[技术领域]
本发明涉及胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物及其应用，所述胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物具有改善的体内持续时间和稳定性——由于胰岛素和/或其类似物和能够增加体内半衰期的生物相容性物质之间的共价连接。更具体地，本发明涉及非凡的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物以及制备其的方法，在所述非凡的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物中由胰岛素治疗引起的副作用被降低，同时给药依从性被改善——因为其中呈现了体内持久性的性质。此外，本发明提供了缀合物，其中胰岛素和/或胰岛素类似物和能够增加体内半衰期的生物相容性物质通过共价键连接。
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背景技术：
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胰岛素是由人体的胰腺分泌的激素，其调节血糖水平，并且在运送血液中过剩的葡萄糖至细胞以为细胞提供能量时在维持正常血糖水平中起作用。但是，在糖尿病患者中，由于缺乏胰岛素、胰岛素抵抗和β-细胞功能丧失，胰岛素没有正常起作用，因此血液中的葡萄糖不能被用作能源，血糖水平升高，导致高血糖症。最终，发生尿排泄，促成各种并发症的发展。因此，胰岛素疗法对于患有胰岛素产生异常(i型)或胰岛素抵抗(ii型)的患者是必要的，并且血糖水平可以通过胰岛素施用而被正常调节。
治疗用胰岛素制剂的实例不仅包括天然胰岛素还包括正在开发中的胰岛素类似物，其通过修饰人胰岛素而具有提高的作用时间。
通过基因重组技术的人胰岛素的首次修饰产物是由elililly生产的赖脯胰岛素(insulinlispro)，其中将b-链的羧基端上的第二赖氨酸残基和第三脯氨酸残基的顺序交换，以阻止胰岛素二聚体和六聚体的形成，从而在通过注射施用时增加具有优异的降低血糖水平活性的胰岛素单体的量。由诺和诺德生产的门冬胰岛素(insulinaspart)是修饰的胰岛素类似物，其中b-链的第28位处的脯氨酸残基用天冬氨酸残基取代，以增加电荷排斥和阻止胰岛素六聚体的形成，并且从而能够呈现胰岛素的速效活性。sanofiaventis的谷赖胰岛素(insulinglulisine)是修饰的胰岛素类似物，其中b-链的第三位处的天冬酰胺残基用赖氨酸残基取代并且b-链的第29位处的赖氨酸残基用谷氨酸残基取代，以能够实现快速的降低血糖水平效果。
但是，由于胰岛素具有极短的体内半衰期，其它蛋白质和肽激素往往如此，它不能显示长效治疗效果，因此具有其必须被连续和重复施用以发挥其作用的问题。此外，蛋白质和肽药物大部分以注射形式施用给患者，并且它们被频繁注射以保持其在血液中的浓度，这给患者带来了剧烈疼痛。因此，研究已经聚焦于各种蛋白质制剂、化学缀合物(例如，脂肪酸缀合物、聚乙烯聚合物缀合物)等的发展以通过增加这些蛋白质的体内半衰期来降低施用的频率而提高治疗效果以及患者的生活质量。
为了克服胰岛素制剂给药的这些问题，作为各种努力的实例，已经尝试通过增加胰岛素药物的生物膜通透性通过口腔或鼻腔的吸入而将胰岛素药物递送到体内。pfizer的用于治疗糖尿病的可吸入胰岛素剂“exubera”被强调为开创性的可吸入速效胰岛素制剂，用于解决注射给药的不便，同时显示类似于胰岛素注射制剂的降低血糖水平作用；但是，由于安全性问题，如导致肺癌的风险和销售业绩低，该制剂已经从市场上撤出。此外，许多制药公司，包括诺和诺德和lilly也停止了对可吸入胰岛素发展的研究。
与常规注射给药方法相比，吸入给药的方法肯定是有利的，因为吸入给药方法如此简单，使其能够由患者自身进行而没有疼痛。然而，该方法的问题在于其具有比注射制剂更低的体内药物递送效率，并且也难以将药物活性维持在其体内活性所需的水平。此外，该方法在制备适合于吸入给药的组合物中存在困难，如微生物和致病菌的污染、稳定性、持久性等。此外，将可吸入产品递送到肺中的方法可能具有引起组织中的水肿、细胞损伤和炎症的副作用。因此，需要进一步研究通过肺吸收的机制，但目前预测吸收机制、吸收率和吸收范围的能力尚处于其早期阶段。
但是，许多研究人员和制药公司仍然认为可能通过呼吸道递送胰岛素制剂，因此他们继续为其发展而努力。目前，已克服了exubera的缺点的mannkindcorporation的可吸入胰岛素制剂，afrezza，目前正在经过fda的批准。
此外，在过去几年中，连续地开发出能够改善给药依从性并且具有足以有效治疗的生物利用度的给药方法，以及通过临床试验中用于口、鼻和皮肤吸收的给药途径的胰岛素制剂(e.-s.khafagyetal.,advanceddrugdeliveryreviews；59,(2007)1521-1546)。
