本发明涉及抗lys-c或其他蛋白酶切割的经改性的链霉亲和素分子。这些改性的链霉亲和素分子可以通过对天然的链霉亲和素化学修饰、通过化学合成或通过基因工程来来制备。本发明还涉及编码这些改性的链霉亲和素分子的核酸分子，涉及包括这些核酸分子的载体，以及涉及包含这些核酸分子或载体的细胞。本发明进一步涉及包括所述改性的链霉亲和素分子的固相载体和试剂盒。本发明还涉及这些改性的链霉亲和素分子或这些固相载体在捕获/固定蛋白质、肽、寡核苷酸(例如适体)、多聚核苷酸(dna、rna或pna)、脂质、(多)糖、碳水化合物、代谢物、药物和小分子、天然分子和合成分子中的用途，和涉及所述改性的链霉亲和素分子或所述固相载体在质谱分析中用于鉴定与上述(生物)分子相互作用的蛋白质的用途。本发明进一步涉及一种通过使用所述改性的链霉亲和素分子来降低质谱分析中的背景的方法。
背景技术：
质谱分析是在蛋白质分析中的一种确定的方法。然而，对于质谱分析来说，全长蛋白通常太大。因此，全长蛋白通常会用蛋白酶消化以获得适合分析的较小片段。
目前的发明人通常采用用生物素标记待分析的靶蛋白的方案。利用生物素和链霉亲和素之间的强亲和力通过亲和层析来纯化生物素化的蛋白质。这是通过使用具有共价连接了链霉亲和素的载体材料的亲和柱或通过使用共价连接了链霉亲和素的珠子来实现的。为了生成适合于质谱分析的蛋白质片段，在生物素化的靶蛋白与链霉亲和素结合时，或者在将生物素化的蛋白质从这些柱子或载体洗脱之后，可以将蛋白酶(例如lysc或胰蛋白酶)直接应用于亲和柱或珠子。
然而，蛋白水解消化不仅能够切割靶蛋白，而且能够切割共价结合到载体材料或珠子上的链霉亲和素。链霉亲和素的蛋白水解片段在随后的质谱分析中形成不期望的背景。即使在蛋白酶处理之前，将所述链霉亲和素从珠子/载体上洗脱，也经常会观察到链霉亲和素蛋白片段的背景，因为尽管存在共价连接，链霉亲和素依然会从珠子/载体上泄漏出来。据推测，发生泄漏是因为链霉亲和素是四聚体，而其中只有一个亚基共价连接到珠子或载体材料上。
发明人还采用了一种实验方案来鉴定与感兴趣的分子相互作用的蛋白质。为此，用生物素标记感兴趣的分子并使其结合到共价连接了链霉亲和素的载体材料或珠子上。然后使含有潜在的相互作用配体的样品与载体材料或珠子接触，以捕获潜在的蛋白质相互作用配体。然后蛋白质相互作用可以进行蛋白水解消化(任选地，在从载体材料或珠子上洗脱之后)，并且可以通过质谱分析来分析所述蛋白水解片段。无论蛋白水解消化是在珠子/载体上进行，还是在蛋白相互作用配体洗脱后进行，经常都能再次观察到不期望的链霉亲和素片段的背景。
本发明的技术问题
本发明的发明人现在已经找到了一种制备能够抗蛋白酶切割(尤其是抗lysc和/或胰蛋白酶切割)的改性的链霉亲和素分子的方法，同时仍然维持对生物素的高结合亲和力。
本发明的新型改性的链霉亲和素非常适用于蛋白质纯化中，尤其适用于随后通过质谱分析进行的蛋白质鉴定中。然而，新型的改性的链霉亲和素可以有利地应用于需要具有对生物素的高结合亲和力的、稳定的(即抗蛋白酶)链霉亲和素的其他方法中。
以上概述不必然描述本发明所解决的所有问题。
技术实现要素：
在第一方面，本发明涉及改性的链霉亲和素，其(i)抗至少一种内肽酶的切割，其中所述至少内肽酶对碱性氨基酸是特异性的；和(ii)呈现出10-10m或更小的对生物素的解离常数kd。
在第二方面，本发明涉及核酸分子，其包含编码根据第一方面的改性的链霉亲和素的核苷酸序列。
在第三方面，本发明涉及载体，其包含第二方面的核酸分子。
在第四方面，本发明涉及细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的载体。
在第五方面，本发明涉及固相载体，其包含第一方面的改性的链霉亲和素。
在第六方面，本发明涉及试剂盒，其包含第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体，并且进一步包括至少一种蛋白酶，所述蛋白酶选自lysc、lysn、argc和胰蛋白酶。
在第七方面，本发明涉及第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体或第六方面的试剂盒用于捕获或固定至少一种生物素化分子的用途。
在第八方面，本发明涉及第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体或第六方面的试剂盒用于蛋白质纯化的用途。
在第九方面，本发明涉及第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体或第六方面的试剂盒在质谱分析中的用途。
在第十方面，本发明涉及用于减少质谱分析中的背景的方法，其包括以下步骤：
(i)提供携带有根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；
(ii)使包含生物素化蛋白质的样品与步骤(i)的所述珠子接触，从而使生物素化蛋白质结合至改性的链霉亲和素；
(iii)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(iv)将包含蛋白酶的溶液添加至珠子，从而生成生物素化蛋白质的肽段；
(v)回收步骤(iv)中产生的肽段；和
(vi)任选地，将步骤(v)中回收的肽段进行质谱分析。
在第十一方面，本发明涉及用于减少质谱分析中的背景的方法，其包括以下步骤：
(i)提供携带有根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；
(ii)使包含生物素化蛋白质的样品与步骤(i)的珠子接触，从而使生物素化蛋白质结合至改性的链霉亲和素；
(iii)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(iv)洗脱生物素化蛋白质；
(v)将包含蛋白酶的溶液添加至在步骤(iv)中洗脱的生物素化蛋白质，由此生成生物素化蛋白质的肽段；
(vi)回收步骤(v)中产生的肽段；和
(vii)任选地，将步骤(vi)中回收的肽段进行质谱分析。
在第十二方面，本发明涉及用于捕获分子的蛋白质相互作用配体的方法，其包括以下步骤：
(i)提供携带有根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；
(ii)使生物素化分子与步骤(i)的珠子接触，从而将生物素化分子装载到珠子上；
(iii)使样品与步骤(ii)中获得的装载有生物素化分子的珠子接触，其中所述样品包含生物素化分子的至少一种蛋白质相互作用配体；
(iv)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(v)将包含蛋白酶的溶液添加至珠子，从而生成所述至少一种蛋白质相互作用配体的肽段；
(vi)回收步骤(v)中产生的肽段；和
(vii)任选地，将步骤(v)中回收的肽段进行质谱分析。
在第十三方面，本发明涉及用于捕获分子的蛋白质相互作用配体的方法，其包括以下步骤：
