用于使RNA稳定的3’UTR序列的制作方法

ivt载体可以以标准化方式用作体外转录的模板。这样的ivt载体可具有以下结构：能够实现rna转录的5’rna聚合酶启动子，随后是两侧为3’和/或5’以非翻译区(untranslatedregion，utr)的目的基因，和含有a核苷酸的3’多聚腺苷酸盒。在体外转录之前，通过ii型限制性酶(识别序列对应于切割位点)在多聚腺苷酸盒的下游使环状质粒线性化。因此，多聚腺苷酸盒对应于之后的转录物中的多聚(a)序列。人未成熟树突细胞(humanimmaturedendriticcell，hidc)广泛用于开发和改善用于癌症治疗的免疫治疗。装载有编码特定肿瘤抗原(tumorantigen，ta)的体外转录(ivt)mrna的情况下，hidc能够诱导有效的抗肿瘤响应。然而，使用基于rna的癌症疫苗的有效免疫应答的先决条件为rna的高稳定性和翻译效率。二者都可通过5’-帽、3’多聚(a)尾以及5’和3’非翻译区(utr)的结构修饰来改善。在utr中的序列元件影响翻译效率(主要是5’-utr)和rna稳定性(主要是3’-utr)。在之前的工作中，我们已经表明人β-珠蛋白3’-utr的两个连续拷贝(现称为2hbg；之前也称为2βgutr)有助于更高的转录物稳定性和翻译效率(holtkamp(2006)blood108：4009-4017)。然而，在最终用作体外rna转录之模板的质粒dna中存在人β-珠蛋白3’-utr序列的两个相同拷贝的情况下，具有在其于大肠杆菌(e.coli)中增殖期间重组的风险。同样地，任何克隆方法，尤其是使用基于pcr的扩增的克隆方法都是非常困难的。对于待用作体外转录模板的在3’端具有2hbg的rna编码区的基于pcr的扩增同样如此，因为在此已观察到错误引发(misprime)，其导致人β-珠蛋白3’-utr的一个拷贝的遗失。为了避免这些问题，我们试图鉴定对体外转录的mrna具有稳定作用的、至少与2hbg序列类似，理想地甚至更优于2hbg序列的新序列。本发明的目的是提供具有提高的稳定性和/或翻译效率的rna和用于获得这样的rna的方法。通过在治疗中使用所述rna应可以获得提高的表达等级。这一目的根据本发明通过权利要求书的主题而实现。本发明涉及使rna、特别是mrna的稳定，以及mrna翻译的提高。本发明特别地涉及对rna、特别是体外转录的rna进行修饰，使得提高转录物稳定性和/或翻译效率。根据本发明，已表明，某些序列在rna分子的3’-非翻译区(utr)中改善了稳定性和翻译效率。在转染树突细胞(dc)中使用根据本发明修饰的rna，可以例如提高转染细胞上抗原特异性肽/mhc复合体的密度及其刺激和扩增抗原特异性cd4+和cd8+t细胞的能力。因此，在一个实施方案中，本发明涉及通过使用已经通过根据本发明所述的rna修饰进行修饰的rna来优化用于转染dc的rna疫苗或rna转染的dc疫苗的策略。根据本发明，rna的修饰以及由此的稳定和/或翻译效率提高优选地通过对表达载体进行遗传修饰来实现，所述表达载体优选地用作体外rna转录的模板。这些表达载体允许转录具有根据本发明所述并且优选地介于编码肽或蛋白质的序列(开放阅读框)和多聚(a)序列之间的3’-非翻译区的rna。这些载体也可以允许具有这样的多聚(a)序列的rna的转录，所述多聚(a)序列优选地在所述rna中具有开放端，即所述多聚(a)序列在其3’端侧翼除a核苷酸之外没有其他核苷酸。rna中的开放端多聚(a)序列可以通过将iis型限制性切割位点引入表达载体中来实现，所述表达载体允许在5’rna聚合酶启动子的控制下转录rna，并且包含多聚腺苷酸盒，其中识别序列位于该多聚腺苷酸盒的3’，而切割位点位于上游并且因此在该多聚腺苷酸盒内。在iis型限制性切割位点处的限制性切割使得能够在多聚腺苷酸盒内使质粒线性化。线性化的质粒随后可以用作体外转录的模板，所得转录物以未遮蔽的多聚(a)序列结束。此外，以具有四种核苷酸相等分布的随机核苷酸序列(接头)任选地中断3’多聚腺苷酸盒提高3’多聚腺苷酸盒在大肠杆菌中的稳定性。发明概述在一方面，本发明涉及核酸分子，其在5’→3’转录方向上包含：(a)启动子；(b)可转录核酸序列或用于引入可转录核酸序列的核酸序列；和(c)核酸序列，其当在启动子(a)的控制下转录时编码转录物中的3’-非翻译区，所述3’-非翻译区包含选自以下的核酸序列：(c-1)fcgrt的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-2)lsp1的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-3)ccl22的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-4)aes的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-5)pld3的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-6)mt-rnr1的非编码rna的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-7)hla-drb4的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，和(c-8)根据(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)和(c-7)的两个或更多个核酸序列、片段和/或变体的任意组合。在一个实施方案中，在启动子(a)的控制下的核酸序列(b)和(c)可以被转录以产生共同转录物，其中由核酸序列(c)转录的核酸序列具有活性以提高由可转录核酸序列(b)转录的核酸序列的翻译效率和/或稳定性。在一个实施方案中，核酸序列(b)和(c)未天然连接。在一个实施方案中，(c-4)aes的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：选自seqidno：86至89的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，(c-4)aes的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：seqidno：86的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，(c-6)mt-rnr1的非编码rna的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：选自seqidno：105至121的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，(c-6)mt-rnr1的非编码rna的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体包含选自以下的核酸序列：seqidno：115的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，核酸序列(c-8)包含根据(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)和(c-7)的两个或更多个相同或不同的核酸序列、片段和/或变体的组合。在多个实施方案中，核酸序列(c-8)包含(c-1)与(c-2)、(c-1)与(c-3)、(c-1)与(c-4)、(c-1)与(c-5)、(c-1)与(c-6)、(c-1)与(c-7)、(c-2)与(c-3)、(c-2)与(c-4)、(c-2)与(c-5)、(c-2)与(c-6)、(c-2)与(c-7)、(c-3)与(c-4)、(c-3)与(c-5)、(c-3)与(c-6)、(c-3)与(c-7)、(c-4)与(c-5)、(c-4)与(c-6)、(c-4)与(c-7)、(c-5)与(c-6)、(c-5)与(c-7)、或(c-6)与(c-7)的组合。在一个实施方案中，核酸序列(c-8)包含(c-4)aes的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体与(c-6)mt-rnr1的非编码rna的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体的组合。在一个实施方案中，(c-4)aes的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体位于(c-6)mt-rnr1的非编码rna的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体的5’。在一个实施方案中，(c-4)aes的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体与(c-6)mt-rnr1的非编码rna的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体的组合包含选自以下的核酸序列：seqidno：174的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，本发明的核酸分子还包含(d)核酸序列，其当在启动子(a)的控制下转录时，编码作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列。在一个实施方案中，所述多聚腺苷酸序列包含至少20个a核苷酸，优选至少40个、至少80个、至少100个或至少120个a核苷酸，优选连续a核苷酸。在一个实施方案中，所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列是具有两个或更多个连续核苷酸的序列，优选任意序列，其中所述具有两个或更多个连续核苷酸的序列中的第一个和最后一个核苷酸是除a核苷酸之外的核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸序列(d)是这样的核酸序列，其当在启动子(a)的控制下转录时，编码作为多聚腺苷酸序列的、在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列，并且其在所述核酸分子在大肠杆菌(escherichiacoli)中扩增之后，与包含以核酸序列(d)’代替所述核酸序列(d)的核酸分子相比表现出更高的稳定性，所述核酸序列(d)’当在启动子(a)的控制下转录时，编码具有与所述作为多聚腺苷酸序列的、在所述多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列之相同长度的多聚腺苷酸序列。