同时，已进行不断努力来提高血液中胰岛素制剂药物的稳定性并且保持血液中长效的高药物浓度，从而使药物疗效和给药依从性最大化。胰岛素药物的长效制剂应能够提高胰岛素的稳定性，并且同时保持药物本身的滴度处于高水平，并且不应引起低血糖反应。
目前在市场上可获得的长效胰岛素制剂的实例可包括赛诺菲-安万特的甘精胰岛素(lantus)和诺和诺德的地特胰岛素(levemir)。赛诺菲-安万特的甘精胰岛素是第一个长效胰岛素，通过用甘氨酸取代a-链的第21位处的天冬酰胺，同时在b-链中加入两个精氨酸残基来制备，以提供在酸性ph条件下的溶解度和在体内ph条件下的低溶解度，从而当皮下给药时诱导胰岛素的沉淀被缓慢吸收。甘精胰岛素的持续时间为约20小时至约22小时。甘精胰岛素的优点在于其作用长于速效胰岛素(5小时至8小时)和超速效胰岛素(3小时至5小时)，并且不会因不存在胰岛素浓度峰而引起低血糖。诺和诺德的地特胰岛素是最近开发的长效胰岛素制剂，并且通过在b-链的第30位处缺失苏氨酸残基，同时在b-链的第29位处酰化赖氨酸残基而进行制备，使得当施用于人时，胰岛素制剂可以与白蛋白缀合，从而提供长效特性(allisonj.etal.,dm.148-162,2010)。持续时间发展到18小时至22小时的范围，略短于甘精胰岛素——作为每天施用一次或两次的制剂——的持续时间。这些长效胰岛素制剂在血液中没有胰岛素浓度峰值，并且因此适合于基础胰岛素(baseinsulin)。然而，这些长效胰岛素制剂不具有足够的半衰期，因此应该每天施用一次或两次，从而对患者造成不便。在这方面，迫切需要开发能够减少需要长期施用糖尿病药物的糖尿病患者的给药频率的制剂，从而改善患者的便利性。
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技术实现要素：
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[技术问题]
本申请人已努力发展用于通过增加其在血液中的持久性来改善给药依从性的长效胰岛素制剂。结果，他们已成功制备胰岛素或胰岛素类似物缀合物，其通过连接a-链缀合物和b-链缀合物而形成，其中a-链和b-链的每个被连接至能够增加胰岛素和其类似物的半衰期的免疫球蛋白恒定区。这样的缀合物被期望大大增加半衰期并且改善产量，因为在纯化期间移除c-肽的过程是不需要的。
[技术方案]
本发明的目的是提供能够延长体内半衰期并且保持胰岛素的降血糖作用的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物，其中通过肽键将胰岛素类似物和能够延长半衰期的生物相容性物质缀合至其上。
本发明的另一个目的是提供胰岛素或胰岛素类似物缀合物，其中通过肽键将胰岛素和/或其类似物缀合至能够延长半衰期的生物相容性物质。
本发明的又一个目的是提供长效缀合物，其是下式1的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物。
[式1]
x-la-f1:y-la-f2
其中，在上式中，
x是胰岛素a-链或胰岛素类似物的a-链；
l是连接体；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时每个l彼此独立；
:是化学键；
y是胰岛素b-链或胰岛素类似物的b-链；和
f1和f2包括免疫球蛋白恒定区和具有fcrn-结合位点。
本发明的又一个目的是提供编码胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物的多核苷酸；包含多核苷酸的载体；和包含载体的转化体。
本发明的又一个目的是提供胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物，其中胰岛素和/或其类似物的a-链和b-链缀合物的每一个被编码，随后通过双键进行缀合。
本发明的又一个目的是提供胰岛素或胰岛素类似物缀合物，其中a-链和b-链缀合物之间的双键的形成由于胰岛素和/或其类似物的a-链和b-链的每一个被缀合至其上的生物相容性物质的变化而被促进。
本发明的又一个目的是提供用于预防或治疗糖尿病的组合物，其包含胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物。
本发明的又一个目的是提供用于治疗糖尿病的方法，其包括将胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物施用给对其有需要的受试者。
本发明的又一个目的是提供制备胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物的方法，其中胰岛素和/或其类似物的a-链和b-链缀合物的每一个被编码，随后通过双键进行缀合。