(i)提供携带有根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；
(ii)使生物素化分子与步骤(i)的珠子接触，从而将生物素化分子装载到珠子上；
(iii)使样品与步骤(ii)中获得的装载有生物素化分子的珠子接触，其中样品包含生物素化分子的至少一种蛋白质相互作用配体；
(iv)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(v)洗脱所述至少一种蛋白质相互作用配体；
(vi)将包含蛋白酶的溶液添加至步骤(v)中所洗脱的蛋白质相互作用配体中，由此生成所述至少一种蛋白质相互作用配体的肽段；
(vii)回收步骤(vi)中产生的肽段；和
(viii)任选地，将在步骤(vii)中回收的肽段进行质谱分析。
在第十四方面，本发明涉及用于捕获染色质相关蛋白的方法，其包括以下步骤：
(i)提供待研究其染色质的细胞；
(ii)向细胞中添加甲醛以交联染色质；
(iii)剪切所述染色质样品，从而生成剪切的染色质样品；
(iv)向步骤(iii)中交联的和剪切的染色质样品中添加对感兴趣的染色质相关蛋白有特异性的抗体，从而使感兴趣的蛋白以及交联到感兴趣的蛋白上的分子免疫沉淀；
(v)使来自步骤(iv)的经免疫沉淀的蛋白与用蛋白a或蛋白g包被的珠子接触，从而将经免疫沉淀的蛋白固定在珠子上；
(vi)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(vii)将生物素化核苷酸和dna聚合酶添加至步骤(v)的经免疫沉淀的蛋白，或者当步骤(vi)存在时，添加至步骤(vi)的经免疫沉淀的蛋白，从而将交联至感兴趣的蛋白的dna生物素化；
(viii)任选地，通过洗涤步骤去除步骤(iv)中添加的抗体；
(ix)使来自步骤(vii)的，或者当步骤(viii)存在时来自步骤(viii)的生物素化dna与根据第一方面的携带改性的链霉亲和素的珠子接触，由此捕获来自步骤(vii)的，或者当步骤(viii)存在时来自步骤(viii)的生物素化dna和交联至生物素化dna的蛋白质；
(x)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(xi)任选地，将包含蛋白酶的溶液添加至珠子，从而生成交联至生物素化dna的蛋白质的肽段；
(xii)任选地，回收步骤(xi)中生成的肽段；和
(xiii)任选地，将在步骤(xii)中回收的肽段进行质谱分析。
在第十五方面，本发明涉及用于捕获染色质相关蛋白的方法，其包括以下步骤：
(i)提供待研究其染色质的细胞；
(ii)向细胞中添加甲醛以交联染色质；
(iii)剪切染色质样品，从而生成剪切的染色质样品；
(iv)将生物素化核苷酸和dna聚合酶添加到步骤(iii)的染色质样品中，从而使经剪切的染色质样品内的dna生物素化；
(v)使来自步骤(iv)的生物素化dna与携带根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子接触，从而捕获来自步骤(iv)的生物素化dna以及与交联至生物素化dna的蛋白质；
(vi)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(vii)任选地，将包含蛋白酶的溶液添加至珠子中，由此生成交联至生物素化dna的蛋白质的肽段；
(viii)任选地，回收步骤(vii)中生成的肽段；和
(ix)任选地，将步骤(viii)中回收的肽段进行质谱分析。
发明内容部分不必然描述本发明的所有特征。参考随后的详细描述，其他的实施方式将变得显而易见。
附图说明
图1、来自赖氨酸和精氨酸封闭之前和之后的链霉亲和素包被的珠子用lysc和胰蛋白酶消化所产生的肽的色谱图。
a、未经处理的链霉亲和素珠的胰蛋白酶消化产生了若干种肽，其中最丰富的肽由所示的序列表示。
b、通过还原性甲基化作用封闭赖氨酸后，通过链霉亲和素衍生的肽的缺失证明了链霉亲和素变得难以被lysc消化。
c、在(分别通过环己二酮(cyclohexadione)和还原性甲基化作用)封闭精氨酸和赖氨酸后，链霉亲和素变得难以被胰蛋白酶消化。
图2、通过lysc抗性的链霉亲和素珠子从染色质样品中捕获和鉴定与生物素化dna结合的prc2-复合物。
a、与生物素化dna结合的prc2-复合物的示意图和用于从prc2-复合物中的蛋白质中产生肽段的方法步骤的指示。
符号：三角形：suz12；开放的椭圆形：prc2复合物中的蛋白质；灰色椭圆形：其他瞬时相关蛋白；黑线：dna；实心黑圈：dna上的生物素；倒y：suz12抗体；反转的c：链霉亲和素(未经修饰的或在封闭赖氨酸后(并且任选还有精氨酸))。
b、在进行图2a所述步骤后通过质谱分析鉴定的蛋白质。已鉴定的蛋白质用基因名称表示，已知属于prc2复合物中的蛋白质以粗斜体表示。肽：每种蛋白质中所鉴定的肽数量。肽谱匹配(psm)：表明每种蛋白质中这些肽被鉴定的次数。
图3、不同类型的链霉亲和素的结合能力。
通过测定生物素化dna的回收率来评估包被有不同类型链霉亲和素的珠子的结合能力。左栏：普通的链霉亲和素；中栏：具有改性的赖氨酸和精氨酸残基的链霉亲和素；右栏：具有改性的赖氨酸残基的链霉亲和素。
图4、通过肽基精氨酸脱亚氨酶(pad)将精氨酸残基转化为瓜氨酸残基的反应方案。
图5、通过胰蛋白酶抗性的链霉亲和素珠子从染色质样品中捕获和鉴定与生物素化dna结合的prc2复合物。
捕获、洗脱和胰蛋白酶消化与dna结合的prc2复合物后获得的肽的lc-ms色谱图。
上图：使用普通链霉亲和素珠所获得的肽的lc-ms色谱图。所示序列指示三个最丰富的序列(均衍生自链霉亲和素)。
下图：使用具有封闭赖氨酸和精氨酸(分别被还原性甲基化和环己二酮封闭)的链霉亲和素珠获得的肽的lc-ms色谱图。
图6、通过胰蛋白酶抗性的链霉亲和素珠子从染色质样品中捕获和鉴定与生物素化dna结合的prc2复合物。
该表显示了普通链霉亲和素珠子(左栏，对应于图5的上图)以及赖氨酸和精氨酸改性的链霉亲和素珠子(右栏，对应于图5的下图)上富集的prc2复合物的分析中的肽谱匹配(psm)的数量。
图7、使用改性的链霉亲和素能够在亲和捕获后检测到低丰度的蛋白质。
在普通链霉亲和素珠以及赖氨酸改性的链霉亲和素珠上(红迹线)和精氨酸改性的链霉亲和素珠上(蓝迹线)富集后，所鉴定的蛋白质的离子强度(图a)和肽谱匹配的数量(图b)。所有蛋白质的连续的较高的离子强度(图a)以及每个蛋白质的较大数量的肽谱匹配(图b)，使得k&r改性的链霉亲和素(见图6)的灵敏度总体增高。
具体实施方式
定义
在下面详细描述本发明之前，应该理解，本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应该理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施例的目的，并不意图限制仅由所附权利要求限制的本发明的范围。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