在一个实施方案中，所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列包含至少80个核苷酸，优选至少90或100个核苷酸。在一个实施方案中，所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列包含至少90个核苷酸，优选至少100个核苷酸，优选至少110个核苷酸。在一个实施方案中，所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列包含约120个核苷酸。在一些具体实施方案中，所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列包含多至200个，优选多至150个并且特别地多至130个核苷酸。在一个实施方案中，所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列中至少90％，优选至少92％，优选至少95％、97％、或98％的核苷酸是所述多聚腺苷酸序列中的a核苷酸(不包括所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列中的a核苷酸)。在一个实施方案中，所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列位于所述多聚腺苷酸序列的第21位至第80位，优选第21位至第60位，更优选第31位至第50位的区域内。在一个实施方案中，在所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列之前是所述多聚腺苷酸序列中的至少20个a残基，优选至少30个、40个或50个a残基。在一些具体实施方案中，在所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列之前是所述多聚腺苷酸序列中的多至80个a残基，优选多至70个或60个a残基。在一个实施方案中，在所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列之后是所述多聚腺苷酸序列中的至少20个a残基，优选至少30个、40个、50个、60个或70个a残基。在一些具体实施方案中，在所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列之后是所述多聚腺苷酸序列中的多至100个a残基，优选多至80个a残基。在一个实施方案中，在所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列之前是所述多聚腺苷酸序列中的20至50个，优选30至40个a残基，并且在其之后是所述多聚腺苷酸序列中的30至80个，优选40至70个a残基。在一个实施方案中，所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的长度为至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个，优选至少10个，更优选至少15个核苷酸。在一个实施方案中，所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的长度为不超过50个，优选不超过30个、更优选不超过20个核苷酸。在一个实施方案中，所述含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列包含不超过3个，优选不超过2个连续a残基，优选不包含连续a残基。在一个实施方案中，在启动子(a)控制下的核酸序列(b)、(c)和(d)可以被转录以产生共同转录物。在一个实施方案中，由核酸序列(c)和任选的(d)转录的核酸序列具有活性以提高由可转录核酸序列(b)转录的核酸序列的翻译效率和/或稳定性。在一个实施方案中，在转录物中，所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列位于3’端。在一个实施方案中，本发明的核酸分子是dna分子。在一个实施方案中，所述核酸分子是表达载体或质粒，例如ivt载体。在一个实施方案中，本发明的核酸分子是闭合环状分子或线性分子。在一个实施方案中，可转录核酸序列包含编码肽或蛋白质的核酸序列，并且用于引入可转录核酸序列的核酸序列是多克隆位点。在一个实施方案中，本发明的核酸分子还包含选自以下的一个或更多个成员：(i)报道基因；(ii)选择标记物；和(iii)复制起点。在一个实施方案中，本发明的核酸分子适合、特别是在线性化之后适合rna、特别是mrna的体外转录。在体外转录之前，通常通过ii型限制性酶(识别序列对应于切割位点)在多聚腺苷酸盒的下游使环状ivt载体线性化。因此，多聚腺苷酸盒对应于之后的转录物中的多聚(a)序列。作为此操作的结果，一些核苷酸在线性化之后保留为酶切割位点的一部分并且在3’端延伸或遮蔽多聚(a)序列。然而，发现具有开放端多聚(a)序列的rna比具有含遮蔽末端的多聚(a)序列的rna更有效地翻译。因此，当用作表达载体时，本发明的核酸分子优选地允许转录具有以下多聚(a)序列的rna，所述多聚(a)序列优选地在所述rna中具有开放端，即所述多聚(a)序列在其3’端侧翼除a核苷酸之外没有其他核苷酸。rna中的开放端多聚(a)序列可以通过将iis型限制性切割位点引入表达载体中来实现，所述表达载体允许在5’rna聚合酶启动子的控制下转录rna，并且包含多聚腺苷酸盒，其中识别序列位于多聚腺苷酸盒的下游，而切割位点位于上游并且因此在该多聚腺苷酸盒内。在iis型限制性切割位点的限制性切割使得能够在多聚腺苷酸盒内使质粒线性化。线性化的质粒随后可以用作体外转录的模板，所得转录物以未遮蔽的多聚(a)序列结束。因此，在一个实施方案中，优选的是，本发明的核酸分子可以以下方式在核酸序列(d)内切割，优选酶促切割或以其他生化方式切割，使得所述切割产生在5’→3’转录方向上包含启动子(a)、核酸序列(b)和(c)、以及核酸序列(d)的至少一部分的核酸分子，其中核酸序列(d)的至少一部分当在启动子(a)的控制下转录时，编码所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列，并且其中在转录物中，3’端核苷酸是所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列的a核苷酸。优选地，在切割之后，核酸分子在用作所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列的模板的链的末端具有t核苷酸，其是用作所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列的模板的核酸序列的一部分。本发明的核酸分子优选地在切割之前是闭合环状分子，并且在切割之后是线性分子。优选地，借助于限制性切割位点来进行切割，所述限制性切割位点优选地是iis型限制性核酸内切酶的限制性切割位点。在一个实施方案中，iis型限制性核酸内切酶的识别序列位于核酸序列(d)3’端下游的5至26个碱基对，优选24至26个碱基对处。在一个实施方案中，根据本发明的核酸分子为闭合环状构造，并且优选地适合、特别是在线性化之后适合rna、特别是mrna的体外转录。在另一些方面，本发明涉及可通过线性化、优选通过在核酸序列(d)中切割以线性化上述核酸分子所获得的核酸分子，并且涉及可通过用在启动子(a)控制下的上述核酸分子进行转录、优选体外转录获得的rna。因此，本发明在一方面涉及在5’→3’方向上包含以下的rna：(a)5’-非翻译区；(b)编码肽或蛋白质的核酸序列；和(c)3’-非翻译区，所述3’-非翻译区包含选自以下的核酸序列：(c-1)fcgrt的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-2)lsp1的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-3)ccl22的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-4)aes的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-5)pld3的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-6)mt-rnr1的非编码rna的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(c-7)hla-drb4的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，和(c-8)根据(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)和(c-7)的两个或更多个核酸序列、片段和/或变体的任意组合。在一个实施方案中，核酸序列(b)和(c)未天然连接。在一个实施方案中，rna还包含(d)核酸序列，其为多聚腺苷酸序列，任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列。在一个实施方案中，所述核酸序列(d)位于所述rna的3’端。在一个实施方案中，核酸序列(c)和任选的(d)具有活性以提高编码肽或蛋白质的核酸序列的翻译效率和/或稳定性。在一个实施方案中，rna还包含(e)5’帽。3’-非翻译区和作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列的一些实施方案如上文针对本发明的核酸分子所述。在另一个方面，本发明涉及获得rna的方法，其包括：(i)提供本发明的核酸分子，以及(ii)使用核酸分子作为模板来转录rna。在另一个方面，本发明涉及获得肽或蛋白质的方法，其包括：(i)根据本发明获得rna的方法来获得编码肽或蛋白质的rna，以及(ii)翻译rna。在一个实施方案中，获得rna的方法或者获得肽或蛋白质的方法还包括在转录核酸分子之前切割核酸分子。