本发明的又一个目的是提供制备胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物的方法，其中胰岛素和/或其类似物的a-链和b-链缀合物的每一个被编码，随后通过双键进行缀合，其中该方法没有在重折叠过程后移除c-肽。
[发明的有益效果]
本发明的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物可以稳定地保持降低血糖水平的效果以及增加血液中的半衰期，并且因此能够改善胰岛素的给药依从性并且降低胰岛素治疗的副作用。
[最佳方式]
为了实现以上目的，在一方面，本发明提供能够延长体内半衰期并且保持胰岛素的降血糖作用的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物，或制备其的方法，其中胰岛素和/或其类似物和能够延长半衰期的生物相容性物质通过肽键与其缀合。
在示例性实施方式中，胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物是下式1的长效缀合物。
[式1]
x-la-f1:y-la-f2
其中，在上式中，
x是野生型胰岛素a-链或其类似物；
l是连接体；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时每个l彼此独立；
:是化学键；
y是野生型胰岛素b-链或其类似物；和
f1和f2包括免疫球蛋白恒定区并且具有fcrn-结合位点。
在另一个示例性实施方式中，生物相容性物质是免疫球蛋白fc区。
在又一个示例性实施方式中，胰岛素或胰岛素类似物缀合物是这样的胰岛素或胰岛素类似物缀合物，其中胰岛素类似物的每条链被连接至免疫球蛋白fc区的每个片段。
胰岛素或其类似物的每条链和免疫球蛋白fc区的每个片段之间的连接可以在基因水平进行，并且这样的连接可以通过高分子量聚合物如聚乙二醇(peg)进行。
在另一个方面，本发明提供胰岛素或胰岛素类似物缀合物，或制备其的方法，其中胰岛素或其类似物通过肽键被缀合至能够延长半衰期的生物相容性物质。
在又一个方面，本发明提供编码胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物的多核苷酸；包含多核苷酸的载体；和包含载体的转化体。
在本发明的又一个方面，胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物的特征在于胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物，其在a-链和b-链缀合物的每一个被编码后通过连接a-链和b-链缀合物而形成。
在本发明的又一个方面，免疫球蛋白fc区——其是形成胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物的生物相容性物质——的特征在于生物相容性物质，其中由于变化双键被增强。
在又一个方面，本发明提供用于预防或治疗糖尿病的组合物，其包含胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物。
在示例性实施方式中，组合物的特征在于其包括以下特征中的一个或多个：(i)相比于胰岛素提高的降低血糖水平的效果；(ii)相比于胰岛素提高的在血液中的持续时间；(iii)体内活性的保持；和(iv)相比于胰岛素降低的作为副作用的低血糖效果。
以下，本发明将被更详细地描述。
在示例性实施方式中，本发明提供胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物。
在本发明的示例性实施方式中，胰岛素缀合物或胰岛素类似物缀合物是单链连接的物质，其中通过肽键经氨基酸连接体或非氨基酸连接体将胰岛素或胰岛素类似物的部分缀合至免疫球蛋白fc片段的部分。
在本发明的另一个示例性实施方式中，胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物可为通过连接物质的两个或更多个链的化学缔合形成多聚体如二聚体、三聚体等的那些。在本文中，化学缔合是包括所有化学键，如共价键、离子键、盐桥等，和分子间力，如范德瓦尔斯力、疏水相互作用等的概念，但不限于此。在这样的多聚体的一个示例性实施方式中，化学缔合是在属于同一缀合物的不同连接物质的fc片段部分之间形成的二硫键。本发明的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物的进一步具体形式由与以上描述的胰岛素或胰岛素类似物的两种连接物质有关的二聚体形成。在本文中，形成二聚体的胰岛素或胰岛素类似物连接物质的每一个中的胰岛素或胰岛素类似物的部分可彼此相同。例如，以缀合物的二聚体形式存在的一对胰岛素和/或胰岛素类似物部分可全部为野生型b链，即，相同的同源二聚体。可选地，胰岛素和/或类似物的一个部分可为胰岛素a-链类似物，而胰岛素和/或类似物的另一个部分可为野生型b-链即，异源二聚体。在因此描述的具体异源二聚体的示例性实施方式中，胰岛素a-链(或其类似物)和与其成为一对的胰岛素b-链(或其类似物)的部分之间可不存在直接连接，或可选地这些可通过二硫键进行连接。这样的二硫键可为形成的野生型胰岛素a-链和b-链之间存在的相同或不同的二硫键。
