本发明涉及一种角质酶的发酵与棉织物酶精炼工艺，属于微生物酶制剂领域。
背景技术：
棉纤维具有优良的服用性能，是一类重要的天然纺织纤维，其产品包括棉针织物、棉机织物。但在棉纤维的生长过程中，有一定量的起保护性作用的物质，以及生物代谢过程中生成的物质与纤维素共生共长，这些纤维素共生物主要有果胶物质、含氮物质、蜡状物质、天然色素等，还有在剥取棉纤维时夹带的棉籽壳。这些杂质称为棉织物上的天然杂质。棉纤维上的这些共生物会影响棉织物的手感、外观、白度等服用性能和吸水、染色等染整加工性能，因此，在染整加工的前处理中需要去除，以满足染整加工与服用的需要。这一去除棉纤维上共生物的过程称为棉织物的精炼。
棉织物(包括纱线)的传统精炼方法是采用碱和表面活性剂进行高温处理，利用碱对果胶、棉蜡中脂肪酸酯类物质、含氮物质(主要为蛋白质类物质)的水解作用和表面活性剂的乳化、分散作用去除棉纤维上除天然色素和棉籽壳外的所有天然杂质，提高棉织物的吸水性能。棉织物传统的精炼方法工艺成熟，处理效果好。但也存在着对纤维(织物)损伤大，处理废水色度深、ph值高，cod值大(一般达到数千至上万mg/l)、洗涤用水量大等问题，严重影响棉织物的品质，同时排放的废水也严重污染了环境。而酶法进行精炼可以避免这些问题，具有生物处理的环保、节能等特点，然而酶法在工业应用之中依然存在困难，在预处理过程中，温度依然会达到100摄氏度，预处理后需要降温，其次加酶量依然较高。
毕赤酵母pichiapastoris目前已是仅次于大肠杆菌的最常用蛋白表达系统，广泛应用于实验室规模的蛋白质制备、表征以及结构解析等方面。利用甲醇进行诱导的毕赤酵母有着如下几种优势：具有醇氧化酶aox1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90％以上,有利于目的蛋白的分离纯化；在简单合成培养基中可实现高密度培养；表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。然而也存在着如发酵周期长；甲醇易燃易爆有毒，存在一定的危险性；培养基和培养条件不成熟之类的缺点。同时，由于酵母发酵过程中存在碳源消耗过程，对菌体有一定伤害，降低了酵母菌株的产酶能力。
技术实现要素：
本发明第一个目的在于提供一种生产角质酶的重组菌，所述重组菌以毕赤酵母为宿主，表达来源于humicolainsolens的角质酶。
在本发明的一种实施方式，所述来源于humicolainsolen的角质酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。
在本发明的一种实施方式，所述重组菌的构建方法为：将氨基酸序列为seqidno.1角质酶的基因连接到表达载体ppiczαa上，构建重组质粒ppiczαa-hic，将重组质粒ppiczαa-hic转入毕赤酵母后得到重组菌。
本发明第二个目的是提供一种生产角质酶的发酵方法，所述方法的具体步骤如下：
(1)菌种培养阶段：将重组菌接种到发酵培养基中，在25～31℃下搅拌培养15-36h；
(2)发酵诱导阶段：在发酵过程中添加诱导剂，在25～33℃下诱导培养96～216h，所述诱导剂为甲醇和山梨醇。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中含有5～15g/l的山梨醇。
在本发明的一种实施方式中，所述中甲醇和山梨醇的体积分数为1：1～4，所述甲醇的体积终浓度为0.8-1.5％。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂中甲醇和山梨醇的体积分数为1：1～2，所述甲醇的体积终浓度为0.8-1.5％。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂中甲醇和山梨醇的体积分数为1：1～4，所述甲醇的体积终浓度为0.8-1.5％。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中的诱导温度为28～33℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的组分为：0～20g/l硫酸钾，12～18g/l七水合硫酸镁，0.5～1.5g/l二水合硫酸钙，3～6g/l氢氧化钾，20～30ml/l磷酸，20～40g/l甘油。
本发明第三个目的是提供一种用角质酶进行生物精炼的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)预处理包括：将退浆后的棉机织物先在70-100℃的热水中进行预处理，时间为2-10min，浴比1∶10～50(织物重量：水体积)；