在另一个方面，本发明涉及获得rna的方法，其包括：(i)将核酸序列(b)偶联在可转录核酸序列(a)的3’端，所述核酸序列(b)当转录时编码3’-非翻译区，所述可转录核酸序列(a)包含编码肽或蛋白质的核酸序列；以及(ii)转录所获得的核酸，所述3’-非翻译区包含选自以下的核酸序列：(b-1)fcgrt的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(b-2)lsp1的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(b-3)ccl22的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(b-4)aes的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(b-5)pld3的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(b-6)mt-rnr1的非编码rna的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，(b-7)hla-drb4的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体，和(b-8)根据(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)和(b-7)的两个或更多个核酸序列、片段和/或变体的任意组合。在一个实施方案中，核酸序列(a)和(b)可以被转录以产生共同转录物，在所述共同转录物中由核酸序列(b)转录的核酸序列具有活性以提高由可转录核酸序列(a)转录的核酸序列的翻译效率和/或稳定性。在一个实施方案中，核酸序列(a)和(b)未天然连接。在一个实施方案中，所述方法还包括将核酸序列(c)偶联在核酸序列(b)的3’端，所述核酸序列(c)当转录时编码作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列。在一个实施方案中，核酸序列(a)、(b)和(c)可以被转录以产生共同转录物，在所述共同转录物中由核酸序列(b)和任选的(c)转录的核酸序列具有活性以提高由可转录核酸序列(a)转录的核酸序列的翻译效率和/或稳定性。3’-非翻译区和作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列的一些实施方案如上文针对本发明的核酸分子所述。在另一个方面，本发明涉及获得肽或蛋白质的方法，其包括：(i)通过本发明获得rna的方法来获得rna，以及(ii)翻译rna。本发明的方法可以在体外或体内进行。在本发明任一种方法的一个实施方案中，转录在体外进行。在一个实施方案中，获得rna的方法或者获得肽或蛋白质的方法还包括在转录核酸分子之前切割核酸分子。在一个实施方案中，在所述当转录时编码作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列的核酸序列内以这样的方式进行切割，使得以这种方式获得的核酸的转录产生以下转录物，所述转录物在其3’端具有所述作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列，其中所述转录物的3’端核苷酸是作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列的a核苷酸。在根据本发明的方法的所有方面，优选地借助于限制性切割位点来进行切割，所述限制性切割位点优选地是iis型限制性核酸内切酶的限制性切割位点。在一个实施方案中，iis型限制性核酸内切酶的识别序列是在以下核酸序列的3’端下游的5至26个碱基对，优选24至26个碱基对，所述核酸序列当转录时编码作为多聚腺苷酸序列的、任选地在该多聚腺苷酸序列中包含含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列的核酸序列。本发明还涉及可通过根据本发明的获得rna的方法获得的rna。本发明可以用于例如在细胞转录和表达中提高重组蛋白的表达。更特别地，当产生重组蛋白时，可以使用本发明的表达载体来在基于细胞的系统中转录重组核酸并表达重组蛋白。这包括例如制备重组抗体、激素、细胞因子、酶等。这尤其使得生产成本得以降低。还可以将本发明的核酸分子用于基因治疗应用。因此，本发明的核酸分子可以是基因治疗载体并用于转基因的表达。为此，可以使用任何基于核酸(dna/rna)的载体系统(例如质粒、腺病毒、痘病毒载体、流感病毒载体、甲病毒载体等)。可以在体外、例如在淋巴细胞或树突细胞中转染细胞，或者通过直接施用在体内用这些载体转染细胞。本发明的rna(例如使用本文所述核酸分子作为转录模板获得的)可以用于例如基因的瞬时表达，其中可能的应用领域是基于rna的疫苗，其被体外转染到细胞内或直接体内施用；功能性重组蛋白的体外瞬时表达，例如用来起始细胞中的分化过程或研究蛋白质的功能；以及功能性重组蛋白(例如红细胞生成素、激素、凝固抑制剂等)的体内瞬时表达，特别是作为药物。本发明的rna可以特别地用于转染抗原呈递细胞并且因此作为工具用于递送待呈递抗原并向抗原呈递细胞装载该待呈递抗原，所述待呈递抗原对应于由所述rna表达的肽或蛋白质，或者由所述肽或蛋白质获得，特别地通过例如切割的细胞内加工获得，即，待呈递抗原例如是由rna表达的肽或蛋白质的片段。这样的抗原呈递细胞可以用于刺激t细胞，特别是cd4+和/或cd8+t细胞。因此，在另一个方面，本发明涉及本发明的rna用于转染宿主细胞的用途。在一个实施方案中，宿主细胞是抗原呈递细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。在另一个方面，本发明涉及用于本发明的rna用于治疗、特别是用于疫苗接种的用途。在另一个方面，本发明涉及包含本发明的rna的药物组合物，例如疫苗组合物。在另一个方面，本发明涉及用于本文所述用途的本发明的rna。发明详述尽管下文中详细地描述了本发明，但是应理解，本发明不限于本文中所述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可改变。还应理解，本文中所使用的术语只是为了描述一些特定实施方案的目的，而不旨在限制将仅受所附权利要求书限制的本发明的范围。除非另外限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。下文中，将描述本发明的一些要素。这些要素和具体实施方案一起列出，然而应理解，其可以以任何方式和任意数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的实例和优选实施方案不应解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。该说明书应理解为支持并包括将明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则本申请中所有描述要素的任意排列和组合应视为被本申请的说明书公开。例如，如果在一个优选实施方案中，在含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列之前是所述多聚腺苷酸序列中的至少20个a残基，并且如果在另一个优选实施方案中，在含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列之后是所述多聚腺苷酸序列中的至少20个a残基，则以下方案是所考虑的一个优选实施方案：在含有除a核苷酸之外的核苷酸的一个或更多个连续核苷酸的序列之前和之后是所述多聚腺苷酸序列中的至少20个a残基。优选地，将本文中的术语定义为如“amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms：(iupacrecommendations)”，h.g.w.leuenberger，b.nagel和h.编辑，helveticachimicaacta，ch-4010basel，switzerland，(1995)中所述。除非另外指出，否则本发明的实施将采用本领域的文献中阐明的常规化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组dna技术方法(参见例如，molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，j.sambrook等编辑，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor1989)。除非上下文另外要求，否则在本说明书和所附权利要求书通篇，词语“包含/包括”及其变化形式应理解为意指包括所述要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组，而不排除任何其他要素、整体或步骤或者要素、整体或步骤的组。除非本文中另外指出或者明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应解释为表示一个/种和/或更多个/种。本文中值的范围的记载仅旨在用作单独提及落在所述范围内的各个单独值的速记法。除非本文中另外指出，否则各个单独值被并入本说明书中，就像其在本文中被单独记载。除非本文中另外指出或者明显与上下文相矛盾，否则本文中所述所有方法均可以以任何合适的顺序进行。本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如/如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不对以其他方式要求保护的本发明范围提出限制。本说明书中的语言均不应被解释为指明对实施本发明必需的任何未要求保护的要素。在本说明书的正文通篇引用了数篇文献。本文中无论是在上文还是在下文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、生产商说明书、用法指导等)均在此通过引用整体并入。本文中的内容都不应解释为承认本发明无权由于在先发明而早于这些公开内容。本发明描述了可用作rna表达载体的核酸分子，例如dna质粒，其包含编码rna中对rna具有稳定作用和/或提高rna的翻译效率的经修饰3’非翻译区(utr)的核酸序列。术语“当转录时编码转录物中3’-非翻译区的核酸序列”涉及包含编码所述3’-非翻译区的模板链的核酸序列。优选地，所述核酸序列包含与所产生rna转录物的所述3’-非翻译区含有相同核酸序列的编码链(但是用胸腺嘧啶替代尿嘧啶)。因此，根据本发明，“当转录时编码转录物中3’-非翻译区的核酸序列”在一个实施方案中包含含有如本文所述3’-非翻译区的编码链(但是用胸腺嘧啶替代尿嘧啶)。术语“fcgrt”涉及igg-fc片段受体转运蛋白α，并且包括fcgrt基因。