在本发明的又一个示例性实施方式中，胰岛素类似物可用于解决胰岛素制剂的长效特性和低血糖的问题。
如在本文中所使用的，术语“胰岛素类似物”是人的胰岛素变体，具有与胰岛素类似的体内降低血糖水平特性，从而指的是这样的肽，其中野生型或天然胰岛素、a-链、b-链和c-肽的一个或多个氨基酸序列是不同的。
天然胰岛素的氨基酸序列为如下。
a-链：
gly-ile-val-glu-gln-cys-cys-thr-ser-ile-cys-ser-leu-tyr-gln-leu-glu-asn-tyr-cys-asn(seqidno：1)
b-链：
phe-val-asn-gln-his-leu-cys-gly-ser-his-leu-val-glu-ala-leu-tyr-leu-val-cys-gly-glu-arg-gly-phe-phe-tyr-thr-pro-lys-thr(seqidno：2)
本发明的胰岛素变体指的是具有体内血糖-控制能力的肽，其中一个或多个胰岛素和氨基酸序列与胰岛素不同。
本发明的胰岛素类似物可包括包含任一选自a-链、b-链和c-肽的肽，并且a-链、b-链和c-肽的氨基酸序列的每一个可为野生型序列，或其中在天然序列中一个或多个野生型或非野生型氨基酸被添加、取代或缺失的序列，但不限于此。
本发明的胰岛素类似物与天然胰岛素的a-链、b-链和c-肽的氨基酸序列的每一个具有至少80％的同源性，并且其可为肽的形式，其中氨基酸残基中的部分基团通过化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化)、缺失(例如，脱氨基化)或修饰(例如，n-甲基化)进行修饰，并且可包括所有具有体内血糖水平控制能力的肽，但其并不限于此。
本发明的胰岛素类似物指的是具有相当于如上所述的胰岛素的体内血糖水平控制能力的肽，并且可包括胰岛素激动剂、衍生物、片段、变体等，但其并不限于此。
本发明的胰岛素激动剂指的是可以结合至胰岛素——不管胰岛素的结构——的体内受体，并且从而，呈现相当于胰岛素的生物活性的物质。
本发明的胰岛素片段指的是以下形式，其中至少一种氨基酸被添加或缺失，并且添加的氨基酸可为自然界中不存在的氨基酸(例如，d-型氨基酸)，并且这样的胰岛素片段具有体内血糖水平控制能力。
本发明用于制备胰岛素激动剂、衍生物、片段和变体的方法可单独或组合使用。例如，可包括具有体内血糖水平控制能力的那些，其在至少一种氨基酸序列具有不同，并且其中将氨基末端中的氨基酸残基脱氨基。
在示例性实施方式中，本发明提供长效胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物，其中胰岛素和/或其类似物被缀合至能够延长半衰期的生物相容性物质。
在另一个示例性实施方式中，本发明提供长效胰岛素缀合物，其中胰岛素和/或其类似物被缀合至选自以下的生物相容性物质：聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白和其片段、白蛋白结合物质、具体氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、fcrn-结合物质、体内结缔组织或其衍生物、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖类和高分子量聚合物。
如在本文中所使用的，术语“生物相容性物质”指的是这样的物质——当共价连接至胰岛素和/或其类似物以形成缀合物时，其可以增加胰岛素和/或其类似物体内半衰期，并且从而延长其活性持续时间。例如，由于主要目的是增加半衰期并且保持物质的生物利用度和持久的持续时间，所以可以被缀合至胰岛素或其类似物的生物相容性物质可包括各种生物相容性物质而没有限制，例如，聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白和其片段、白蛋白结合物质、弹性蛋白、水溶性弹性蛋白前体、弹性蛋白的部分氨基酸序列的重复单元的聚合物、具体氨基酸序列的重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、fcrn-结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、糖类、高分子量聚合物等。此外，胰岛素和/或其类似物可通过基因重组技术被缀合至能够延长体内半衰期的生物相容性物质。fcrn-结合物质可为免疫球蛋白fc区。
本发明的胰岛素和/或其类似物相比于天然胰岛素具有更低的活性。具有比天然胰岛素更低的活性表明它们可以降低低血糖的风险，所述低血糖的风险是天然胰岛素的最严重的问题，并且其长效型制剂的优势在于它们可以通过连续保持低活性来长时间控制血糖水平而没有低血糖的风险。
