本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于Ion Proton测序平台检测结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因的方法及试剂。
背景技术：
作为最常见的消化道恶性肿瘤结直肠癌，其发病率位居全球恶性肿瘤的第三位，死亡率位居第四位。全球每年超过一百万新发结直肠癌病例，且发病率位居男性恶性肿瘤的第三位，女性恶性肿瘤的第二位。结直肠癌发病率与死亡率在经济发达的国家和地区高于欠发达国家和地区，男女发病地域分布趋势一致，但男性高于女性。随着年龄的增长，结直肠癌发病和死亡的危险性增加。全球结直肠癌的发病率和死亡率总体仍呈上升趋势。结直肠癌年龄组别发病率整体的趋势是发达国家结直肠癌发病较发展中国家晚。近年来我国经济发展和城市化加快，居民生活习惯及饮食习惯较以前有明显改变，加之我国人口逐渐老龄化，结直肠癌的发病率及死亡率均出现明显上升趋势，且高于世界平均水平，结直肠癌的预防和治疗已刻不容缓。
RAS家族由KRAS、HRAS和NRAS组成，基因家族各成员间同源性可达85％。RAS基因编码p21蛋白，分子量为21kD，位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参与传导细胞增殖信号的调控系统。其激活状态为GTP结合状态，失活状态为GDP结合状态，其转变为活性致癌基因的主要方式是第12、13和61密码子的突变，其中以第12密码子点突变最常见。KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在结直肠癌患者中为20％～50％。KRAS为EGFR信号传导通路RAS-RAF-MAPK中的重要因子。KRAS基因突变可以使下游信号传导通路不依赖于EGFR的活化而异常激活，引起细胞生长、增殖和凋亡异常，从而使临床应用EGFR抑制剂的治疗失败。因此，检测KRAS基因突变，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据。
NRAS是RAS基因家族中的一员，定位在1号染色体上，长度大约为4.3kb。NRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，突变主要位于第2、3外显子上。在EGFR信号转导通路及该通路下游其他蛋白的调节中亦具有重要作用。利用对NRAS基因是否存在体细胞突变进行检测，可用于辅助临床医生筛选出受益于EGFR抗体等药物的癌症患者，适合于患者在进入个体化靶向治疗疗程之前使用，可为患者个体用药提供用药科学依据，降低治疗风险以及患者负担。
BRAF是Ras的下游基因，是RAF家族的成员之一，RAF家族还包括ARAF和RAFT(CRAF)基因。BRAF基因位于7q34，长约190kb，mRNA长约2.5kb，编码783氨基酸的蛋白，相对分子质量为94～95kD。BRAF蛋白由783个氨基酸组成，功能上从N端到C端分为RAS结合区、富半胱氨酸区(Cys)、甘氨酸环(G-loop)和激活区。在绝大多数组织和细胞类型中，BRAF是MEK/ERK最为关键的激活因子。BRAF在结直肠癌患者中突变率约在15％左右，为体细胞错义突变，90％以上的突变发生在第15号外显子，突变模式为T→A，即V600E突变。该突变导致下游MEK/ERK信号通路持续激活，对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要。对BRAF基因突变的检测，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据。
PIK3CA基因定位于3q26.3，长34kb，包含20个外显子，编码含1068个氨基酸的蛋白质。现已证实PIK3CA是一种原癌基因，位于EGFR下游，是PI3K/AKT信号通路重要的核心分子之一。PIK3CA基因编码PI3K IA类中的催化亚基p110a，PIK3CA基因突变导致p110a酶活性增强、激活AKT信号通路、减少细胞对生长因子的依赖、抑制细胞的凋亡和促进肿瘤的侵袭，在结直肠细胞癌变过程中具有不可忽视的重要性。PI3K-PTEN-AKT信号通路调节细胞的增殖、分化、存活和迁移等功能。近年来发现，这条通路的活性异常不仅能导致细胞恶性转化，还与肿瘤细胞的侵袭转移行为相关。PIK3CA基因突变主要集中在其第10和第21外显子的特异性位点上，分别对应着该酶的螺旋区和激酶区。PIK3CA在结直肠癌中突变率约为13.4％。BRAF基因状态及PIK3CA基因对EGFR分子靶向治疗效果可能存在影响，有必要在条件允许时进行BRAF基因及PIK3CA基因的检测。
目前检测KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA基因突变的方法主要有2种：荧光定量PCR法、一代测序法。PCR法检测突变点，通常一个体系只能检出一个突变位点，容易出现假阳性；检测多突变位点操作繁琐，需要样本量较大。一代测序法每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，因此检测效率低，检测成本高；而且由于一代测序法测序原理的限制，在检测带有杂合子的样品信号时会出现双峰乃至多峰，使得该样品无法被准确识别出来，导致检测灵敏度低(20％)，假阴性率较高。
因此，市场上急需一种新的方法和新的试剂盒同时检查结直肠癌相关基因，能同时检测多个基因、降低样本的需求量和降低检测成本；同时还能提高检测的灵敏度和准确性。
技术实现要素：
本发明所提供的检测方法及试剂盒是基于高通量测序平台对结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因多个区域同时进行测序，不仅大大提高了检测的效率、准确性和灵敏度同时降低了检测成本；还为结直肠癌的分子诊断及个体化用药提供强有力的依据。所述相关基因包括KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA4个基因32种突变位点。
上述结直肠癌相关基因突变情况包括检测以下4个基因32种突变位点的突变情况：
为实现本发明的目的，一种基于高通量测序平台检测结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因的方法，包括以下步骤：
(1)样本DNA提取：对石蜡包埋组织样本进行DNA提取得到待测样本DNA；
(2)目的片段扩增：分别设计KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因型别的扩增引物对和待检测样本DNA、PCR反应液、无核酸酶水混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；
(3)消化引物序列：将步骤(2)得到的目的基因DNA片段与引物消化液混合反应，得到去引物的平末端目的基因DNA片段；
(4)接头连接：将步骤(3)得到的平末端目的基因DNA片段与连接缓冲液、P1接头、特异性接头1-16、DNA连接酶和无核酸酶水合混合后进行连接反应，得到加接头的DNA片段；
(5)文库扩增及纯化：用磁珠通过对步骤(4)得到的接头DNA片段进行纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化后加接头的DNA片段；然后加入文库扩增引物及文库扩增反应液对纯化后加接头的DNA片段进行PCR扩增，最后用磁珠对扩增的产物进行纯化，去除多余的大片段和小片段，得到最终的文库；
(6)文库质检：将步骤(5)得到的文库采用Qubit 3.0测出浓度，再将其稀释到200pmol/L，最后采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度，得出测序文库；
(7)进行模板制备和富集：将步骤(6)得到的测序文库进行乳液PCR进行扩增，得到上机模板；再通过磁珠进行富集纯化，得到上机模板；