该基因编码与单体免疫球蛋白g的fc区域结合的受体。编码的蛋白质通过胎盘将免疫球蛋白g抗体从母体转移至胎儿。该蛋白质还与免疫球蛋白g结合以保护抗体免受降解。术语“fcgrt的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体”涉及包含以下，优选地由以下组成的核酸序列：选自序列表的seqidno：1至50的核酸序列、或其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，该术语涉及包含以下核酸序列，优选地由以下核酸序列组成的核酸序列，所述核酸序列与选自seqidno：1至50的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的同一性。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列：包含seqidno：27的核酸序列，优选地由其组成；或者包含与seqidno：27的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。术语“lsp1”涉及淋巴细胞特异性蛋白1，并且包括lsp1基因。该基因编码细胞内f-肌动蛋白结合蛋白。该蛋白质在淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和内皮中表达，并且可以调节中性粒细胞运动性、对纤维蛋白原基质蛋白的黏附和跨内皮迁移。术语“lsp1的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体”涉及包含以下，优选地由以下组成的核酸序列：选自序列表的seqidno：51至72的核酸序列、或其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，该术语涉及包含以下核酸序列、优选地由以下核酸序列组成的核酸序列，所述核酸序列与选自seqidno：51至72的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的同一性。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列：包含seqidno：52的核酸序列，优选地由其组成，或者包含与seqidno：52的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。术语“ccl22”涉及趋化因子(c-c基序)配体22并且包括ccl22基因。该基因的产物与趋化因子受体ccr4结合。该趋化因子可以在将活化t淋巴细胞运输至炎性部位和活化t淋巴细胞生理学的其他方面起作用。术语“ccl22的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体”涉及包含以下，优选地由以下组成的核酸序列：选自序列表的seqidno：73至85的核酸序列、或其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，该术语涉及包含以下核酸序列、优选地由以下核酸序列组成的核酸序列，所述核酸序列与选自seqidno：73至85的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的同一性。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列：包含seqidno：79的核酸序列，优选地由其组成；或者包含与seqidno：79的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。术语“aes”涉及氨基末端分裂增强子(amino-terminalenhancerofsplit)并且包括aes基因。由该基因编码的蛋白质属于groucho/tle蛋白质家族，能够作为同寡聚体或作为与其他家族成员的异寡聚体发挥功能以显著抑制其他家族成员基因的表达。术语“aes的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体”涉及包含以下，优选地由以下组成的核酸序列：选自序列表的seqidno：86至89的核酸序列、或其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，该术语涉及包含以下核酸序列、优选地由以下核酸序列组成的核酸序列，所述核酸序列与选自seqidno：86至89的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的同一性。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列：包含seqidno：86的核酸序列，优选地由其组成；或者包含与seqidno：86的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列：包含seqidno：86的第1位至第68位、第1位至第102位、第35位至第102位、第35位至第136位、或第68位至第136位的核酸序列，优选地由组成；或者包含与seqidno：86的第1位至第68位、第1位至第102位、第35位至第102位、第35位至第136位、或第68位至第136位的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。术语“pld3”涉及磷脂酶d家族成员3并且包括pld3基因。该基因编码催化膜磷脂水解的磷脂酶d(pld)酶家族的成员。编码的蛋白质是单次跨膜ii型膜蛋白，并且包含两个pld磷酸二酯酶结构域。该蛋白质影响淀粉样蛋白β前体蛋白的加工。该基因的突变与阿尔茨海默病(alzheimerdisease)的风险相关。术语“pld3的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体”涉及包含以下、优选地由以下组成的核酸序列：选自序列表的seqidno：90至104的核酸序列、或其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，该术语涉及包含以下核酸序列、优选地由以下核酸序列组成的核酸序列，所述核酸序列与选自seqidno：90至104的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的同一性。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列包含seqidno：96的核酸序列，优选地由其组成；或者包含与seqidno：96的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。术语“mt_rnr1”涉及线粒体编码的12srna并且包括mt_rnr1基因。该rna基因属于mt_rrna类。与mt-rnr1相关的疾病包括限制性心肌病和听觉神经病变。在其相关途径中的是真核生物中的核糖体生物发生(ribosomebiogenesis)和cftr翻译精确度(i类突变)。术语“mt_rnr1的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体”涉及包含以下，优选地由以下组成的核酸序列：选白序列表的seqidno：105至121的核酸序列、或其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，该术语涉及包含以下核酸序列、优选地由以下核酸序列组成的核酸序列，所述核酸序列与选自seqidno：105至121的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的同一性。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列：包含seqidno：115的核酸序列，优选地由其组成；或者包含与seqidno：115的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列：包含seqidno：115的第1位至第71位、第1位至第107位、第37位至第107位、第37位至第142位、或第71位至第142位的核酸序列，优选地由其组成；或者包含与seqidno：115的第1位至第71位、第1位至第107位、第37位至第107位、第37位至第142位、或第71位至第142位的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。术语“hla-drb4”涉及ii类主要组织相容性复合体drβ4，并且包括hla-drb4基因。hla-drb4属于ii类hlaβ链旁系同源物。该ii类分子是由α链(dra)和β链(drb)(二者都锚定在膜中)组成的异二聚体。其通过呈递来源于细胞外蛋白的肽而在免疫系统中发挥中心作用。ii类分子在抗原呈递细胞中表达(apc：b淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞)。术语“hla-drb4的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体”涉及包含以下，优选地由以下组成的核酸序列：选自序列表的seqidno：122至143的核酸序列、或其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个实施方案中，该术语涉及包含以下核酸序列、优选地由以下核酸序列组成的核酸序列，所述核酸序列与选自seqidno：122至143的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的同一性。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列：包含seqidno：126的核酸序列，优选地由其组成；或者包含与seqidno：126的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。关于某些基因的3’-非翻译区的核酸序列、其片段、或所述核酸序列或片段的变体的术语“两个或更多个核酸序列、片段和/或变体的任意组合”意指，2个或更多个、3个或更多个或者4个或更多个且优选多至6个或多至5个所述核酸序列、片段和/或变体首尾排列，任选地由接头隔开。在一个实施方案中，两个或更多个核酸序列、片段和/或变体的组合包含两个或更多个不同的和/或两个或更多个相同的核酸序列、片段和/或变体。