例如，本发明中所使用的胰岛素缀合物和/或胰岛素类似物缀合物的特征在于生物相容性物质或免疫球蛋白fc片段通过肽键被缀合至羧基端。
在示例性实施方式中，本申请人可以通过在基因水平将胰岛素和/或其类似物的a-链或b-链融合在免疫球蛋白fc区的氨基端，随后将其克隆至表达载体中而生产胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物。
免疫球蛋白fc区是生物可降解多肽，其可以在体内新陈代谢并且因此安全地用作药物载体。此外，免疫球蛋白fc区相对于整个免疫球蛋白分子具有较低的分子量，并且因此其在缀合物的制备、纯化和产量方面具有优势。此外，由于考虑到抗体间氨基酸序列的变化而将具有高度异质性的fab部分移除，所以物质的同质性可以被显著地增加并且在血液中引起抗原性的可能性也可被降低。
本发明中所使用的胰岛素和/或其类似物通过肽键连接至免疫球蛋白fc区，并且随后在表达宿主中生产。表达宿主可为微生物，如大肠杆菌——其可以通过转化外源基因来生产蛋白质，而没有限制，并且可为酵母、昆虫细胞、动物细胞等。
由表达宿主生产的胰岛素和/或胰岛素类似物的a-链和b-链缀合物中的fc区在表达后的折叠过程期间通过双键彼此缀合，并且随后a-链和b-链被连接，因而生产胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物。
即，可以通过促进异源二聚体化，而不是促进a-链和b-链缀合物的同源二聚体来生产胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物。
双键可为二硫键。
本发明的fc区的变化，如用苏氨酸取代酪氨酸，所述酪氨酸是ch3区的第9位处的氨基酸；用组氨酸取代丝氨酸，所述丝氨酸是第24位处的氨基酸；用苯丙氨酸取代苏氨酸，所述苏氨酸是第54位处的氨基酸；和用丙氨酸取代苯丙氨酸，所述苯丙氨酸是第75位处的氨基酸，以促进双键，并且因此，可以生产胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物。但是，氨基酸的变化——其不仅包括以上氨基酸的取代还促进双键——可以被包括而没有限制，并且变化通过各种组合是可能的。在本发明的示例性实施方式中，作为代表性实例，igg1用作用于生产的fc区，但是igg2、igg3、igg4等被包括而没有限制。
如在本文中所使用的，术语“免疫球蛋白恒定区”可为形成胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物的部分的结构，并且可包括免疫球蛋白fc区。此外，免疫球蛋白恒定区指的是免疫球蛋白的重链恒定区2(ch2)和重链恒定区3(ch3)，不包括重链和轻链的可变区、其重链恒定区1(ch1)和轻链恒定区1(cl1)，并且可包括重链恒定区中的铰链区。
本发明的免疫球蛋白恒定区可包括1)ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域和ch4结构域；2)ch1结构域和ch2结构域；3)ch1结构域和ch3结构域；4)ch2结构域和ch3结构域；5)一个或两个或多个结构域和免疫球蛋白铰链区(或铰链区的部分)的组合；或6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体。
此外，本发明的免疫球蛋白fc区不仅包括其天然氨基酸序列，还包括其序列衍生物(突变体)。如在本文中所使用的，氨基酸序列衍生物指的是由于至少一个氨基酸残基中的缺失、插入、非保守取代、保守取代或其组合而不同于天然氨基酸序列的氨基酸序列。例如，在iggfc中，在214至238、297至299、318至322或327至331位处——已知其在结合中是重要的——的氨基酸残基可用作适当的修饰位点。此外，可通过移除形成二硫键的位点、在天然fc的n-末端处移除几个氨基酸、在天然fc的n-末端处插入甲硫氨酸残基等来制备各种其它衍生物。此外，为了移除效应子功能，补体-结合位点，例如，c1q-结合位点，可被移除或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)位点可被移除。制备这些免疫球蛋白fc区的序列衍生物的技术在国际公开号wo97/34631和wo96/32478中被公开。
蛋白质和肽中的氨基酸交换——其不改变分子的全部活性——在本领域是已知的(h.neurath，r.l.hill，theproteins，academicpress，newyork，1979)。最常发生的交换是ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thy/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly的氨基酸残基之间的交换。