(8)上机测序：将步骤(7)得到的上机模板进行上机测序；
(9)数据分析：通过对数据的分析，分别确定KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA基因型别。
其中，步骤(1)所述的提取试剂为Qiagen公司的QIAmp DNA FFPE Tissue Kit。
其中，步骤(2)所述的扩增引物对分别为：
其中，步骤(2)所述的反应体系为20μL体系，反应体系的组成成分具体为：
其中，步骤(2)中所述反应条件为：
其中，步骤(3)中所述所加试剂为2μL引物消化液，反应条件为：
其中，步骤(4)中的P1接头序列为：
5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’
5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’
其中，步骤(4)中的标签接头序列是由如下正反两个序列组成的特异性接头x：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’
5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头x代表的序列如下：
特异性接头1：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’
5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头2：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头3：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’
5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头4：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT-3’
5’-ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头5：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头6：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT-3’
5’-ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头7：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT-3’
5’-ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头8：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT-3’
5’-ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头9：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头10：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头11：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT-3’
5’-ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头12：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT-3’
5’-ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头13：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT-3’
5’-ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头14：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT-3’
5’-ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头15：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT-3’
5’-ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头16：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT-3’
5’-ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
其中，步骤(4)中所述反应体系为30μL体系，反应体系的组成成分具体为：
其中，步骤(4)中所述反应条件为：
其中，步骤(5)中所述的磁珠为XP Reagent。
其中，步骤(5)中所述反应体系为52μL体系，反应体系的组成成分具体为：
其中，步骤(5)中所述反应条件为：
其中，步骤(6)中所用到的试剂为英潍捷基(上海)贸易有限公司Qubit dsDNA HS Assay Kit及北京普凯瑞生物科技公司的KAPA SYBR FAST Universal 2X qPCR Master Mix试剂。
其中，步骤(7)中所用到的仪器为：Ion OneTouchTM2和Ion OneTouchTM ES。
其中，步骤(8)中所用到的仪器为：PGM或Proton。
一种基于高通量测序平台检测结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因的检测试剂盒，包括以上所述步骤，且成分包括：DNA PCR反应液、DNA PCR引物、DNA连接酶、引物消化液、连接缓冲液、P1接头序列、特异性接头1-16序列、文库扩增反应液、文库扩增引物、磁珠、75％乙醇和无核酸酶水。
附图说明：
图1一种基于Ion Proton测序平台检测结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因的方法的流程图
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：请参阅图1，本发明实施例中，一种基于Ion Proton测序平台检测结直肠癌KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因的方法。
选取的样本说明：以下实施例所用的16例样本(其中阳性样本15例，野生型样本1例)均收集自中国人民解放军第八一医院，分别编号为样本1-16，基因型如下：
实验步骤：
(1)待测样本的DNA提取
本实施例中，DNA样本来自石蜡包埋组织样本，按照QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(50)(厂家：Qiagen，货号：56404)试剂盒操作说明书进行石蜡包埋组织DNA提取。DNA溶液可置于-20℃保存。
(2)对待测样本DNA进行Qubit 3.0浓度测定
本实施例中，DNA样本采用dsDNA HS Assay Kit(厂家：Life，货号：Q32854)试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。
(3)目的片段扩增。准备0.2mL的PCR反应管，根据下表在管中依次加入试剂，涡旋混匀5秒，离心10秒，使管壁和盖子上无明显液滴。
X：表示DNA样本的体积，范围是1～6μL。
反应条件：
(4)消化引物序列。
向PCR产物中加入2μL引物消化液，涡旋混匀，瞬时离心，根据如下程序进行反应：
