心管，取离心后的上清液作为zen钝化微生物的来源。将所述上清液接种到含有zen的lb液体培养基中，在28-37℃，160-180rpm下振荡培养。用无菌吸管吸取1-2ml，移入另一个富集培养三角瓶中。如此转移三次后，将上清液分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8倍，吸取适量涂布于含有50、100、200或300mg/l的zen的lb固体培养基上进行平板划线，28-37℃培养3-4天后，分离单菌落。
土壤环流法具体可以包括：称取100g受zen污染土壤与适量粒径约为3mm的砂粒混合均匀，置于环流装置的上层。下层装入lb培养基200ml作为环流液。启动空气压缩机，开始驯化过程，期间根据环流液的蒸发情况定期补加环流液。驯化结束后，将下层环流液分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8倍，吸取适量涂布于含有50、100、200或300mg/l的zen的lb固体培养基上进行平板划线，28-37℃培养3-4天后，分离单菌落。
本发明从筛选出的菌株中选取一株对zen降解作用最强的细菌进行了dna提取与鉴定，鉴定结果显示该菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，可以确定该菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，并于2016年10月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13138。
本发明提供的枯草芽孢杆菌经过培养能够产生大量的枯草芽孢杆菌的活菌体。本发明对培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述枯草芽孢杆菌大量增殖即可，例如可以按照107cfu/ml的接种量将枯草芽孢杆菌的活菌体接种于培养基中，并且在好氧条件下，在28-38℃的温度下培养12-48小时后，得到培养液。其中，所述培养基可以为本领域常规使用的培养基，例如，可以为lb液体培养基(0.8-1重量％蛋白胨，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化钠；ph为6.8-7.0；培养温度为28-30℃)或营养肉汤培养基(0.8-1重量％蛋白胨，0.3-0.5重量％牛肉膏，0.5-0.8重量％氯化钠；ph为7.2-7.6；培养温度为28-30℃)。优选为lb液体培养基。
本发明可以进一步分离上述培养液中的枯草芽孢杆菌的菌体，对所述分离的方法没有特别的限制，只要能够从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域的常规条件。
第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有上述枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。
在本发明中，对所述菌剂中枯草芽孢杆菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。
根据本发明，所述菌剂含有所述枯草芽孢杆菌的活菌体和/或死菌体。优选地，所述菌剂含有所述枯草芽孢杆菌的活菌体或者活菌体和死菌体的混合菌体。当所述菌剂含有所述枯草芽孢杆菌的活菌体和死菌体的混合菌体时，优选为活菌体的数量高于死菌体的数量。最优选为所述菌剂含有所述枯草芽孢杆菌的活菌体。
根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述菌剂可以为液态菌剂和/或固态菌剂，优选为菌液或者冻干后的菌体。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。
另外，本发明的发明人在研究过程中发现，虽然本发明提供的枯草芽孢杆菌是在高浓度zen(至少50ppm)的条件下筛选得到的，但其对土壤中常见的其他真菌毒素污染(如呕吐毒素、黄曲霉毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、t2毒素等)均有一定的降解作用。
第三方面，本发明还提供了上述枯草芽孢杆菌和/或上述菌剂在降解玉米赤霉烯酮毒素中的应用，优选为在降解粮油和/或饲料中的玉米赤霉烯酮中的应用。
第四方面，本发明还提供了一种降解玉米赤霉烯酮的方法，其中，该方法包括：将上述枯草芽孢杆菌和/或上述菌剂与玉米赤霉烯酮污染的样品接触，以降解样品中的玉米赤霉烯酮。
根据本发明，所述玉米赤霉烯酮污染的样品可以为玉米赤霉烯酮污染的粮油和/或饲料。
在优选的情况下，以所述玉米赤霉烯酮污染的样品的总重量为基准，所述玉米赤霉烯酮的含量至少为1ppm，优选至少为10ppm，更优选至少为20ppm，进一步优选至少为50ppm，最优选至少为200ppm。在本发明中，当所述待处理的样品为液体时，“ppm”表示的是“μg/ml”；当所述待处理的样品为固体时，“ppm”表示的是“μg/g”。
在本发明中，术语“粮油”是指对谷类、豆类等粮食和油料及其加工成品和半成品的统称，特别是指人类可以食用的产品。例如，所述粮油可以为本领域常见的人类可以食用的粮油产品，具体地，所述粮油可以包括谷物及其农副产品、油和脂肪制品、酒类、奶及其制品等中的至少一种。