同时，免疫球蛋白fc区可来自人或动物，包括奶牛、山羊、猪、小鼠、兔子、仓鼠、大鼠和豚鼠，并且优选来自人。此外，免疫球蛋白fc区可为来自igg、iga、igd、ige和igm的fc区，或其组合或通过其杂化物制备的fc区。优选地，其来自igg或igm——其是人血液中的最丰富的蛋白质，并且最优选地来自igg——已知其增强配体-结合蛋白的半衰期。
另一方面，如在本文中所使用的，术语“组合”意思是编码相同起源的单链免疫球蛋白fc区的多肽被连接至不同起源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可由选自iggfc、igafc、igmfc、igdfc和igefc片段的两个或多个片段形成。
如在本文中所使用的，术语“杂化物”意思是对应于不同起源的两个或多个免疫球蛋白fc区的序列存在于单链免疫球蛋白fc区中。在本发明中，各种类型的杂化物是可能的。即，结构域杂化物可由选自iggfc、igmfc、igafc、igefc和igdfc的ch1、ch2、ch3和ch4的一至四个结构域组成，并且可包括铰链区。
同时，igg可被分成igg1、igg2、igg3和igg4亚类，并且本发明可包括其组合和杂化物，优选地，igg2和igg4亚类，并且最优选地，不常具有效应子功能如补体依赖性细胞毒性(cdc)的igg4的fc区，但其并不限于此。
具体地，免疫球蛋白fc区——其是本发明的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物的部分——可为来自人igg1的fc区，但是可以用作缀合物的部分的fc区被包括而没有限制。来自人的fc区较来自非人的fc区更优选，来自非人的fc区可充当人体中的抗原并且引起不期望的免疫应答如针对于抗原的新型抗体的产生。
本发明的这样的胰岛素或胰岛素类似物缀合物不仅可以保持现存的胰岛素的体内活性，如能量代谢和糖代谢，还可以大大增加胰岛素类似物的血清半衰期，并且随后，显著增加肽的体内持续时间，并且因此对于糖尿病的治疗是有用的。
在示例性实施方式中，本发明提供下式1的缀合物。
[式1]
x-la-f1:y-la-f2
其中，在面式中，
x是胰岛素a-链或胰岛素类似物的a-链；
l是连接体；
a是0或自然数，条件是当a是2或更大时每个l彼此独立；
:是化学键；
y是胰岛素b-链或胰岛素类似物的b-链；和
f1和f2包括免疫球蛋白恒定区并且具有fcrn-结合位点。
具体地，在[x-la-f1]和[y-la-f2]表达后的折叠过程期间缀合物的化学键(：)可为f1和f2即，fc区，之间的双键，并且因此，a-链缀合物和b-链缀合物可为异源二聚体的形式。化学键可为二硫键，但不限于此。
f1和f2可为具有氨基酸取代(一种或多种)的非野生型免疫球蛋白区，并且f2和f1可为免疫球蛋白区，其中氨基酸以不同组合被取代，但是这些并不限于此。
在另一个示例性实施方式中，胰岛素类似物的b-链可具有选自胰岛素b-链的第1、第2、第3、第5、第8、第10、第12、第16、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、和第30位处的氨基酸的一个或多个氨基酸，所述氨基酸缺失或用其它氨基酸取代。例如，胰岛素类似物的b-链可具有选自胰岛素b-链的第1、第2、第3、第5、第8、第10、第12、第16、第23、第24、第25、第26、第27、第28、第29、和第30位处的氨基酸的一个或多个氨基酸，所述氨基酸用其它氨基酸取代。
在又一个示例性实施方式中，胰岛素类似物的a-链可具有选自胰岛素a-链的第1、第2、第5、第8、第10、第12、第14、第16、第17、第18、第19、和第21位处的氨基酸的一个或多个氨基酸，所述氨基酸缺失或用其它氨基酸取代。例如，胰岛素类似物的a-链可具有选自胰岛素a-链的第1、第2、第5、第8、第10、第12、第14、第16、第17、第18、第19、和第21位处的氨基酸的一个或多个氨基酸，所述氨基酸用其它氨基酸取代。
在又一个示例性实施方式中，胰岛素类似物具有选自b-链的第8、第23、第24、和第25位处的氨基酸和a-链的第1、第2、第14、和第19位处的氨基酸的一个或多个氨基酸，所述氨基酸用其它氨基酸取代。
在又一个示例性实施方式中，取代的氨基酸可选自丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和天冬氨酸。
在又一个示例性实施方式中，取代的氨基酸可为选自b-链的第8、第23、第24、和第25位处的氨基酸和a-链的第1、第2、和第19位处的氨基酸的一个或多个氨基酸，所述氨基酸用丙氨酸取代，或可选地取代的氨基酸可为用谷氨酸或天冬酰胺取代的a-链的第14位氨基酸，但这些并不限于此。
在又一个示例性实施方式中，l选自肽、聚乙二醇、脂肪酸、糖类、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸、和其组合。
在又一个示例性实施方式中，x和f1、和y和f2通过l以共价化学键、非共价键、或其组合而彼此连接。