优选地，如在“amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms：(iupacrecommendations)”，leuenberger，h.g.w，nagel，b。和
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包括”以及其变体，将被理解为暗示包括所陈述的成员、整体或步骤或成员、整体或步骤的组，而不排除任何其他成员、整体或步骤或成员、整体或步骤的组。
本发明涉及由罗马数字编号的一个或更多个方法步骤定义的若干种方法。方法步骤的编号并不必然意味着必须按数字指定的顺序进行各个步骤。本领域的普通技术人员将知道步骤顺序是否可以改变，同时仍然可以实现特定方法所期望的目标。
在本说明书的全文中引用了若干文件(例如：专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书、genbank登录号序列目录等)。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明借助于先前的发明而无权先于这种公开。本文引用的一些文件被描述为“通过引用并入”。在这些并入的参考文献的定义或教导与本说明书中记载的定义或教导之间有冲突的情况下，则本说明书的文本优先。
序列：本文涉及的所有序列在所附序列表中公开，其整个内容和公开内容是本说明书的一部分。
链霉亲和素是一种由阿维丁链霉菌(streptomycesavidinii)产生的非糖基化的细菌蛋白质。链霉亲和素的全长序列由183个氨基酸组成(显示为所附的序列表中的seqidno：1)并含有由24个氨基酸组成的信号肽，该信号肽在成熟时被切割以产生成熟形式的链霉亲和素，该成熟形式的链霉亲和素包含159个氨基酸(显示为所附的序列表中的seqidno：2)。由于分泌后蛋白水解消化，从阿维丁链霉菌(s.avidinii)的培养基分离的链霉亲和素通常具有截短的n-端和截短的c-端(参见eabayereatl.，biochemj.(1989)259：369-376；t.sano等人，j.biol.chem.(1995)270(47)：28204-28209)。
如本文所用的，术语“野生型链霉亲和素”是指具有序列表中seqidno：2所示的氨基酸序列的链霉亲和素的成熟形式。
如本文所用的，术语“改性的链霉亲和素”是指基于根据seqidno：2所示的天然存在的链霉亲和素(或根据seqidno：2所示的天然存在的截短形式的氨基酸序列)的链霉亲和素分子，但是含有可能已经引入链霉亲和素分子中的修饰，例如通过化学修饰天然存在的链霉亲和素分子、或通过化学合成含有这种改性的链霉亲和素分子、或通过基因修饰链霉亲和素基因以及在合适的表达宿主中表达经改性的基因，从而产生改性的氨基酸序列。
如本文所用的，表述“化学修饰”不仅包括有机化学领域技术人员已知的修饰，而且还包括生物化学修饰，例如通过酶促反应进行的修饰。例如，精氨酸残基可通过肽基精氨酸脱亚氨酶(pad)的酶活性转化为瓜氨酸残基(见图4)。
为了本发明的目的当改性的链霉亲和素与所讨论的蛋白酶孵育时所获得的切割产物的量仅为对应的野生型链霉亲和素，在相同条件下(相同温度、相同缓冲液条件、相同量的蛋白酶、相同量的野生型链霉亲和素和改性的链霉亲和素等)孵育获得的切割产物的量的25％或更少时，则认为改性的链霉亲和素“抗蛋白酶切割”。如果没有另外指明，则“量”在本文中是指摩尔量。然而，本发明的改性的链霉亲和素具有与亲本天然存在的链霉亲和素分子几乎相同的分子量。因此，无论以摩尔量(以mol，mmol，nmol等量度)还是以质量(以g，mg或μg等量度)测量，上述定义很少或没有没有差别。优选地，与在相同条件下孵育的相应野生型链霉亲和素的对照蛋白水解切割所获得的切割产物的量相比，与所讨论的蛋白酶温育时获得的切割产物的量仅为20％或更少(优选15％或更少；更优选10％或更少，甚至更优选5％或更少，还更优选2％或更少，并且最优选1％或更少)。从狭义上讲，术语“抗蛋白酶切割......”意指改性的链霉亲和素完全不被所讨论的蛋白酶切割。
如本文所用的，如果第一化合物(例如链霉亲和素或抗体)与所述第二化合物(例如生物素或抗原)的解离常数kd为1μm或更小，优选900nm或更小，优选800nm或更小，优选700nm或更小，优选600nm或更小，优选500nm或更小，优选400nm或更小，优选300nm或更小，优选200nm或更小，更优选100nm或更小，更优选90nm或更小，更优选80nm或更小，更优选70nm或更小，更优选60nm或更小，更优选50nm或更小，更优选40nm或更小，更优选30nm或更小，更优选20nm或更小，更优选10nm或更小，甚至更优选5nm或更小，甚至更优选4nm或更小，甚至更优选3nm或更小，甚至更优选2nm或更小，以及甚至更优选1nm或更小时，认为第一化合物与第二化合物结合。
根据本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。“特异性结合”是指与结合至另一个靶标相比，结合部分(例如链霉亲和素或抗体)与其特异性靶标(例如生物素或抗原)的结合更强。如果结合部分与第一靶标的解离常数(kd)跟结合部分与第二靶标的解离常数相比更低，则则与第二靶标相比，结合部分与第一靶标的结合更强。优选地，跟与结合部分不特异性结合的靶标的解离常数(kd)相比，与结合部分特异性结合的靶标的解离常数(kd)低超过10倍，优选超过20倍，更优选超过50倍，甚至更优选超过100倍、200倍、低00倍或1000倍。
如本文所用的，术语“kd”(通常以“mol/l”，有时缩写为“m”量度)意在指第一分子(例如链霉亲和素)与第二分子(例如生物素)之间特定作用的解离平衡常数。用于确定结合亲和力的方法，即用于确定解离常数kd的方法是本领域普通技术人员已知的并且可以例如从本领域已知的以下方法中选择：基于表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance、spr)的技术、生物层干涉法(bio-layerinterferometry、bli)、酶联免疫吸附测定(elisa)、流式细胞术、荧光光谱技术、等温滴定量热法(itc)、分析超速离心、放射免疫测定(ria或irma)和增强化学发光(ecl)。生物素和改性的链霉亲和素之间的结合亲和力也可以通过将改性的链霉亲和素与生物素化的dna探针接触来确定。可以使用定量pcr根据读数来确定结合的dna探针的量。通常，解离常数kd在20℃、25℃或30℃下进行测定。如果没有特别指出，则本文所述的kd值是在25℃下通过elisa测定的。
如本文所用的，术语“结合能力”是指可结合至载体材料的靶分子的最大量(质量或摩尔量)。通常，与载体材料的数量、面积或含量对比，来计算“结合能力”。例如，一种载体材料的结合能力可以表示为μg/珠或每支持材料对应μg/cm2或μg/g。