(2)酶处理包括：加入角质酶，加酶量：100～2000u/g，处理液的温度为室温至80℃，时间为30～120min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的具体步骤为预处理后的织物中每10～15min加入humicolainsolen来源的角质酶酶液，加酶量为100～2000u/g，总计处理50-60min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中humicolainsolen来源的角质酶的加酶量为150～350u/g。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的具体步骤为在预处理后的织物中先加入200-400uhumicolainsolen来源的角质酶，处理4-10分钟，随后放入40-60℃的热水中进行处理，并加入thermobifidafusca来源的角质酶，加酶量为100～2000u/g，处理40-60min。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)thermobifidafusca来源的角质酶的加酶量为300～500u/g。
在本发明的一种实施方式中，所述thermobifidafusca来源的角质酶的制备参考文献lingqiasu,ruoyuhong,jingwu*.enhancedextracellularexpressionofgene-optimizedthermobifidafuscacutinaseinescherichiacolibyoptimizationofinductionstrategy.processbiochemistry.2015.50(7):1039-1046。
在本发明的一种实施方式中，所述的角质酶来自嗜热单孢菌thermobifidafusca或氨基酸序列与得自thermobifidafusca的角质酶至少有60％的同源性。
在本发明的一种实施方式中，所述的角质酶来自特异腐质霉humicolainsolens或氨基酸序列与得自humicolainsolens的角质酶至少有60％的同源性。
本发明的有益效果：
(1)本发明的方法采用复配山梨醇的方式诱导表达角质酶，首次取消传统过程中碳源饥饿的过程，减少表达所需时间，在保持酶产量不变的基础上，从原来的诱导180小时左右降低至100小时左右，降低甲醇消耗量，提高生产强度。
(2)利用酶法处理棉织物相较化学法处理，步骤简单反应条件温和，环境友好，避免了强碱的需求，所需处理时间较化学法与酶法降低2小时以上，同时精炼效果得到提升，染色率上升，润湿性能增强。反应所需的角质酶生产简单，加酶量低。这些优势在环境保护日益受到重视的当今社会，显得尤为重要。
具体实施方式
角质酶的酶活测定方法：
在37℃下，采用连续分光光度法测定酶活力。反应总体积为1.5ml，包括30μl酶液和1470μl含50mmol/l硫磺脱氧胆酸钠和50mmol/l对硝基苯丁酸酯(pnpb)的tris-hcl缓冲液(ph8.0)，在波长405nm处，记录对硝基酚的生成速率。酶活的定义为：在37℃，每分钟将对硝基苯丁酸酯催化水解生成1μmol对硝基酚的酶量即为一个酶活力单位。
染色率计算方法：
首先用连续分光光度计扫描得出标准染料的最大吸收波长。在此波长下，测定染色前后染液吸光度值，计算上染百分率。以时间为横坐标，上染百分率为纵坐标作出上染速率曲线。
实施例1：基因工程菌甲醇毕赤酵母km71/ppiczαa-hic的构建
(1)以氨基酸序列为seqidno.1角质酶的基因为模版，并与ppiczαa连接，构成重组质粒ppiczαa-hic。
(2)重组质粒经saci内切酶线性化，电击法转入毕赤酵母km71感受态中。
(3)将上述处理好的菌液均匀涂布在1mg·ml-1zeocin抗性平板上，于30℃恒温条件下培养，直至长出单菌落，约2-3天，随后通过摇瓶培养，进行表达验证，得到基因工程菌甲醇毕赤酵母km71/ppiczαa-hic。
(4)摇瓶发酵，具体步骤为：
挑取ypd/g418(ypd/zeocin)浓度梯度平板上的单克隆于10mlypd培养基中，于200rpm恒温摇床中30℃培养20-24h后转接2.5ml上述种子液至50mlbmgy培养基，于200rpm恒温摇床中30℃培养20-24h，将全部菌体用25mlbmmy培养基重悬，加入诱导剂甲醇至终浓度为11g·l-1，30℃培养进行重组hic的诱导至hic酶活达到最高值，定期(24h)向培养基补加甲醇。
摇瓶结果显示最高酶活在200u/ml左右，od为60左右。
实施例2：诱导剂添加量对humicolainsolens3l罐发酵的影响
(1)准备菌株和培养基
菌株：基因工程菌甲醇毕赤酵母km71/ppiczαa-hic；
发酵培养基：18.2g/l硫酸钾，14.9g/l七水合硫酸镁，0.93g/l二水合硫酸钙，4.13g/l氢氧化钾，26.7ml/l磷酸，30g/l甘油，10g/l山梨醇；
(2)基因工程菌生长培养
从固体斜面上取少量活化的菌种甲醇毕赤酵母pmad16/ppiczαa-hic接种在经灭菌的所述发酵培养基中，装液量30％，培养温度30℃，搅拌培养至菌体od为100；
(3)基因工程菌的诱导培养
连续补加诱导剂，诱导剂的添加方式如表1所示，诱导培养温度30℃，诱导时间108h，过滤分离得到角质酶(粗制剂)。
根据表1可知，在山梨醇和甲醇加入比例1:1的情况下，酶活以及生产强度达到最高。
表1诱导剂比例以及添加量对产酶的影响
实施例3：发酵培养基中山梨醇量对humicolainsolens3l罐发酵的影响
(1)准备菌株和培养基
菌株：基因工程菌甲醇毕赤酵母km71/ppiczαa-hic；
发酵培养基：18.2g/l硫酸钾，14.9g/l七水合硫酸镁，0.93g/l二水合硫酸钙，4.13g/l氢氧化钾，26.7ml/l磷酸，30g/l甘油。山梨醇添加量如表2所示；