在又一个示例性实施方式中，f是iggfc区。
本发明的另一方面是编码胰岛素或其类似物的多核苷酸；包含多核苷酸的表达载体；和包含表达载体的转化体。
胰岛素和/或其类似物与先前所述相同。
多核苷酸指的是以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸(dna)或核糖核苷酸(rna)，包括基因组dna、cdna和由其转录的rna，并且核苷酸作为基本构成单元不仅包括天然核苷酸还包括具有糖或碱基修饰的类似物(scheit,nucleotideanalogs,johnwiley,newyork,1980；uhlmanandpeyman,chemicalreviews,90:543-584,1990)。本发明的多核苷酸可使用分子生物学中的标准技术进行分离或制备。
根据本发明的重组载体可被构建为用于典型克隆或表达的载体，并且可被构建为将原核细胞或真核细胞用作宿主细胞的载体。
如在本文中所使用的，术语“载体”指的是能够在合适的宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，所述重组载体是核酸构建体，其包括可操作地连接以使核酸插入物能够表达的必需调节因子。本发明可以制备包含编码胰岛素或其类似物的核酸的重组载体。此外，可以通过将重组载体转化或转染到宿主细胞中来获得胰岛素和/或其类似物。
在本发明中，编码胰岛素和/或其类似物的核酸被可操作地连接至启动子。如在本文中所使用的，术语“可操作地连接”指的是用于核酸表达的调节序列(例如，启动子、信号序列、核糖体-结合位点、转录终止序列等)和不同核苷酸序列之间的功能连接，并且调节序列可以通过其调节不同核苷酸序列的转录和/或翻译。
如在本文中所使用的，术语“启动子”指的是位于编码区上游的未翻译核酸序列，其包括聚合酶结合位点并且具有将位于启动子下游的基因开始转录成mrna的能力，即，聚合酶结合并且起始基因转录的dna结构域，并且其位于mrna转录起始的5’结构域。
例如，当本发明的载体是重组载体并且使用原核细胞作为宿主细胞时，通常，能够执行转录的强启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacuv5启动子、lpp启动子、plλ启动子、prλ启动子、rac5启动子、amp启动子、reca启动子、sp6启动子、trp启动子、t7启动子等)、用于开始翻译的核糖体结合位点、和转录/翻译终止序列应该被包括。
此外，可通过操纵质粒(例如，psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列、ppiczα系列、puc19等)、噬菌体(例如，λgt4·λb、λ-charon、λδz1、和m13等)或病毒(例如，sv40等)——其通常在本领域使用，但不限于此——制备在本发明中使用的载体。
同时，当本发明的载体是重组载体并且使用真核细胞作为宿主细胞时，来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、乳头瘤病毒的7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子、和hsv的tk启动子)可被使用，并且通常，包括聚腺苷酰化序列(例如，牛生长激素终止子和来自sv40的聚腺苷酰化序列)作为转录终止序列。
此外，本发明的重组载体包括本领域通常使用的抗生素抗性基因作为选择标记，并且可包括，例如，具有氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素抗性的基因。
本发明的重组载体可另外包括序列以便促进被收集的靶蛋白，即，胰岛素和/或其类似物的纯化。额外包括的序列可为用于蛋白质纯化的标签序列，例如，谷胱甘肽s-转移酶(pharmacia，usa)、麦芽糖结合蛋白(neb，usa)、flag(ibi，usa)、六个组氨酸等，但是靶蛋白纯化所必需的序列的种类并不限于此。
通过包括以上标签序列的重组载体表达的融合蛋白可通过亲和层析进行纯化。例如，当融合谷胱甘肽s-转移酶时，可使用谷胱甘肽——其是酶的底物，并且当使用6个组氨酸的标签时，靶蛋白可通过ni-nta柱容易地收集。
其中转化以上载体的转化体可使用包括编码胰岛素和/或其类似物的多核苷酸的重组载体进行构建。
如在本文中所使用的，术语“转化”指的是将dna引入宿主细胞并使在其中可复制的dna作为染色体因子或通过染色体整合完成的过程，其是通过将外源dna引入细胞而人为造成遗传改变的现象。
本发明中使用的转化方法可以是任何转化方法，并且其可以根据本领域中使用的常规方法容易地进行。通常使用的转化方法的实例可以包括cacl2沉淀法；hanahan法，其使用二甲基亚砜(dmso)作为cacl2沉淀法中的还原剂而具有提高的效率；电穿孔；capo4沉淀法；原生质体融合法；使用碳化硅纤维的搅拌法；农杆菌介导的转化；使用peg的转化；硫酸葡聚糖、阳离子脂质体和干/抑制介导的转化等。