除非上下文另有规定，否则术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且指通过肽键连接的至少两个氨基酸的线性分子链。
在本发明的一些实施方案中，术语“肽”是指通过肽键连接的2至100个氨基酸的线性分子链。在这些实施方案中，术语“蛋白质”和“多肽”是指任何通过肽键连接的超过100个氨基酸的线性分子链。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中总是可互换使用。术语“多肽”也意在指多肽的翻译后修饰的产物，包括但不限于本领域中已知的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、蛋白水解切割、非天然存在的氨基酸的修饰以及类似的修饰。
如本文所用的，术语“蛋白质相互作用配体”是指与感兴趣的分子相互作用的蛋白质。因此，蛋白质和感兴趣的分子可以被称为相互作用配体。在这种情况下，“相互作用”通常意味着蛋白质结合到感兴趣的分子上，并且特别显示出与感兴趣的分子的特异性结合；其中术语“结合”和“特异性结合”具有如上定义的含义。如本文所用的，术语“蛋白质相互作用配体”不仅指由单一多肽链组成的蛋白质，而且还涉及包含两条或更多条多肽链(也称为“亚基”)的蛋白质复合物。对于本文描述的一些实施方案，将蛋白质复合物的亚基彼此共价连接可能是有利的或必要的。例如，蛋白质复合物的亚基可以用甲醛或戊二醛交联。在另一个实例中，感兴趣的分子可以是核酸分子(例如dna或rna)，并且该核酸可以交联到蛋白质相互作用配体上，例如dna结合蛋白(其中所述dna结合蛋白可以由单个肽组成或可以包含两个或更多个亚基)。
术语“psm”是肽谱匹配(peptidespectrummatches)的缩写，即分配ms观察到的裂解谱到肽的同一性。
如本文所用的，术语“小分子”是指摩尔质量低于1000g/mol、优选低于500g/mol的有机或无机化合物。本发明含义内的“小分子”是非肽(即无肽键)和非核酸化合物。
如本文所用的，术语“寡核苷酸”是指包含2至100个彼此共价连接的核苷酸的核酸分子。
如本文所用的，术语“多核苷酸”是指包含超过100个彼此共价连接的核苷酸的核酸分子。
可用于本发明的核酸分子(即寡核苷酸或多核苷酸)通常将包含磷酸二酯键，尽管在一些情况下包括可具有替代骨架的核酸类似物，包括例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、o-甲基亚磷酰胺连接、和肽核酸骨架和连接。其他类似物核酸包括具有阳性骨架、非离子骨架和非核糖骨架的那些。含有一个或更多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内。可以进行核糖-磷酸骨架的这些修饰以促进标记的添加，或增加这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期。可用于本发明的核酸可以由以下组成：dna、rna、肽核酸(pna)、硫代磷酸酯dna(ps-dna)、2′-o-甲基rna(ome-rna)、2′-o-甲氧基乙基rna(moe-rna)、n3′-p5′氨基磷酸酯(np)、2′-氟-阿拉伯核酸(fana)、锁核酸(lockednucleicacid、lna)、吗啉代磷酰胺(mf)、环己烯核酸(cena)、或三环-dna(tcdna)或这些天然存在的核酸和核酸类似物中的任何的混合物。如本领域技术人员将理解的，所有这些核酸类似物可用于本发明。另外，可以制备天然存在的核酸如dna和rna及类似物的混合物。或者，可以制备不同核酸类似物的混合物，以及天然存在的核酸和类似物的混合物。
本发明的实施例
现在将进一步描述本发明。在以下段落中更详细地定义了本发明的不同方面。除非有明确的相反指示，下面定义的每个方面可以与任何其他方面或几个方面相结合。尤其是，任何被指示为优选或有利的特征可以与任何被指示为优选或有利的其他特征相组合。
在第一方面，本发明涉及改性的链霉亲和素，其
(i)抗至少一种内肽酶的切割，其中所述至少一种内肽酶对碱性氨基酸是特异性的；和
(ii)呈现出10-10m或更小的对生物素的解离常数kd。
在第一方面的一些实施方案中，所述至少一种内肽酶选自lysc、lysn、argc和胰蛋白酶。在第一方面的具体实施方案中，改性的链霉亲和素同时抗lysc和胰蛋白酶的切割。
在第一方面的一个实施方案中，改性的链霉亲和素对于生物素的解离常数kd为10-15m至10-10m的范围内；例如10-14m至10-11m，或者10-13m至10-12m的范围内。
在第一方面的一个实施方案中，所述至少一种内肽酶选自lysc、lysn和胰蛋白酶，并且至少一个赖氨酸残基携带选自以下的至少一种化学修饰：
(i)中和赖氨酸侧链的正电荷的化学修饰；和
(ii)取代赖氨酸中ε氨基的氢从而将伯胺转化为仲胺或叔胺的化学修饰。
“theproteinprotocolshandbook”(2009)第3版(walkerj.m.编辑，humana出版社)中描述了赖氨酸残基的这种化学修饰，特别是赖氨酸残基的ε-氨基的化学修饰。
例如，氨基侧链可被酰化(使用例如乙酸酐)或被三硝基苯磺酸(tnbs)烷基化；这些反应改变了氨基的大小和电荷。使用二羧酸酐(例如琥珀酸酐)的其它修饰，用带负电荷的羧基取代带正电荷的氨基。脒化作用和还原烷基化作用为赖氨酸的ε-氨基结构的改性提供了机会，同时维持了正电荷。
因此，在第一方面的其他实施方案中，所述化学修饰是通过选自以下的化学反应产生的：
(i)赖氨酸残基酰化，其生成酰基-赖氨酸；优选赖氨酸残基乙酰化，其产生乙酰基-赖氨酸(例如通过使用乙酸酐)；
(ii)赖氨酸残基的还原烷基化，其生成二烷基-赖氨酸；优选赖氨酸残基的还原性甲基化，其产生二甲基-赖氨酸；
(iii)赖氨酸残基与丙酸酐反应，其生成丙酰赖氨酸；
(iv)赖氨酸残基与琥珀酸酐反应，其生成赖氨酸二羧酸酐；
(v)赖氨酸残基的烷基化，其生成烷基-赖氨酸；
(vi)赖氨酸残基的脒化反应，其生成赖氨酸的乙脒衍生物。
在第一方面的一个实施方案中，所述至少一种内肽酶选自lysc、lysn和胰蛋白酶，并且改性的链霉亲和素是根据seqidno：2所示的野生型链霉亲和素氨基酸序列的突变蛋白质，其中所述突变蛋白质的特征在于在seqidno：2的至少k121和k132位(分别对应于seqidno：1的k145和k156)的氨基酸交换，并且其中所述突变蛋白质任选地包含1至10个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)内部氨基酸缺失，任选地包含1至10个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)氨基酸插入，任选包含1至10个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)氨基酸交换，任选地包含1至13个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13)n端缺失，和/或任选地包含1至20个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)c端缺失。