(5)接头连接。
根据下表分别在PCR产物管中依次加入试剂，涡旋混匀5秒，离心10秒，使管壁和盖子上无明显液滴。
反应条件：
P1接头为：
5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’
5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’
样本特异性接头分别如下：
特异性接头x：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’
5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头x代表的序列如下：
特异性接头1：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’
5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头2：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头3：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’
5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头4：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT-3’
5’-ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头5：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头6：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT-3’
5’-ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头7：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT-3’
5’-ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头8：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT-3’
5’-ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头9：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头10：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头11：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT-3’
5’-ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头12：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT-3’
5’-ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头13：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT-3’
5’-ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头14：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT-3’
5’-ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头15：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT-3’
5’-ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
特异性接头16：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT-3’
5’-ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’
(6)纯化连接产物
磁珠纯化连接产物，采用XP Reagent(厂家：Life，货号：A63882)纯化产物：
1)将PCR产物转移至1.5ml EP管内，加入45μL磁珠，吹打混匀；
2)室温孵育5min；
3)将样本放置磁力架上，静置3mn至管内溶液澄清，小心吸取上清液并弃去；
4)加入300μL新鲜配制的75％乙醇，转动EP管清洗磁珠，弃去乙醇；
5)重复步骤4)一次；
6)室温晾干磁珠，不要过度干燥(风干即可，不要开裂)。
(7)文库扩增，在纯化后晾干的磁珠中加入50μL文库扩增反应液PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity和2μL文库扩增引物Library Amplification Primer Mix，重悬磁珠，转移至PCR管中，涡旋混匀，进行PCR扩增。
反应条件：
(8)文库进行磁珠纯化，采用XP Reagent(厂家：Life，货号：A63882)磁珠纯化产物：
1)每管加入25μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟；
2)将EP管置于磁力架上，吸附3min至溶液变澄清之后，将上清液转移到另一标记的EP管中，注意不要吸到磁珠；
3)每管加入60μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟；
4)将EP管置于磁力架上，吸附3分钟至溶液变澄清之后，吸去溶液，注意不要吸到磁珠；
5)吸取300μL 75％的乙醇于EP管，轻轻旋动EP管清洗磁珠。液澄清后吸去溶液，注意不要吸到磁珠；
6)重复上一步；
7)取下EP管，低速离心10秒。将EP管置于磁力架上，用移液枪吸去残留溶液，注意管壁上不能有残留。将EP管盖打开，室温静置5分钟，晾干磁珠；
8)吸取50μL洗脱液于EP管内，涡旋混匀，离心5秒，室温放置5分钟；
9)将EP管置于磁力架上，静置3分钟至溶液澄清后，小心转移液体到新的EP管中，并标记文库名称。
(9)检测文库浓度
DNA文库采用dsDNA HS Assay Kit(厂家：Life，货号：Q32854)试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。文库建议根据下列公式稀释到200pmol/L，稀释后使用KAPA SYBR FAST Universal 2X qPCR Master Mix试剂(厂家：Kapa，货号：KK4602)进行荧光PCR定量，等质量混合后上机测序。
(10)进行模板制备和富集
将混好的文库进行模板制备和富集，采用的试剂盒是Ion PI HiQTM OT2 200Kit(厂家：Life，货号：A26434)，因严格按照试剂盒说明书进行操作，得到上机模板。
(11)上机测序
将上机模板进行上机测序，采用的试剂盒是Ion PI Hi-QTM Sequencing 200Kit(厂家：Life，货号：A26433)，因严格按照试剂盒说明书进行操作。
(12)进行数据分析
应用实施例1的方法对样本1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16进行检测，结果如下表所示：
由样本信息记录表可以得出：检测结果完全相一致。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的人和附图标记视为限制所涉及的权利要求。