用于转化包括编码根据本发明的胰岛素和/或其类似物的核酸的重组载体的方法可不限制于这些方法，但是用于本领域通常使用的转染或转化的任意方法可被使用而没有限制。
可通过将包括编码胰岛素和/或其类似物的靶核酸的重组载体引入宿主细胞而获得本发明的转化体。
在本发明中使用的适当宿主可不被具体限定，但是可以表达本发明的核酸的任意宿主可被使用。适当宿主的实例可包括属于埃希氏菌属的细菌如大肠杆菌；属于芽孢杆菌属的细菌如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)；属于假单胞菌属的细菌如恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)；酵母如毕赤酵母(pichiapastoris)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；昆虫细胞如草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda(sf9))；和动物细胞如cho、cos、和bsc，但并不限于此。
在又一个示例性实施方式中，本发明提供用于治疗糖尿病的药物组合物，包含本发明的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物。
以上组合物具有以下特征中的一个：(i)相比于胰岛素提高的降低血糖水平的效果；(ii)相比于胰岛素提高的在血液中的持续时间；(iii)体内活性的保持；和(iv)相比于胰岛素降低的作为副作用的低血糖作用。
[发明方式]
以下，本发明将通过参考以下实施例而被更详细地描述。但是，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明不意欲受这些实施例限制。
实施例1：天然胰岛素的a-链和b-链连接物质的基因的合成
在基因水平将免疫球蛋白fc区分别融合至天然胰岛素的a-链和b-链中的每一个，并且插入至表达载体。
具体地，合成连接物质，其中以下天然胰岛素的a-链和b-链中的每一个被包括(表1)。具体地，使用其中丝氨酸——ch3区的第24氨基酸——用组氨酸取代并且其中苯丙氨酸——ch3区的第75氨基酸——用丙氨酸取代的免疫球蛋白fc区来合成被缀合至a-链的免疫球蛋白fc区。此外，使用其中酪氨酸——ch3区的第9氨基酸——用苏氨酸取代并且其中苏氨酸——ch3区的第54氨基酸——用苯丙氨酸取代的免疫球蛋白区来合成被缀合至b-链的免疫球蛋白fc区。
[表1]
实施例2：呈现多顺反子表达的天然胰岛素连接物质的制备
在实施例1的合成后，利用限制酶将b-链-igg1fc连接物质的dna片段插入至具有a-链-igg1fc连接物质的载体，以便在一个载体中表达a-链-igg1fc连接物质和b-链-igg1fc连接物质，所述a-链-igg1fc连接物质和b-链-igg1fc连接物质被插入至表达载体中的每一个。为了构建多顺反子表达系统，表达载体被构建以便以上两种连接物质的基因被插入至pet22b载体——表达载体。替代在其中a-链-igg1fc被插入的载体中分裂a-链-igg1fc连接物质，sali和xhoi限制位点——其存在于多克隆位点中——被分裂，并且然后b-链-igg1fc连接物质的dna片段被插入。对于多顺反子表达，核糖体结合位点在b-链-igg1fc之前被插入以便形成在启动子中包含两个核糖体结合位点的mrna。其后，a-链-igg1fc连接物质和b-链-iggfc连接物质中的每一个通过这两种核糖体结合位点进行表达。
[表2]
当以上多顺反子表达载体在宿主细胞中表达时，一条长mrna在载体内形成。此外，两种蛋白质——其是a-链-igg1fc连接物质和b-链-igg1fc连接物质——分别通过两个核糖体结合位点进行表达。表达的连接物质通过双键彼此进行缀合，igg1ch3的转化位点被相互连接，并且因此a-链-igg1fc连接物质和b-链-igg1fc连接物质可以制备能够形成异源二聚体的胰岛素缀合物。这样的胰岛素缀合物可提高产量，因为当胰岛素缀合物被表达时，其不需要在重折叠过程后移除现有胰岛素缀合物的c-肽等的步骤。
因此，胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物可以稳定地保持降低血糖水平效果并且增加血液中的持续时间，其大大地增加了血清半衰期，因此，本发明的胰岛素和/或胰岛素类似物缀合物可以用作能够改善其给药依从性和降低副作用的胰岛素制剂的活性成分。
虽然已经参考特定说明性实施方式描述了本发明，但是本发明所属领域的技术人员将会理解，本发明可以以其它具体形式体现，而不脱离本发明的技术精神或必要特征。因此，上述实施方式被认为在所有方面是说明的而不是限制性的。此外，本发明的范围由所附权利要求而不是详细描述限定，并且应当理解，来自本发明的含义和范围的所有修改或变化及其等同物都包括在所附权利要求的范围中。