在第一方面的优选实施方案中，改性的链霉亲和素是根据seqidno：2所示的野生型链霉亲和素氨基酸序列的突变蛋白质，其中所述突变蛋白质的特征在于在seqidno：2的至少k121和k132位(分别对应于seqidno：1的k145和k156)的氨基酸交换，并且其中所述突变任选地包含1至13个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13)n端缺失和/或任选包含1至20个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)c端缺失。因此，在这些实施方案中，除了k121和k132位置的氨基酸交换以外，改性的链霉亲和素不包含内部氨基酸缺失或氨基酸插入或氨基酸交换。
在第一方面的其他实施方案中，k121和k132彼此独立地被另一种氨基酸置换，其中另一种氨基酸既不是赖氨酸也不是精氨酸。置换k121或k132的氨基酸可以是任何氨基酸，不管它是天然存在的氨基酸还是人造氨基酸，条件是置换氨基酸既不是赖氨酸也不是精氨酸。优选地，置换氨基酸不携带正电荷并且不携带能够在本文所述的内肽酶的活性位点上产生氢键的氢残基。
在第一方面的其他实施方案中，置换k121或k132的氨基酸彼此独立地选自以下中的一种：丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、瓜氨酸、乙酰鸟氨酸、乙酰氨基甲基半胱氨酸、o-乙酰氨基-甲基-高丝氨酸、s-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、乙酰-赖氨酸、丙酰-赖氨酸、羟乙酰-赖氨酸、单氟乙酰-赖氨酸、二氟乙酰-赖氨酸、三氟乙酰-赖氨酸、巴豆酰基-赖氨酸和二甲基-赖氨酸。
在第一方面的一些实施方案中，所述至少一种内肽酶选自argc和胰蛋白酶，并且一个或更多个精氨酸残基携带选自以下的至少一种化学修饰：(i)化学修饰，中和胍基的正电荷的化学修饰；和(ii)取代胍基上的一个或更多个氢的化学修饰。在第一方面的一些实施方案中，所述化学修饰通过选自以下中的至少一种化学反应产生：(i)精氨酸残基与二羰基化合物反应，其生成一种改性的精氨酸残基；(ii)精氨酸残基氨甲酰化，其生成氨甲酰化的精氨酸；和(iii)精氨酸残基的去亚胺基化，其生成瓜氨酸残基。特别适用于反应(i)的二羰基化合物是α-二羰基化合物，其包括二醛、酮醛和二酮。合适的α-二羰基化合物包括但不限于联乙酰、丙酮酸、乙二醛、甲基乙二醛、脱氧肌酮、3-脱氧肌酮、丙二醛、2-氧代丙醛、苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮和1，2-环己二酮。在wo2004/046314a2中描述了精氨酸残基和二羰基化合物之间的化学反应。适合于进行氨甲酰化反应(ii)的试剂是异氰酸。根据反应(iii)的精氨酸残基的去亚胺基化可以通过生物化学上的，肽基精氨酸脱亚氨酶(pad)的酶促反应进行(参见图4)。
在第一方面的一个实施方案中，所述至少一种内肽酶选自argc和胰蛋白酶，并且改性的链霉亲和素是根据seqidno：2所示的野生型链霉亲和素氨基酸序列的突变蛋白质，其中所述突变蛋白质的特征在于在seqidno：2的r59、r84和r103位置(对应于seqidno：1的r83，r108或r127)上的一个或更多个氨基酸交换，并且其中所述突变任选地包含1和1之间10个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)内部氨基酸缺失，任选地包含1至10个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)氨基酸插入，任选地包含1至10(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9或10)个氨基酸交换，任选地包含1至13个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13个)n端缺失，和/或任选地包含1至20个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20)c端缺失。
除了在seqidno：2的k121和k132位置(分别对应于seqidno：1的k145和k156)上发生氨基酸交换之外，还可以在seqidno：2的r59、r84和r103位置(对应于seqidno：1的r83，r108或r127)处发生氨基酸交换。
在第一方面的优选实施方案中，改性的链霉亲和素是根据seqidno：2的野生型链霉亲和素氨基酸序列的突变蛋白质，其中所述突变蛋白质的特征在于在seqidno：2的r59、r84和r103位(对应于seqidno：1的r83，r108或r127位)上的一个或更多个氨基酸交换，并且其中所述突变任选地包含1至13(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13)个n端缺失，和/或任选地包含1至20个(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个)c端缺失。因此，在这些实施方案中，除r59、r84、r103，k121或k132位的氨基酸交换以外，改性的链霉亲和素不包含内部氨基酸缺失或氨基酸插入或氨基酸交换。
在第一方面的优选实施方案中，r59、r84和/或r103彼此独立地被另一种氨基酸置换，其中另一种氨基酸既不是赖氨酸也不是精氨酸。置换r59、r84或r103的氨基酸可以是任何氨基酸，不管它是天然存在的氨基酸还是人造氨基酸，条件是置换氨基酸既不是赖氨酸也不是精氨酸。优选地，置换氨基酸不携带正电荷并且不携带能够在本文所述的内肽酶的活性位点中产生氢键的氢残基。
在第一方面的其他实施方案中，置换r59，r84或r103的氨基酸彼此独立地选自丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、羟基脯氨酸、瓜氨酸、乙酰鸟氨酸、乙酰氨基甲基半胱氨酸、o-乙酰氨基甲基-高丝氨酸、s-乙酰氨基-乙酰赖氨酸、丙酰赖氨酸、羟基乙酰赖氨酸、单氟乙酰赖氨酸、二氟乙酰赖氨酸、三氟乙酰赖氨酸、巴豆酰基赖氨酸和二甲基赖氨酸。
第二方面，本发明涉及核酸分子，该核酸分子包含编码根据第一方面的改性的链霉亲和素的核苷酸序列。如上所述，根据第一方面的改性的链霉亲和素包括通过化学修饰天然的或人造链霉亲和素所获得的链霉亲和素分子，通过化学合成获得的链霉亲和素分子和通过基因工程获得的链霉亲和素分子。如本领域技术人员将理解的，第二方面仅涉及核酸分子，该核酸分子包含编码第一方面中可通过基因工程获得的改性的链霉亲和素的核苷酸序列。因此，核酸分子优选包含编码如上所述的根据seqidno：2的野生型链霉亲和素氨基酸序列的突变的核苷酸序列。