在一个实施方案中，两个或更多个核酸序列、片段和/或变体的组合包含相同和/或不同基因的3’-非翻译区的两个或更多个不同核酸序列、片段和/或变体。在一个实施方案中，该术语涉及包含以下核酸序列，优选地由以下核酸序列组成的核酸序列，所述核酸序列与选自seqidno：144至220、优选seqidno：174和208至220的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％的同一性。在一个实施方案中，术语涉及包含以下、优选地由以下组成的核酸序列：选自seqidno：144至220、优选seqidno：174和208至220的核酸序列、或其片段、或所述核酸序列或片段的变体。在一个特别优选的实施方案中，该术语涉及以下核酸序列，所述核酸序列：包含seqidno：174的核酸序列，优选由其组成；或者包含与seqidno：174的核酸序列具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％同一性的核酸序列，优选地由其组成。根据本发明的术语“接头”涉及添加在两个核酸序列之间以连接所述两个核酸序列的核酸序列。关于接头序列没有特殊的限制。根据本发明，核酸分子或核酸序列是指核酸，其优选地是脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。根据本发明，核酸包含基因组dna、cdna、mrna、重组制备分子和化学合成分子。根据本发明，核酸可以是单链或双链的线性或共价闭合环状分子的形式。在本发明的上下文中，术语“rna”是指包含核糖核苷酸残基，并且优选地整体上或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子。术语“核糖核苷酸”是指在β-d-呋喃核糖基的2’位具有羟基的核苷酸。术语“rna”包含双链rna、单链rn、分离的rna(例如经部分或完全纯化的rna)、基本上纯的rna、合成的rna和重组产生的rna，例如经修饰的rna，其与天然存在rna的不同之处在于添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸。这样的改变可以包括添加非核苷酸材料，例如向rna的末端或在内部，例如在rna的一个或更多个核苷酸处添加非核苷酸材料。rna分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的rna可以被称为类似物，特别是天然存在rna的类似物。根据本发明，rna包括mrna。术语“mrna”意指“信使rna”，并且涉及通过使用dna模板产生且编码肽或蛋白质的转录物。通常，mrna包含5’-utr、蛋白质编码区、3’-utr和多聚(a)序列。mrna可以由dna模板通过体外转录产生。体外转录方法是技术人员已知的。例如，多种体外转录试剂盒可商购获得。根据本发明，除根据本发明的修饰之外，还可以通过进一步的稳定修饰和加帽来修饰mrna。在本发明的一个实施方案中，rna是自我复制rna，例如单链的自我复制rna。在一个实施方案中，自我复制rna是正义(positivesense)的单链rna。在一个实施方案中，自我复制rna是病毒rna或来源于病毒rna的rna。在一个实施方案中，自我复制rna是甲病毒基因组rna或来源于甲病毒基因组rna。在一个实施方案中，自我复制rna是病毒基因表达载体。在一个实施方案中，病毒是塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)。在一个实施方案中，自我复制rna包含一个或更多个转基因。在一个实施方案中，如果rna是病毒rna或来源于病毒rna，则转基因可以部分地或完全地替换病毒序列，例如编码结构蛋白的病毒序列。在一个实施方案中，自我复制rna是体外转录的rna。术语“5’-帽”是指见于mrna分子的5’端的帽结构，并且一般由通过不常见的5’-5’三磷酸连接与mrna连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位被甲基化。术语“常规的5’-帽”是指天然存在的rna5’-帽，优选是指7-甲基鸟苷帽(m7g)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于rna帽结构并且被修饰以具有使rna稳定(如果附着于rna的话，优选在体内和/或在细胞中)的能力的5’-帽类似物。向rna提供5’-帽或5’-帽类似物可以通过在所述5’-帽或5’-帽类似物存在下体外转录dna模板来实现，其中所述5’-帽共转录并入产生的rna链中，或者可以例如通过体外转录产生rna并且可以在转录后使用加帽酶(例如痘苗病毒的加帽酶)产生5’-帽。根据本发明的术语“核酸”还包括对核酸在核苷酸碱基上、在糖上或在磷酸上的化学衍生化，以及含有非天然核苷酸和核苷酸类似物的核酸。“片段”或“核酸序列的片段”涉及核酸序列的一部分，即展现为在5’和/或3’端缩短的核酸序列的序列。优选地，当片段替代rna分子中的所述核酸序列时，其保留rna稳定性和/或翻译效率。优选地，核酸序列的片段包含来自所述核酸序列的至少80％，优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸残基。根据本发明关于例如核酸和氨基酸序列的术语“变体”包括任何变体，特别是突变体、剪接变体、构象体、异构体、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因的正常序列的改变，其重要性常常不清楚。完整基因测序常常鉴定出给定基因的大量等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同物种来源的核酸或氨基酸序列。根据本发明，与参考核酸相比，核酸变体包含单一或多个核苷酸缺失、添加、突变和/或插入。缺失包括从参考核酸中移除一个或更多个核苷酸。添加变体包含一个或更多个核苷酸(例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个核苷酸)的5’和/或3’端融合。突变可以包括但不限于替换，其中序列中的至少一个核苷酸被移除并且在其位置插入另一个核苷酸(例如颠换和转换)；无碱基位点；交联位点；和化学改变的或经修饰的碱基。插入包括在参考核酸中添加至少一个核苷酸。对于核酸分子，术语“变体”包括简并性核酸序列，其中根据本发明的简并性核酸序列是由于遗传密码的简并性而在密码子序列中与参考核酸不同的核酸。优选地，给定核酸序列与作为所述给定核酸序列之变体的核酸序列之间的同一性程度为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％或最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。同一性程度优选地针对具有至少约30个、至少约50个、至少约70个、至少约90个、至少约100个、至少约150个、至少约200个、至少约250个、至少约300个或至少约400个核苷酸的区域给出。在一些优选实施方案中，同一性程度针对参考核酸序列的整个长度给出。“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示这些序列之间相同的氨基酸或核苷酸的百分比。术语“％同一性”旨在指特别地在待比较的两个序列之间的最佳比对中相同的核苷酸的百分比，其中所述百分比是纯统计学的，并且所述两个序列之间的差异可以在序列的全长内随机分布，并且与参考序列相比，待比较序列可以包含添加或缺失以获得两个序列之间的最佳比对。两个序列的比较通常通过针对区段或“比较窗”在最佳比对之后比较所述序列来进行以鉴定对应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以人工进行，或者借助于smith和waterman，1981，adsapp.math.2，482的局部同源性算法、借助于neddleman和wunsch，1970，j.mol.biol.48，443的局部同源性算法和借助于pearson和lipman，1988，proc.natlacad.sci.usa85，2444的相似性检索算法，或者借助于使用所述算法的计算机程序(wisconsingeneticssoftwarepackage，geneticscomputergroup，575sciencedrive，madison，wis.中的gap、bestfit、fasta、blastp、blastn和tfasta)来进行。百分比同一性如下获得：确定待比较序列对应的相同位置的数目，将该数目除以所比较的位置的数目，并将该结果乘以100。例如，可以使用可在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi上获得的blast程序“blast2sequences”。如果两个序列彼此互补，则核酸与另一核酸“能够杂交”或“发生杂交”。如果两个序列能够彼此形成稳定的双链体，则核酸与另一核酸“互补”。根据本发明，杂交优选地在允许多核苷酸之间特异性杂交的条件(严格条件)下进行。严格条件描述于例如molecularcloning：alaboratorymanual，j.sambrook等，编辑，第2版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，newyork，1989；或者currentprotocolsinmolecularbiology，f.m.ausubel等，编辑，johnwiley&sons，inc.，newyork中，并且是指例如在杂交缓冲液(3.5×ssc，0.02％ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mmnah2po4(ph7)，0.5％sds，2mmedta)中在65℃下杂交。ssc是0.15m氯化钠/0.15m柠檬酸钠，ph7。在杂交后，将转移了dna的膜例如在室温下在2×ssc中洗涤，然后在高至68℃的温度下在0.1至0.5×ssc/0.1×sds中洗涤。百分比互补性表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，watson-crick碱基配对)的连续残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补性)。“完美互补”或“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键键合。