(2)基因工程菌生长培养
从固体斜面上取少量活化的菌种甲醇毕赤酵母pmad16/ppiczαa-hic接种在经灭菌的所述发酵培养基中，装液量30％，培养温度30℃，搅拌培养至菌体od为100；
(3)基因工程菌的诱导培养
连续补加甲醇与山梨醇体积比1：1的诱导剂，维持甲醇终体积浓度为1％，诱导培养温度30℃，诱导时间108h，过滤分离得到角质酶(粗制剂)。
根据表2可知，在山梨醇和甲醇加入比例1:1的情况下，酶活以及生产强度达到最高。
表2山梨醇添加量对产酶的影响
实施例4：发酵参数对humicolainsolens3l罐发酵的影响
(1)准备菌株和培养基
菌株：基因工程菌甲醇毕赤酵母km71/ppiczαa-hic；
发酵培养基：18.2g/l硫酸钾，14.9g/l七水合硫酸镁，0.93g/l二水合硫酸钙，4.13g/l氢氧化钾，26.7ml/l磷酸，30g/l甘油，10g/l山梨醇；
(2)基因工程菌生长培养
从固体斜面上取少量活化的菌种甲醇毕赤酵母pmad16/ppiczαa-hic接种在经灭菌的所述发酵培养基中，装液量30％，培养温度30℃，搅拌培养至菌体od为100；
(3)基因工程菌的诱导培养
连续补加甲醇与山梨醇体积比1：1的诱导剂，维持甲醇终体积浓度为1％，在一定温度下诱导培养，过滤分离得到角质酶(粗制剂)，诱导培养温度，诱导时间如表2所示。
根据表3可知，在诱导温度为28℃的情况下，酶活以及生产强度达到最高。
表3诱导参数对产酶的影响
实施例5：利用角质酶进行生物精炼
样品：退浆纯棉织物
a.预处理：将退浆后的纯棉先在80℃的热水中进行预处理，ph＝8.5，时间5min，浴比1∶10。
b.在预处理后的织物中每15min一次加入一定单位h.i来源角质酶酶液共处理60min。
每次加酶量如表3所示。
c.处理完毕后，先用95℃的热水洗涤1次，时间约10s，之后室温水洗3次，最后烘干。经过上述方法处理后，根据表3可知，在每次加酶量为250u/ml时，纯棉的润湿时间由处理前的超过20min提升为5s。染色率从52.5％提升至92.2％。
表4hic加酶量对生物精炼的影响
实施例6：利用角质酶进行生物精炼
样品：退浆纯棉织物
a.预处理：将退浆后的纯棉先在80℃的热水中进行预处理，ph＝8.5，时间5min，浴比1∶10。
b.在预处理后的织物中先加入200uh.i来源角质酶处理5分钟，随后放入50℃的热水中进行处理，并加入t.f来源角质酶(thermobifidafusca来源的角质酶获得方法参考文献：lingqiasu,ruoyuhong,jingwu*.enhancedextracellularexpressionofgene-optimizedthermobifidafuscacutinaseinescherichiacolibyoptimizationofinductionstrategy.processbiochemistry.2015.50(7):1039-1046)。进行处理，具体加酶量和处理时间如表4所示。
c.处理完毕后，先用95℃的热水洗涤1次，时间约10s，之后室温水洗3次，最后烘干。根据表4可知，在t.f角质酶加酶量为300u/ml时，经过上述方法处理后，纯棉的润湿时间由处理前的超过20min提升为2.5s。染色率从52.5％提升至94.2％
表5t.f角质酶加酶量对生物精炼的影响
实施例7：利用naoh进行精炼
样品：退浆纯棉织物
a.预处理：将退浆后的纯棉先在100℃的热水中进行预处理，时间5min，浴比1∶10。
b.在预处理后的织物中先加入100mmol/lnaoh处理180分钟，随后放入50℃的热水中进行处理。
c.处理完毕后，先用95℃的热水洗涤1次，时间约10s，之后室温水洗3次，最后烘干。经过上述方法处理后，纯棉的润湿时间由处理前的超过20min提升为25s。染色率从52.5％提升至89.2％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>一种角质酶的发酵与棉织物酶精炼工艺
<120>江南大学
<130>1
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>194
<212>prt
<213>人工合成
<400>1
glnleuglyalailegluasnglyleugluserglyseralaasnala
151015
cysproaspalaileleuilephealaargglyserthrgluprogly
202530
asnmetglyilethrvalglyproalaleualaasnglyleugluser
354045
hisileargasniletrpileglnglyvalglyglyprotyraspala
505560
alaleualathrasnpheleuproargglythrserglnalaasnile
65707580
aspgluglylysargleuphealaleualaasnglnlyscysproasn
859095
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100105110
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