第三方面，本发明涉及载体，其包含根据第二方面的核酸分子。在优选的实施方案中，所述载体是表达载体。
在第四方面，本发明涉及细胞，其包含第二方面的核酸分子或第三方面的载体(或表达载体)，优选为宿主细胞，更优选为分离的宿主细胞。
宿主细胞是经过核酸序列转化的或能够被核酸序列转化的由此可以表达目的基因细胞。合适的宿主细胞包括原核生物或真核生物。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可用于表达重组蛋白。
在第五方面，本发明涉及固相载体，其包含第一方面的改性的链霉亲和素。
在第五方面的优选实施方案中，固相载体选自珠子、管、芯片、树脂、板、孔、膜、棒、磁珠、多孔膜及其组合。
在第六方面，本发明涉及试剂盒，该试剂盒包含第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体，并且进一步包含至少一种蛋白酶，所述蛋白酶选自lysc、lysn、argc和胰蛋白酶。
优选地，所述试剂盒包含lysc并任选地包含至少一种蛋白酶，所述蛋白酶选自lysn、argc和胰蛋白酶。
或者，所述试剂盒包含胰蛋白酶并且任选地包含至少一种选自lysc，lysn和argc的蛋白酶。
在第六方面的优选实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或更多种选自以下的组分：适合于试剂盒中存在的蛋白酶的缓冲溶液(即适合于lysc的缓冲液，适合于lysn的缓冲液，适合于argc的缓冲液，和/或适合于胰蛋白酶的缓冲液)，蛋白质标准品(优选为生物素化的蛋白质标准品)，消化后用于样品净化的试剂以及使用说明书。
在第七方面，本发明涉及利用第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体或第六方面的试剂盒用于捕获或固定至少一种生物素化的分子的用途。
在第七方面的优选实施方案中，所述至少一种生物素化的分子选自蛋白质、肽、寡核苷酸(例如适体)、多核苷酸(例如dna、rna或pna)、脂质、(多)糖、碳水化合物、代谢物、药物、小分子、天然和合成分子。
第八方面，本发明涉及第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体或第六方面的试剂盒在蛋白质纯化中的用途。
在第九方面，本发明涉及第一方面的改性的链霉亲和素或第五方面的固相载体或第六方面的试剂盒在质谱分析中的用途。
在第九方面的优选实施方案中，该用途用于减少质谱分析的背景。
在第十方面，本发明涉及用于减少质谱分析背景的方法，包括以下步骤：
(i)提供携带根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；
(ii)使包含生物素化蛋白质的样品与步骤(i)的珠子接触，从而使生物素化蛋白质与所述改性的链霉亲和素结合；
(iii)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(iv)将包含蛋白酶的溶液添加至珠子，从而产生生物素化蛋白质的肽段；
(v)回收步骤(iv)中产生的肽段；和
(vi)任选地，将在步骤(v)中回收的肽段进行质谱分析。
在第十方面的一些实施方案中，执行步骤(iii)以去除蛋白质和其他不需要的物质，特别是去除非生物素化的蛋白质。
在第十方面的一些实施方案中，步骤(iv)在一定温度下进行一段时间，以便足以实现生物素化蛋白质的蛋白水解消化。
在第十一方面，本发明涉及用于减少质谱分析背景的方法，包括以下步骤：
(i)提供携带根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；
(ii)使包含生物素化蛋白质的样品与步骤(i)的珠子接触，从而使生物素化蛋白质与所述改性的链霉亲和素结合；
(iii)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(iv)洗脱所述生物素化蛋白质；
(v)将包含蛋白酶的溶液添加至在步骤(iv)中洗脱的生物素化蛋白质，由此生成生物素化蛋白质的肽段；
(vi)回收步骤(v)中产生的肽段；和
(vii)任选地，将步骤(vi)中回收的肽段进行质谱分析。
在第十一方面的一些实施方案中，进行步骤(iii)以去除蛋白质和其他不需要的物质，特别是去除不与生物素化分子结合的蛋白质。
在第十方面的一些实施方案中，步骤(v)在一定温度下进行一段时间，以便足以实现生物素化蛋白质的蛋白水解消化。
在第十二方面，本发明涉及用于捕获分子的蛋白质相互作用配体的方法，其包括以下步骤：
(i)提供携带根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；
(ii)使生物素化分子与步骤(i)的珠子接触，从而将生物素化分子装载到珠子上；
(iii)使样品与步骤(ii)中获得的装载有生物素化分子的珠子接触，其中所述样品包含生物素化分子的至少一种蛋白质相互作用配体；
(iv)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(v)将包含蛋白酶的溶液添加至珠子，从而产生于至少一种蛋白质相互作用配体的肽段；
(vi)回收步骤(v)中产生的肽段；和
(vii)任选地，将步骤(v)中回收的肽段进行质谱分析。
在第十二方面的一些实施方案中，进行步骤(iv)以除去蛋白质和其他不需要的物质，特别是去除不与生物素化分子结合的蛋白质。
在第十二方面的一些实施方案中，步骤(v)在一定温度下进行一段时间，以便足以实现蛋白质相互作用配体的蛋白水解消化。
在第十三方面，本发明涉及用于捕获分子的蛋白质相互作用配体的方法，其包括以下步骤：
(i)提供携带根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子；
(ii)使生物素化分子与步骤(i)的珠子接触，从而将生物素化分子装载到珠子上；
(iii)使样品与步骤(ii)中获得的装载有生物素化分子的珠子接触，其中样品包生物素化分子的含至少一种蛋白质相互作用配体；
(iv)任选地，用洗涤缓冲液洗涤所述珠子；
(v)洗脱所述至少一种蛋白质相互作用配体；
(vi)将包含蛋白酶的溶液添加到在步骤(v)中所洗脱的蛋白质相互作用配体中，由此产生所述至少一种蛋白质相互作用配体的肽段；
(vii)回收步骤(vi)中产生的肽段；和
(viii)任选地，将在步骤(vii)中回收的肽段进行质谱分析。
在第十三方面的一些实施方案中，进行步骤(iv)以除去蛋白质和其他不需要的物质，特别是除去不与生物素化分子结合的蛋白质。
在第十三方面的一些实施方案中，步骤(vi)在一定温度下进行一段时间，以便足以实现蛋白质相互作用配体的蛋白水解消化。