在本发明中，术语“饲料”是指农业或牧业饲养的动物的食物的总称。例如，所述饲料可以为本领域常见的饲养动物所使用的食物，具体地，所述饲料可以包括：a)谷类，例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(ddgs)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳，棕榈仁和柑橘渣；c)青贮饲料；d)得自如下来源的蛋白质：例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；e)从植物和动物来源获得的油和脂肪；f)矿物质和维生素。
在本发明中，所述粮油或饲料还可以含有生理学上可接受的载体，其中，所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、na2so4和滑石粉以及它们的混合物。
在本发明中，对所述枯草芽孢杆菌和/或菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述枯草芽孢杆菌和/或菌剂可以为液态和/或固态。其中，在何种剂型中添加何种赋形剂为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。
根据本发明，相对于1g所述样品，所述枯草芽孢杆菌和/或所述菌剂中的菌体数至少为107cfu，优选地，所述枯草芽孢杆菌和/或所述菌剂中的活菌体数至少为107cfu。在本发明中，菌体数可以按照gb4789.2-94进行测定。
根据本发明，所述接触的条件可以包括：温度为20-80℃，ph值为3-9，时间至少为1h；优选地，温度为25-70℃，ph值为4-9，时间为1-48h；更优选地，温度为30-60℃，ph值为5-9，时间为1-24h；进一步优选地，温度为30-50℃，ph值为5.5-8.5，时间为1-12h；最优选地，温度为30-40℃，ph值6-8，时间为1-6h。
在本发明中，当所述样品为固体时，所述ph值按照gb/t12456-2008的方法进行测定。
第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述枯草芽孢杆菌和/或上述菌剂。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
在以下制备例、制备对比例、实施例和对比例中：
zen标准品购自sigma公司，货号为z2125；其余所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到；
lb液体培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，去离子水定容至1l，调节ph至7；
lb固体培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，16g琼脂粉，去离子水定容至1l，调节ph至7；
本发明提供的菌株为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，并于2016年10月24日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为cgmcc)，保藏编号为cgmccno.13138；
参比菌株1为保藏编号为cgmccno.9463的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，购自cgmcc；
参比菌株2为保藏编号为cgmccno.8726的解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，购自cgmcc；
参比菌株3为保藏编号为cctccm2013703的黑曲霉(aspergillusniger)，购自中国典型培养物保藏中心(保藏单位的缩写为cctcc)；
菌体数可以按照gb4789.2-94进行测定；
按照gb/t2876-2012的方法测定zen的含量，其中，zen的降解率(％)按照下式计算：
zen的降解率(％)＝(处理前样品中zen的质量-处理后样品中zen的质量)/处理后样品中zen的质量×100％。
制备例1
将本发明提供的保藏编号为cgmccno.13138的枯草芽孢杆菌(菌株a)的活菌体以1体积％接种于经121℃灭菌15min的lb液体培养基中，在160rpm，30℃条件下振荡培养12h，得到菌体浓度为1×109cfu/ml的菌液a。
菌液a经冻干处理后制成菌粉a，每克菌粉a中含有的菌体数为1×109cfu。
制备对比例1
按照107cfu/ml的接种量将本发明提供的参比菌株1枯草芽孢杆菌(菌株d1)的活菌体以1体积％接种于经121℃灭菌15min的lb液体培养基中，在160rpm，30℃条件下振荡培养12h，得到菌体浓度为1×107cfu/ml的菌液d1。
菌液d1经冻干处理后制成菌粉d1，每克菌粉d1中含有的菌体数为1×109cfu。
制备对比例2
按照107cfu/ml的接种量将本发明提供的参比菌株2解淀粉芽孢杆菌(菌株d2)的活菌体以1体积％接种于经121℃灭菌15min的nb液体培养基(蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，去离子水定容至1l，调节ph至7)中，在160rpm，30℃条件下振荡培养12h，得到菌体浓度为1×107cfu/ml的菌液d2。