优选地，根据本发明的互补性程度为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，或者最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。最优选地，根据本发明的互补性程度为100％。术语“衍生物”包括对核酸在核苷酸碱基上、在糖上或在磷酸上的任何化学衍生化。术语“衍生物”还包括含有非天然存在的核苷酸和核苷酸类似物的核酸。优选地，核酸的衍生化提高其稳定性。特定核酸序列的片段或变体或者与特定核酸序列具有特定同一性程度的核酸序列优选地具有所述特定序列的至少一种功能特性，并且优选地与所述特定序列是功能上等同的，例如展现出与特定核酸序列的特性相同或相似的特性的核酸序列。一个重要特性是保留或提高rna分子的稳定性和/或翻译效率，并且特别地包括能够在与可转录成rna的核酸(可转录核酸序列)或者编码肽或蛋白质的核酸序列的功能性连接中提高由该核酸产生的rna或完整rna分子中编码肽或蛋白质的核酸序列的稳定性和/或翻译效率。在一个实施方案中，如果特定核酸序列具有活性以提高另一核酸序列的翻译效率和/或稳定性，则该特定核酸序列的片段或变体或者与该特定核酸序列具有特定同一性程度的核酸序列也具有活性以提高另一核酸序列的翻译效率和/或稳定性(当其替代该特定核酸序列时)。该特定核酸序列的片段或变体或者与该特定核酸序列具有特定同一性程度的核酸序列的活性可以与该特定核酸序列一样或比其更高，或者该特定核酸序列的片段或变体或者与该特定核酸序列具有特定同一性程度的核酸序列的活性可以为该特定核酸序列的活性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％。根据本发明，“功能性连接”或“功能性连接的”涉及在功能性关系之内的连接。如果核酸与另一核酸序列功能性相关，则其是“功能性连接的”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，则其与所述编码序列功能性连接。功能性连接的核酸通常彼此相邻，适当时，通过另外的核酸序列隔开，并且在一些具体实施方案中，通过rna聚合酶转录产生单个rna分子(共同转录物)。优选地，作为特定序列之变体的序列当其在rna分子中替代该特定序列时保留rna稳定性和/或翻译效率。根据本发明，“来源于核酸序列的核酸序列”是指作为其所来源的核酸的变体的核酸。“核酸的3’端”根据本发明是指具有游离羟基的末端。在双链核酸、特别地dna的图示中，3’端总是在右手边。“核酸的5’端”根据本发明是指具有游离磷酸基团的末端。在双链核酸、特别地dna的图示中，5’端总是在左手边。5’端5′--p-nnnnnnn-oh-3′3’端3′-ho-nnnnnnn-p--5′在一些具体实施方案中，根据本发明，核酸与表达控制序列功能性连接，所述表达控制序列相对于核酸可以是同源的或异源的。如果可转录核酸序列(特别是编码肽或蛋白质的核酸序列)和表达控制序列以这样的方式彼此共价连接，使得可转录核酸序列并且特别是编码核酸序列的转录或表达处于表达控制序列的控制之下或影响之下，则其彼此“功能性”连接。如果需将核酸序列翻译成功能性肽或蛋白质，则诱导与编码序列功能性连接的表达控制序列使得所述编码序列转录，而不引起编码序列中的移码或使得编码序列不能够翻译成所需的肽或蛋白质。根据本发明，术语“表达控制序列”包含启动子、核糖体结合序列和其他控制基因转录或所得rna翻译的控制元件。在本发明的一些具体实施方案中，表达控制序列可以被调控。表达控制序列的精确结构可以因物种或细胞类型而不同，但通常包括分别参与启动转录和翻译的5’-非转录序列以及5’-和3’-非翻译序列，例如tata盒、加帽序列、caat序列等。更具体地，5’-非转录表达控制序列包含启动子区，其包含用于功能性连接的基因的转录控制的启动子序列。表达控制序列也可以包括增强子序列或上游激活序列。本文所述的核酸序列(特别地可转录核酸序列和编码核酸序列)可以与任何表达控制序列(特别是启动子)组合，所述表达控制序列相对于所述核酸序列可以是同源的或异源的，其中术语“同源的”是指核酸序列也与表达控制序列天然地功能性连接的事实，并且术语“异源的”是指核酸序列不与表达控制序列天然地功能性连接的事实。术语“启动子”或“启动子区”是指基因的编码序列上游(5’)的dna序列，其通过提供rna聚合酶的识别和结合位点来控制所述编码序列的表达。启动子区可以包含参与调节所述基因的转录的另一些因子的另一些识别或结合位点。启动子可以控制原核或真核基因的转录。启动子可以是“诱导型”的并且响应于诱导物而启动转录，或者如果转录不受诱导物控制的话，所述启动子可以是“组成型的”。如果没有诱导物，诱导型启动子只在很小的程度上表达或根本不表达。在存在诱导物的情况下，基因“开启”或转录水平提高。这通常通过特定转录因子的结合来介导。根据本发明优选的启动子的一些实例是sp6、t3或t7聚合酶的启动子。根据本发明，术语“表达”以其最通常的含义使用，并且包括rna或者rna和蛋白质的产生。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。对于rna，术语“表达”或“翻译”涉及通过其信使rna的链指导组装氨基酸序列以产生肽或蛋白质的在细胞的核糖体中的过程。术语“可以被转录以产生共同转录物的核酸序列”意指，所述核酸序列以以下方式彼此功能性连接，使得在适当情况下在包含所述核酸序列的核酸分子(特别地闭合环状核酸分子)的线性化(例如限制性酶切割)之后，在启动子控制下的转录产生包含彼此共价结合的所述核酸序列的转录物的rna分子，其中在适当时通过位于其之间的序列隔开。在本发明的上下文中，术语“转录”涉及其中dna序列中的遗传密码转录成rna的过程。随后，rna可以翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中rna、特别地mrna是在无细胞系统中体外合成的过程。优选地，克隆载体应用于转录物的产生。这些克隆载体通常命名为转录载体，并且根据本发明涵盖在术语“载体”中。根据本发明，rna优选地是体外转录的rna(ivt-rna)，并且可以通过合适dna模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何rna聚合酶的任何启动子。用于体外转录的dna模板可以通过克隆核酸(特别地cdna)并将其引入用于体外转录的合适载体中来获得。cdna可以通过rna的逆转录获得。术语“由核酸序列转录的核酸序列”是指在合适的情况下作为完整rna分子的一部分的rna，其是前一种核酸序列的转录产物。术语“具有活性以提高核酸序列的翻译效率和/或稳定性的核酸序列”意指，第二核酸序列能够以以下方式在与第一核酸序列的共同转录物中调节所述第一核酸序列的翻译效率和/或稳定性，使得与没有所述第二核酸序列的所述第一核酸序列的翻译效率和/或稳定性相比，所述翻译效率和/或稳定性提高。在此背景下，术语“翻译效率”涉及由rna分子在特定时间内提供的翻译产物的量，并且术语“稳定性”涉及rna分子的半衰期。rna的修饰以及因此稳定和/或翻译效率提高根据本发明可以如下实现：以以下方式对(当用作表达载体时的)本发明的表达核酸分子进行遗传修饰使得其允许转录在3’端并且优选地在编码肽或蛋白质的序列(开放阅读框)和多聚(a)序列之间具有本文所述3’-非翻译区的rna。术语“3’-非翻译区”涉及位于基因的3’端，在蛋白质编码区的终止密码子下游，并且被转录但不翻译成氨基酸序列的区域，或涉及rna分子中的对应区域。根据本发明，如果第一多核苷酸区域的5’端是所述第一多核苷酸区域中最接近第二多核苷酸区域的3’端的部分，则所述第一多核苷酸区域被认定位于所述第二多核苷酸区域的下游。3’-非翻译区通常从翻译产物的终止密码子延伸至通常在转录过程之后附着的多聚(a)序列。哺乳动物mrna的3’-非翻译区通常具有已知为aauaaa六核苷酸序列的同源区。该序列可能是多聚(a)附着信号并且经常位于多聚(a)附着位点上游的10至30个碱基处。3’-非翻译区可以包含一个或更多个反向重复，其可以折叠以产生茎环结构，所述结构充当核糖核酸外切酶的屏障或与已知提高rna稳定性的蛋白质(例如rna结合蛋白)相互作用。5’-和/或3’-非翻译区根据本发明可以与可转录核酸并且特别是编码核酸功能性连接，以使这些区域与核酸以使得提高由所述可转录核酸转录的rna的稳定性和/或翻译效率的方式相关。免疫球蛋白mrna的3’-非翻译区相对较短(少于约300个核苷酸)，然而另一些基因的3’-非翻译区相对较长。例如，tpa的3’-非翻译区的长度为约800个核苷酸，因子viii的3’-非翻译区的长度为约1800个核苷酸，并且红细胞生成素的3’-非翻译区的长度为约560个核苷酸。根据本发明，可以如下确定3’-非翻译区或来源于其的核酸序列是否提高rna的稳定性和/或翻译效率：将3’-非翻译区或来源于其的核酸序列并入基因的3’-非翻译区，并测定所述并入是否提高合成的蛋白质的量。上述内容相应地适用于其中根据本发明核酸包含两个或更多个3’-非翻译区的情况，所述3’-非翻译区优选地在其之间具有或不具有接头的情况下依次偶联，优选地按照“头对尾关系”顺序偶联(即3’-非翻译区具有相同的方向，优选核酸中天然存在的方向)。根据本发明，术语“基因”是指负责产生一种或更多种细胞产物和/或实现一种或更多种细胞间或细胞内功能的特定核酸序列。更具体地，所述术语涉及包含编码特定蛋白质或者功能性或结构性rna分子的核酸的dna区段。多聚腺苷酸化是将多聚(a)序列或多聚(a)尾添加至初级转录物rna。多聚(a)序列由多个腺苷单磷酸组成。换言之，其是一段只具有腺嘌呤碱基的rna。在真核生物中，多聚腺苷酸化是产生用于翻译的成熟信使rna(mrna)的过程的一部分。因此，其构成更大的基因表达过程的一部分。多聚腺苷酸化的过程开始于基因的转录结束或终止时。新产生的前mrna的最3’区段首先被一组蛋白质切掉；接着这些蛋白质在rna3’端合成多聚(a)序列。多聚(a)序列对于核输出、翻译和mrna稳定性十分重要。该序列随着时间的推移而缩短，并且当其足够短时，mrna会被酶促降解。术语“多聚腺苷酸序列”、“多聚(a)序列”或“多聚(a)尾”是指通常位于rna分子的3’端的腺苷酸残基序列。本发明允许这样的序列通过dna模板基于在与编码链互补的链中的重复胸苷酸残基来在rna转录期间附着，然而所述序列在正常情况下不在dna中编码，而是在细胞核中转录后通过模板独立性rna聚合酶附着至rna的游离3’端。根据本发明，在一个实施方案中，多聚(a)序列具有至少20，优选至少40，优选至少80，优选至少100且优选多至500，优选多至400，优选多至300，优选多至200并且特别地多至150个a核苷酸，优选连续a核苷酸，并且特别地约120个a核苷酸。