在第十二和第十三方面的一些实施方案中，生物素化分子选自蛋白质、肽、寡核苷酸(例如适体)、多核苷酸(例如dna、rna或pna)、脂质、(多)糖、碳水化合物、代谢物、药物和小分子、天然和合成分子。在本发明的上下文中，术语“分子”还可以指例如，通过交联已经彼此连接的不同分子或不同类型分子的复合物。例如，如本文所用，术语“分子”还可以指通过交联彼此共价连接的来自于同一蛋白质的亚基，指通过交联彼此共价连接的不同蛋白质，或指通过交联彼此而共价连接的蛋白质和多核苷酸。
因此，在第十二和第十三方面的一些实施方案中，生物素化分子是包含生物素化dna的复合物，以及包含彼此交联和/或与生物素化dna交联的染色质相关蛋白的复合物。在下述第十四方面和实施例3中描述了制备包含生物素化dna和染色质相关蛋白的复合物的方法。
在第十四方面，本发明涉及用于捕获染色质相关蛋白的方法，包括以下步骤：
(i)提供待研究其染色质的细胞；
(ii)向所述细胞中添加甲醛以交联染色质；
(iii)剪切染色质样品，从而产生剪切的染色质样品；
(iv)向步骤(iii)的交联的和剪切的染色质样品中加入对感兴趣的染色质相关蛋白质特异的抗体，从而使感兴趣的蛋白以及交联到感兴趣的蛋白上的分子免疫沉淀；
(v)使来自步骤(iv)的经免疫沉淀的蛋白与用蛋白a或蛋白g包被的第一珠子接触，由此将经免疫沉淀的蛋白固定在珠子上；
(vi)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(vii)将生物素化的核苷酸和dna聚合酶添加至步骤(v)的免疫沉淀的蛋白或当步骤(vi)存在时，添加至步骤(vi)的免疫沉淀的蛋白，从而将与感兴趣的蛋白交联的dna生物素化；
(viii)任选地，通过洗涤步骤去除在步骤(iv)中添加的抗体；
(ix)使来自步骤(vii)或者当步骤(viii)存在时来自步骤(viii)的生物素化dna与携带根据第一方面的改性的链霉亲和素的第二珠子接触，从而捕获来自步骤(vii)的，或者当步骤(viii)存在时，来自步骤(viii)的生物素化dna和与所述生物素化dna交联的蛋白质；
(x)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(xi)任选地，将包含蛋白酶的溶液加入所述珠子中，从而产生来自于与生物素化dna交联的蛋白质的肽段；
(xii)任选地，回收步骤(xi)中产生的肽段；和
(xiii)任选地，将在步骤(xii)中回收的肽段进行质谱分析。
肽段的质谱分析允许鉴定从其衍生出肽的蛋白质，并因此允许鉴定与感兴趣的蛋白质相互作用的染色质相关蛋白。
在第十四方面的优选实施方案中，在步骤(iii)和(iv)之间进行离心步骤以收集剪切的染色质。
在第十四方面的另一个替代实施方案中，用蛋白酶消化不在第二珠子上发生，而仅发生在从珠上洗脱生物素化dna(和与之交联的蛋白质)之后。
在第十五方面，本发明涉及用于捕获染色质相关蛋白的方法，包括以下步骤：
(i)提供待研究其染色质的细胞；
(ii)向细胞中加入甲醛以交联染色质；
(iii)剪切染色质样品，从而产生剪切的染色质样品；
(iv)将生物素化的核苷酸和dna聚合酶添加到步骤(iii)的染色质样品中，从而使经剪切的染色质样品内的dna生物素化；
(v)使来自步骤(iv)的生物素化dna与携带根据第一方面的改性的链霉亲和素的珠子接触，从而捕获来自步骤(iv)的生物素化dna以及与所述生物素化dna交联的蛋白质；
(vi)任选地，用洗涤缓冲液洗涤珠子；
(vii)任选地，将包含蛋白酶的溶液加入到珠子中，由此产生与生物素化dna交联的蛋白质的肽段；
(viii)任选地，回收步骤(vii)中产生的肽段；和
(ix)任选地，将步骤(viii)中回收的肽段进行质谱分析。
肽段的质谱分析允许鉴定从其衍生出肽的蛋白质，并且因此允许鉴定基本上所有的染色质相关蛋白质。
在第十五方面的优选实施方案中，在步骤(iii)和(iv)之间进行离心步骤以收集剪切的染色质。
在第十五方面的另一个替代实施方案中，用蛋白酶消化不发生在珠子上，而仅发在从珠子上洗脱生物素化dna(和与其交联的蛋白质)之后。
在第十、十一、十二或十三方面的优选实施方案中，所述样品选自血液、血清、血浆、尿液、组织、细胞培养上清液和细胞裂解物。
在第十、十一、十二、十三、十四、或十五方面的优选实施方案中，所述蛋白酶是选自lysc、lysn、argc和胰蛋白酶的内肽酶，所述蛋白酶优选为lysc或胰蛋白酶。
在第十、十一、十二、十三、十四、或十五方面的优选实施方案中，改性的链霉亲和素与珠子共价结合。
在第十、十一、十二、十三、十四、或十五方面的可选实施方案中，改性的链霉亲和素不存在于珠子上而是存在于色谱柱内的载体材料上。
实施例
提出以下实施例以便为本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的组合物和方法的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为的作为他们的发明的范围。发明人已经努力确保所用数字的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。除非另有说明，分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度，压力是在大气压下或接近大气压。
实施例1：链霉亲和素中赖氨酸残基的还原甲基化
用于封闭赖氨酸残基的化学反应是基于boersema等人描述的还原甲基化方法，该修饰在boersemap.j.等人(2009)nat.protoc.4(4)：484-94中描述。
用已经连接到珠子上的链霉亲和素进行该封闭反应。随后，生物素化蛋白质与经封闭的链霉亲和素结合，并且样品用lysc蛋白酶消化，lysc在赖氨酸残基处切割结合的蛋白而不接触链霉亲和素。
试剂
·50mmph7.5磷酸钠缓冲液4.5ml
·600mmnabh3cn250μl
·4％甲醛250μl
·醋酸(merck，目录号1.00063)
·乙腈(acn)(biosolve，目录号75-05-8)
·氨水溶液(25％(体积/体积)，merck，目录号1.05432)
·甲醛(ch2o)(37％(体积/体积)，sigma，目录号252549)
·甲酸(merck，目录号1.00264)
·氰基硼氢化钠(nabh3cn)(fluka，目录号71435)
·氰基硼氘化钠(nabd3cn)(96％d，isotec，目录号190020)
·磷酸二氢钠(nah2po4)(merck，目录号1.06346)
·磷酸氢二钠(na2hpo4)(merck，目录号1.06580)
·三乙基碳酸氢铵(teab)
方案
1.在100μl的100mmteab中重构样品
2.加入4％甲醛4μl
3.简单地混合并旋转
4.加入600mmnabh3cn4μl
5.在室温下混合1小时
6.加入1％氨水溶液16μl淬灭反应
7.简单地混合并旋转
8.加入8μl甲酸以进一步淬灭并酸化
9.干燥并分析
结果
必须被封闭的最关键的赖氨酸是下面通过下划线标出的那些(k121和k132，分别对应于seqidno：1的k145和k156)：
不希望受特定理论束缚，发明人认为其他赖氨酸残基对于lysc不敏感，或者至少切割效率较低。