菌液d2经冻干处理后制成菌粉d2，每克菌粉d2中含有的菌体数为1×109cfu。
制备对比例3
按照107cfu/ml的接种量将本发明提供的参比菌株3黑曲霉(菌株d3)的活菌体以1体积％接种于经121℃灭菌15min的pdb液体培养基(马铃薯300g，葡萄糖20g，去离子水定容至1l，调节ph至7)中，在160rpm，30℃条件下振荡培养12h，得到菌体浓度为1×107cfu/ml的菌液d3。
菌液d3经冻干处理后制成菌粉d3，每克菌粉d3中含有的菌体数为1×109cfu。
实施例1
本实施例用于说明本发明提供的枯草芽孢杆菌降解玉米赤霉烯酮的能力。
①降解时间测定
取制备例1得到的菌液a980μl置于1.5ml离心管中，加入zen标准品溶液，使zen标准品的终浓度为50ppm，混合均匀，得到混合液。
将上述混合液于30℃、ph为7的条件下进行反应，分别在反应30min、1h、2h、4h和6h时取反应的样品20μl进行高效液相色谱检测zen的残留。结果如表1所示。
通过表1的结果可知，反应1h可以使zen的降解率达90％以上。因此，在接下来的实验中以1h作为反应时间。
②热稳定性测定
将菌液a分别于40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，ph为7的条件下处理30min后，分别取上述处理后的菌液a980μl置于1.5ml离心管中，加入zen标准品溶液，使zen标准品的终浓度为50ppm，混合均匀，得到混合液。然后再将上述混合液于30℃、ph为7的条件下反应1h，反应完成后，取样品20μl进行高效液相色谱检测zen的残留。结果如表2所示。
通过表2的结果可知，菌液a在40-60℃下保存30min仍具有较高的zen降解活性。
③酸碱稳定性测定
将菌液a分别于ph为2、3、4、5、6、7、8和9，30℃下处理30min后，分别取上述处理后的菌液a980μl置于1.5ml离心管中，加入zen标准品溶液，使zen标准品的终浓度为50ppm，混合均匀，得到混合液。然后再将上述混合液于30℃、ph为7的条件下反应1h，反应完成后，取样品20μl进行高效液相色谱检测zen的残留。结果如表3所示。
通过表3的结果可知，菌液a在ph值为3-9下保存30min仍具有较高的zen降解活性。
对比例1-3
按照实施例1的方法进行测定，所不同的是，分别使用制备对比例1-3制备得到菌液d1-3代替实施例1中使用的菌液a。
降解时间测定的结果如表1所示，热稳定性测定的结果如表2所示，酸碱稳定性的结果如表3所示。
表1
表2
表3
测试实施例1
将由制备例1得到的菌粉a10g与1kg受zen污染的谷物在30℃相混合(混合物中zen的终浓度为50ppm，按照gb/t12456-2008的方法测定谷物的ph值为6)，加入1kg蒸馏水，做三个重复，混合6h后，经高效液相色谱检测谷物中zen的降解率为95.7％。并且，菌粉a的添加未对谷物的适口性产生任何的影响。
使用以上经处理后的谷物喂养猪14天，结果表明，在此期间，猪的饮食、饮水和日常活动均表现正常，并且猪的体重也一直保持稳定增长的趋势。以上结果说明将菌粉a添加至谷物中用于猪的饲养，具有安全性。
测试实施例2
将由制备例1得到的菌粉a10g与1kg受zen污染的谷物相混合(混合物中zen的终浓度为20ppm，按照gb/t12456-2008的方法测定谷物的ph值为6)，混合6h后经高效液相色谱检测zen的降解率为98.8％。并且，菌粉a的添加未对谷物的适口性产生任何的影响。
使用以上经处理后的谷物喂养猪14天，结果表明，在此期间，猪的饮食、饮水和日常活动均表现正常，并且猪的体重也一直保持稳定增长的趋势。以上结果说明将菌粉a添加至谷物中用于猪的饲养，具有安全性。
测试实施例3
将由制备例1得到的菌粉a10g与1kg受zen污染的谷物相混合(混合物中zen的含量为10ppm，按照gb/t12456-2008的方法测定谷物的ph值为6)，混合6h后经高效液相色谱检测zen的降解率为100％。并且，菌粉a的添加未对谷物的适口性产生任何的影响。
使用以上经处理后的谷物喂养猪14天，结果表明，在此期间，猪的饮食、饮水和日常活动均表现正常，并且猪的体重也一直保持稳定增长的趋势。以上结果说明将菌粉a添加至谷物中用于猪的饲养，具有安全性。
测试对比例1
按照测试实施例1的方法进行，所不同的是，使用菌粉d1代替菌粉a。经高效液相色谱检测zen的降解率为60.4％。
测试对比例2
按照测试实施例1的方法进行，所不同的是，使用菌粉d2代替菌粉a。经高效液相色谱检测zen的降解率为54.3％。
测试对比例3
按照测试实施例1的方法进行，所不同的是，使用菌粉d3代替菌粉a。经高效液相色谱检测zen的降解率为52.9％。
通过以上实施例1与对比例1-3的结果相比较可知，本发明提供的枯草芽孢杆菌可以高效且快速地降解粮油和/或饲料中的zen，并且该枯草芽孢杆菌还具有高温和酸碱稳定性。
通过以上测试实施例1与测试对比例1-3的结果相比较可知，即使将本发明提供的枯草芽孢杆菌应用于zen含量高达50ppm的粮油和/饲料中，该枯草芽孢杆菌也可以高效且快速地降解zen，并且对粮油和/或饲料的适口性无影响(即处理前后口味基本无差异)；同时，将该枯草芽孢杆菌添加至受zen污染的粮油和/或饲料中，具有安全性。因此，该枯草芽孢杆菌具有良好的应用前景。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。