术语“a核苷酸”或“a”是指腺苷酸残基。在一个优选实施方案中，根据本发明的核酸分子是载体。术语“载体”在此以其最普遍的含义使用并且包括核酸的以下任何中间媒介物，其例如使所述核酸能够引入到原核和/或真核宿主细胞中并且在适当情况下整合到基因组中。这样的载体优选地在细胞中复制和/或表达。载体包含质粒、噬菌粒或病毒基因组。本文所用的术语“质粒”通常涉及可以独立于染色体dna进行复制的染色体外遗传物质的构建体，通常为环状dna双链体。本文所述的核酸可以是重组分子和/或分离的分子。本文所用的“分离的分子”旨在是指基本上不含其他分子例如其他细胞物质的分子。术语“分离的核酸”根据本发明意指，核酸已经：(i)在体外扩增，例如通过聚合酶链反应(pcr)体外扩增；(ii)通过克隆重组产生；(iii)纯化，例如通过切割和凝胶电泳分级纯化；或(iv)合成，例如通过化学合成而合成。分离的核酸是可用于通过重组dna技术操作的核酸。术语“重组的”在本发明的上下中意指“通过基因工程产生的”。优选地，在本发明的上下文中，“重组物质”例如重组细胞是非天然存在的。本文所用的术语“天然存在的”是指物质可见于自然界中的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中和可从自然界来源中分离的并且未在实验中人工有意修饰的肽或核酸是天然存在的。根据本发明，术语“宿主细胞”是指可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明，术语“宿主细胞”包含原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母细胞和昆虫细胞)。特别地优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、灵长类的细胞。细胞可以来源于多种组织类型，并且包含初级细胞和细胞系。一些具体实例包括角质形成细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞和胚胎干细胞。在另一些实施方案中，宿主细胞是抗原呈递细胞，特别地树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。核酸可以以单拷贝或以数个拷贝存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中在宿主细胞中表达。大肠杆菌是埃希氏菌属(escherichia)的革兰氏阴性的兼性厌氧性棒状细菌，其通常见于温血生物体的肠下部。该细菌可以容易且便宜地在实验室环境中生长，并且已经集中研究了60多年。大肠杆菌是研究最广泛的原核模式生物体，并且是生物技术和微生物学领域中的重要物种，其中其用作宿主生物体用于重组dna的大部分工作。根据本发明的大肠杆菌菌株包括：ag1、ab1157、b2155、bl21、bnn93、bnn97、bw26434、c600、csh50、d1210、db3.1、dh1、dh5α、dh10b、dh12s、dm1、e.cloni(r)、大肠杆菌k12er2738、er2566、er2267、hb101、ij1126、ij1127、jm83、jm101、jm103、jm105、jm106、jm107、jm108、jm109、jm110、jm2.300、le392、mach1、mc1061、mc4100、mfdpir、mg1655、omnimax2、rr1、rv308、solr、ss320、stbl2、stbl3、stbl4、sure、sure2、tg1、top10、top10f′、w3110、wm3064、xl1-blue、xl2-blue、xl1-red和xl10-gold。根据本发明，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键彼此连接的2个或更多个，优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选20个或更多个，并且多至优选50个，优选100个或优选150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，优选具有至少151个氨基酸的肽，但通常术语“肽”和“蛋白质”在本文中作为同义词使用。术语“肽”和“蛋白质”根据本发明包含不仅含有氨基酸组分而且还含有非氨基酸组分例如糖或磷酸结构的物质，并且还包含含有例如酯键、硫醚键或二硫键的键的物质。根据本发明，核酸例如rna可以编码肽或蛋白质。因此，可转录核酸序列或其转录物可以包含编码肽或蛋白质的开放阅读框(openreadingframe，orf)。所述核酸可以表达编码的肽或蛋白质。例如，所述核酸可以是编码并表达抗原或者药物活性肽或蛋白质例如免疫活性化合物(其优选地不是抗原)的核酸。根据本发明，术语“编码肽或蛋白质的核酸”意指，如果存在于合适的环境中，优选地在细胞内，核酸可以在翻译过程中指导氨基酸的组装以产生肽或蛋白质。优选地，根据本发明的rna能够与细胞翻译机构相互作用从而允许肽或蛋白质翻译。根据本发明，在一个实施方案中，rna包含药物活性rna或由其组成。“药物活性rna”可以是编码药物活性肽或蛋白质的rna。“药物活性肽或蛋白质”当以治疗有效量施用于对象时对该对象的状况或疾病状态具有积极或有利作用。优选地，药物活性肽或蛋白质具有治疗性或姑息治疗性(palliative)特性并且可以施用以改善、缓解、减轻、逆转、延迟疾病或病症发作，或者减轻疾病或病症的一种或更多种症状的严重程度。药物活性肽或蛋白质可以具有预防特性，并且可以用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病或病理状况的严重程度。术语“药物活性肽或蛋白质”包括完整的蛋白质或多肽，并且也可以是指其药物活性片段。该术语还可以包括肽或蛋白质的药物活性类似物。术语“药物活性肽或蛋白质”包括作为抗原的肽和蛋白质，即肽或蛋白质在对象中引发免疫应答，所述免疫应答可以是治疗性的或者是部分或完全保护性的。药物活性蛋白的一些实例包括但不限于细胞因子和免疫系统蛋白，例如免疫活性化合物(例如白介素、集落刺激因子(colonystimulatingfactor，csf)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，gm-csf)、红细胞生成素、肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，tnf)、干扰素、整联蛋白、地址素(addressin)、选择蛋白(seletin)、归巢受体(homingreceptor)、t细胞受体、免疫球蛋白、可溶性主要组织相容性复合体抗原、免疫活性抗原例如细菌、寄生物或病毒抗原、变应原、自身抗原、抗体)、激素(胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、促激素、催乳素、催产素、多巴胺、牛生长激素、瘦素等)、生长激素(例如，人生长激素)、生长因子(例如，表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子等)、生长因子受体、酶(组织纤溶酶原激活物、链激酶、胆固醇生物合成性或降解性类固醇生成酶(steriodogenicenzyme)、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、脱甲基酶、脱氢酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香酶、细胞色素、腺苷酸或鸟苷酸环化酶、神经酰胺酶(neuramidase)等)、受体(类固醇激素受体、肽受体)、结合蛋白(生长激素或生长因子结合蛋白等)、转录和翻译因子、肿瘤生长抑制蛋白(例如抑制血管生成的蛋白质)、结构蛋白(例如胶原蛋白、丝蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白)、血蛋白(凝血酶、血清白蛋白、因子vii、因子viii、胰岛素、因子ix、因子x、组织纤溶酶原激活物、蛋白c、冯·维勒布兰德因子(vonwilebrandfactor)、抗凝血酶iii、葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase)、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(gcsf)或经修饰因子viii、抗凝剂等)。在一个实施方案中，根据本发明的药物活性蛋白是参与调节淋巴稳态的细胞因子，优选参与并且优选地诱导或增强t细胞的发育、致敏、扩增、分化和/或存活的细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子是白介素。在一个实施方案中，根据本发明的药物活性蛋白是选自il-2、il-7、il-12、il-15和il-21的白介素。术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答，优选地通过诱导和/或抑制免疫细胞成熟、诱导和/或抑制细胞因子生物合成和/或通过刺激b细胞产生抗体改变体液免疫来改变免疫应答的任何化合物。免疫活性化合物具有强效的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可以下调免疫应答的其他方面，例如将免疫应答从th2免疫应答转移，这可用于治疗广泛多种th2介导的疾病。免疫活性化合物可以用作疫苗佐剂。如果根据本发明期望通过使用本文所述的rna来诱导或增强免疫应答，则免疫应答可以由rna触发或增强。例如，由rna编码的蛋白质或肽或者其加工产物可以由抗原呈递细胞上表达的主要组织相容性复合体(mhc)蛋白来呈递。mhc肽复合体随后可以被免疫细胞例如t细胞识别，从而导致其激活。在一个实施方案中，将编码抗原例如疾病相关抗原的rna施用于哺乳动物，特别地如果期望治疗患有涉及该抗原的疾病的哺乳动物的话。rna被摄入到哺乳动物的抗原呈递细胞(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或其他细胞)中。形成rna的抗原性翻译产物并且该产物被展示在细胞表面上以被t细胞识别。在一个实施方案中，抗原被展示在细胞表面上以被针对该抗原的car改造t细胞识别。在一个实施方案中，抗原或通过其任选加工产生的产物在mhc分子的背景下被展示在细胞表面上以通过t细胞的t细胞受体被t细胞识别。