实施例2：在化学封闭精氨酸和赖氨酸之前和之后鉴定来自于链霉亲和素的肽
链霉亲和素中的赖氨酸和精氨酸残基分别通过随后的还原甲基化和环己二酮的反应而被封闭。对已经附着在珠子上的链霉亲和素进行所述封闭反应。随后，将链霉亲和素珠子进行胰蛋白酶消化。利用lc-ms分析所获得的肽段。
表1：未改性的链霉亲和素产生的胰蛋白酶肽
对未经改性的链霉亲和素珠进行胰蛋白酶消化，随后通过lc-ms分析，结果鉴定了多个肽(也参见图1a)。总共记录了411个图谱，它们大多数是多次，表明它们的丰度很高(表1)。
表2：化学封闭k′s和r′s后，由链霉亲和素产生的胰蛋白酶切肽
封闭赖氨酸和精氨酸后(分别通过还原性甲基化以及与环己二酮反应)，然后用胰蛋白酶消化，并通过lc-ms进行分析，结果在总的3个图谱中仅鉴定了2个肽(表2)，表明链霉亲和素已经变的难以用胰蛋白酶消化(也参见图1c)。
实施例3：在化学封闭赖氨酸和将精氨酸酶促转化为瓜氨酸之前和之后，鉴定来自链霉亲和素的肽
酶肽基精氨酸脱亚氨酶(peptidylargininedeiminase，pad)能够将精氨酸转化为瓜氨酸(图4)，而瓜氨酸不是胰蛋白酶的底物，从而产生对蛋白水解切割的抗性。
通过化学封闭链霉亲和素中的赖氨酸(如实施例2)，然后用pad酶促处理以将精氨酸转化为瓜氨酸的实验证实了以上内容。这与在消化未改性胰蛋白酶后观察到的411个图谱(表1)形成鲜明对比的是，胰蛋白酶消化导致在总共7个图谱中的鉴定出2个肽(表3)，并且表明与化学改性的链霉亲和素呈现相似的蛋白酶抗性水平(表2)。值得注意的是，与未改性的链霉亲和素(表1)相比，在pad处理后(表3)，精氨酸侧翼肽(arginine-flankedpeptide)r.nahsattwsgqyvggaear.i(seqidno：3)的检测量中的图谱量从88减少至6。总的来说，这表明精氨酸的化学和酶促衍生均导致其抗胰蛋白酶的蛋白水解作用。
表3.化学封闭k′s后以及通过肽基精氨酸脱亚氨酶(pad)酶促转化r′s后，由链霉亲和素产生的胰蛋白酶切肽
从封闭赖氨酸和精氨酸残基之前和之后获得的肽的序列中，可以推断出一些残基比其他残基更重要，以使得链霉亲和素能够抗胰蛋白酶的切割。特别地，封闭seqidno：2的r59、r84、r103、k121和k132(分别对应于seqidno：1的r83、r108、r127、k145和k156)将使链霉亲和素抗胰蛋白酶的切割。这五个关键氨基酸残基用下划线标出：
据推测，其他精氨酸和赖氨酸残基对于胰蛋白酶不敏感，或者至少裂解效率看起来较低。
实施例4：通过lysc抗性链霉亲和素珠子从染色质样品中捕获和鉴定与生物素化dna结合的prc2复合物
实验设置：使用抗suz2的抗体由甲醛交联后的和剪切的染色质进行染色质免疫沉淀(chromatinimmune-precipitation，chip)实验，suz2是prc2复合物的核心组分之一。接下来，通过dna聚合酶，在生物素化核苷酸的存在的情况下，使dna生物素化，并且使dna(连同与其交联的蛋白质)被链霉亲和素珠子捕获(使用未改性的链霉亲和素或者使用通过用还原甲基化作用封闭赖氨酸实现的lysc-抗性的链霉亲和素)。大量洗涤后，用lysc消化蛋白质，收集肽并通过质谱分析鉴定。
图2a显示了prc2复合物的示意图(符号：三角形：suz12；开放的椭圆形：prc2复合物中的蛋白质；灰色椭圆形：其他瞬时相关蛋白质；黑线：dna；实心黑圈：dna上的生物素；倒y：suz12抗体；反转的c：链霉亲和素(未修饰或赖氨酸封闭后))。
在上述过程之后，将通过质谱分析鉴定的蛋白质列于图2b所示的表格中。所鉴定的蛋白质用基因名称表示；已知属于prc2复合体的那些以粗斜体表示。标题为“肽”的列列出了每种蛋白质所鉴定出的肽的数目。标题为“psm”(即肽谱匹配)的列表示每种蛋白质中这些肽被鉴定的次数。
请注意，当使用普通(未修饰)的链霉亲和素时，6个链霉亲和素肽总共被鉴定出637次，表明它们的丰度很高。相反，在封闭赖氨酸后，仅有1个链霉亲和素肽仅被鉴定出2次，表明非常低的丰度。在未改性的链霉亲和素和赖氨酸封闭的链霉亲和素上，均鉴定出所有其他蛋白质、包括整个prc2复合物，具有很高相似性的肽数目和psm。重要的是，来自普通链霉亲和素的样品中链霉亲和素肽的高丰度存在迫使肽分离成10个部分，以降低复杂性并且便于肽的检测，否则将会被链霉亲和素掩蔽，需要lc-ms运行10次。相比之下，对lysc-抗性链霉亲和素生成的样品进行分析，在lc-ms运行单次的情况下，不需要对样品进行分离。因此，与来自普通链霉亲和素的样品相比，来自lysc-抗性珠子的结果仅需要10％的质谱分析时间，同时基本上鉴定出具有相同肽数目的相同蛋白质。
实施例5：赖氨酸和精氨酸的修饰最小地影响结合能力
通过测定生物素化dna的回收率评估包被有不同类型的链霉亲和素的珠子的结合能力(图3)。
与普通链霉亲和素(左栏)相比，k&r改性的链霉亲和素珠的结合能力保持在75％(中间栏)，而k修饰后的链霉亲和素珠子的结合能力甚至增加了约30％(右栏)。
实施例6：通过抗胰蛋白酶的链霉亲和素珠子从染色质样品中捕获和鉴定与生物素化dna结合的prc2复合物
实验设置：实验设置与实施例4相同，除了使用抗胰蛋白酶的链霉亲和素而不是抗lysc的链霉亲和素。通过还原性甲基化封闭赖氨酸并通过与环己二酮反应封闭精氨酸来制备抗胰蛋白酶的链霉亲和素。
图2a显示了prc2复合物的示意图(符号：三角形：suz12；开放的椭圆形：prc2复合物中的蛋白质；灰色椭圆形：其他瞬时相关蛋白质；黑线：dna；实心黑圈：dna上的生物素；倒y：suz12抗体；反转的c：链霉亲和素(未修饰或在封闭赖氨酸和精氨酸后))。
当在普通的链霉亲和素珠上捕获、洗脱和消化与dna结合的prc2复合物后，lc-ms色谱图以链霉亲和素肽为主(图5，上图)，这与k&r改性的链霉亲和素上的捕获不同(图5，下图)。请注意不同的强度等级(109对107)。
图6的表格中显示了，在普通链霉亲和素珠子和k&r改性的链霉亲和素珠子上富集的prc2复合物分析中的肽谱匹配(psm)。标题为“普通链霉亲和素”的栏对应于图5的上图，标题为“k/r改性的链霉亲和素”的栏对应于图5的下图。在来自改性的链霉亲和素的肽不存在的情况下，当利用k&r改性的珠子时，prc2复合物的每种核心组分被鉴定出更大的肽谱匹配。另外与使用普通链霉亲和素时只鉴定了78种蛋白质相比，还发现了224种其他蛋白质。
由于所有蛋白质的连续的较高的离子强度(图7a)和每种蛋白质的较高的肽谱匹配(图7b)，由此经过k&r改性的链霉亲和素(见图5)的灵敏度整体提高。
序列表独立文本信息
seqidno：3链霉亲和素的胰蛋白酶切片段
seqidno：4链霉亲和素的胰蛋白酶切片段
seqidno：5链霉亲和素的胰蛋白酶切片段
seqidno：6链霉亲和素的胰蛋白酶切片段
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seqidno：13链霉亲和素的胰蛋白酶切片段