或者，本发明设想了以下实施方案，其中将表达抗原的rna引入离体抗原呈递细胞(例如从患者获取的抗原呈递细胞)中，并将抗原呈递细胞、任选地离体克隆增殖的抗原呈递细胞移植回同一患者体内。可以使用本领域已知的任何方法，优选地通过静脉内、腔内、腹膜内或瘤内施用以无菌形式将转染的细胞重新引入患者体内。本发明的方法可以涉及用于表达编码抗原的rna的抗原呈递细胞。为此，本发明的方法可以涉及将编码抗原的rna引入抗原呈递细胞例如树突细胞中。对于抗原呈递细胞(例如树突细胞)的转染，可以使用包含编码抗原的rna的药物组合物。将rna靶向至树突细胞或其他抗原呈递细胞的递送载剂可以被施用于患者，使得发生体内转染。根据本发明，优选地使用编码抗原的rna的以下制剂，其在全身施用后以高选择性将rna递送到脾中的抗原呈递细胞例如树突细胞(dc)中。例如，具有确定颗粒大小的纳米颗粒rna制剂在全身施用之后实现脾dc中的显著rna表达，在所述制剂中颗粒的净电荷接近零或为负，例如rna与脂质体的电中性或带负电荷的脂质复合物(lipoplex)，例如包含dotma和dope或dotma和胆固醇的脂质复合物。确定在靶细胞(脾)中的表达较强，而在其他器官中的表达较低。本文所用的术语“纳米颗粒”是指具有使颗粒适合于全身施用、特别是肠胃外施用的直径(通常小于1000纳米(nm)的直径)的任何颗粒，特别是核酸的颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径为小于600nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径为小于400nm。本文所用的术语“纳米颗粒制剂”或类似术语是指包含至少一种纳米颗粒的任何物质。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是纳米颗粒的均质集合。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是分散体或乳剂。通常来说，当组合至少两种不混溶性物质时，形成分散体或乳剂。术语“脂质复合物”或“核酸脂质复合物”(特别是“rna脂质复合物”)是指脂质与核酸(特别是rna)的复合物。当将通常还包含中性“辅助性”脂质的阳离子脂质体与核酸混合时，脂质复合物自发地形成。如果本发明涉及电荷例如正电荷、负电荷或中性电荷或者阳离子化合物、负性化合物或中性化合物，这通常意指提到的电荷存在于选定的ph，例如生理ph下。例如，术语“阳离子脂质”意指在选定ph例如生理ph下带有净正电荷的脂质。术语“中性脂质”意指在选定ph例如生理ph下无净正电荷或负电荷的脂质并且可以以不带电荷或中性两性离子的形式存在。本文的“生理ph”意指约7.5的ph。本发明中考虑使用的纳米颗粒载体(例如脂质载体)包括可以与核酸例如rna缔合的任何物质或载剂，例如通过与核酸形成复合物或形成核酸被封闭或封装在其中的囊泡来缔合。与裸核酸相比，这可以使得提高核酸的稳定性。特别地，可以提高核酸在血液中的稳定性。阳离子脂质、阳离子聚合物和其他带正电荷的物质可以与带负电荷的核酸形成复合物。这些阳离子分子各自可以用于与核酸复合，从而形成例如所谓的脂质复合物或多聚复合物(polyplex)，并且这些复合物已被表明将核酸递送到细胞内。用于本发明的纳米颗粒核酸制剂可以通过多种方案并且由多种核酸复合化合物获得。脂质、聚合物、寡聚物或两亲物是典型的复合剂。在一个实施方案中，复合化合物包含选自以下的至少一种试剂：鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、多聚-l-赖氨酸、多聚-l-精氨酸或组蛋白。根据本发明，鱼精蛋白可用作阳离子载体剂。术语“鱼精蛋白”是指以下各种具有相对低分子量的强碱性蛋白中的任一种，其富含精氨酸并且发现在不同动物(例如鱼)的精细胞中替代体细胞组蛋白尤其与dna缔合。特别地，术语“鱼精蛋白”是指在鱼精中发现的蛋白质，其具有强碱性，可溶于水，加热不凝固，并且在水解后主要产生精氨酸。以纯化的形式，其用于胰岛素的长效制剂并且用于中和肝素的抗凝作用。根据本发明，本文所用的术语“鱼精蛋白”意指包含获得自或来源于天然或生物来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列，包括其片段和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式。此外，该术语包括以下(合成的)多肽，其是人工的且专为特定目的而设计，并且不能从天然或生物来源中分离。根据本发明使用的鱼精蛋白可以是硫酸化鱼精蛋白或盐酸鱼精蛋白。在一个优选实施方案中，用于产生本文所述纳米颗粒的鱼精蛋白来源是鱼精蛋白5000，其在等张盐溶液中包含超过10mg/ml的鱼精蛋白(每毫升5000个肝素中和单位)。脂质体是微观的脂质囊泡，其通常具有一个或更多个囊泡形成脂质(例如磷脂)双层，并且能够封装药物。在本发明的背景下可以使用不同类型的脂质体，包括但不限于多层囊泡(multilamellarvesicle，mlv)、小单层囊泡(smallunilamellarvesicle，suv)、大单层囊泡(largeunilamellarvesicle，luv)、空间稳定脂质体(stericallystabilizedliposome，ssl)、多泡囊泡(multivesicularvesicle，mv)、和大多泡囊泡(largemultivesicularvesicle，lmv)以及本领域中已知的其他双层形式。脂质体的大小和层性取决于制备方式，并且所使用囊泡类型的选择取决于优选施用模式。存在数种其他其中脂质可以存在于水性介质中的超分子组织形式，包含由单层构成的层状相、六角相和反六角相、立方相、胶束、反胶束。这些相也可以与dna或rna组合获得，并且与rna和dna的相互作用可以显著影响相态。所述相可以存在于本发明的纳米颗粒核酸制剂中。对于由核酸和脂质体形成核酸脂质复合物，可以使用形成脂质体的任何合适方法，只要其提供设想的核酸脂质复合物即可。脂质体可以使用标准方法形成，例如反蒸发法(reverseevaporationmethod，rev)、乙醇注入法、脱水-再水合法(dehydration-rehydrationmethod，drv)、超声处理或其他合适的方法。在脂质体形成后，可以对脂质体进行尺寸调节以获得具有基本上均匀的尺寸范围的脂质体群体。双层形成脂质通常具有两条烃链(特别地酰基链)和极性或非极性的头部基团。双层形成脂质由天然存在脂质构成或是合成来源的，包括磷脂，例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，其中两条烃链的长度通常为约14至22个碳原子，并且具有不同的不饱和度。在本发明的组合物中使用的另一些合适脂质包括糖脂和甾醇，例如胆固醇及其也可用于脂质体中的各种类似物。阳离子脂质通常具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且具有总净正电荷。脂质的头部基团通常携带正电荷。阳离子脂质优选具有1至10价的正电荷，更优选1至3价的正电荷，并且更优选1价的正电荷。阳离子脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-o-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)、二甲基双十八烷基铵(ddab)、1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(dotap)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(dodap)、1，2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷、1，2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、双十八烷基二甲基氯化铵(dodac)、1，2-二豆蔻酰氧基丙基-1，3-二甲基羟乙基铵(dmrie)和2，3-二油酰氧基-n-[2(精胺甲酰胺)乙基]-n，n-二甲基-1-三氟乙酸丙酰胺(dospa)。优选的是dotma、dotap、dodac和dospa。最优选的是dotma。此外，考虑到结构稳定性等，本文所述的纳米颗粒优选地还包含中性脂质。中性脂质可以适当地考虑核酸-脂质复合物的递送效率而选择。中性脂质的一些实例包括但不限于1，2-二-(9z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、甾醇和脑苷脂。优选的是dope和/或dopc。最优选的是dope。在其中阳离子脂质体包含阳离子脂质和中性脂质二者的情况下，可以适当地考虑脂质体的稳定性等决定阳离子脂质与中性脂质的摩尔比。根据一个实施方案，本文所述的纳米颗粒可以包含磷脂。磷脂可以是甘油磷脂。甘油磷脂的一些实例包括但不限于以下三种脂质类型：(i)两性离子磷脂，其包括例如磷脂酰胆碱(pc)、卵黄磷脂酰胆碱、天然大豆来源pc、部分氢化或完全氢化形式、二豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、鞘磷脂(sm)；(ii)带负电荷的磷脂，其包括例如磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酸(pa)、磷脂酰甘油(pg)、二棕榈酰基pg、二豆蔻酰基磷脂酰甘油(dmpg)，其中缀合物使两性离子磷脂带负电荷的合成衍生物，例如甲氧基-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mpeg-dspe)的情况；以及(iii)阳离子磷脂，其包括例如其中磷酸单酯被o-甲基化以形成阳离子脂质的磷脂酰胆碱或鞘磷脂。核酸与脂质载体的缔合可以例如通过核酸填充载体的空隙空间使得载体物理捕获核酸，或者通过共价键合、离子键合或氢键键合，或者通过经由非特异性键的吸附来发生。无论何种缔合方式，核酸必须保留其治疗特性，即抗原编码特性。术语“疾病”是指影响个体机体的异常状况。通常，疾病解释为与特定症状和体征相关的医学状况。疾病可由源自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者其可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。根据本发明，术语“疾病”还指癌症疾病。术语“癌症疾病”或“癌症”(医学术语：恶性赘生物)是指一类疾病，其中一组细胞显示出不受控制的生长(分裂超出正常限度)、入侵(侵入和破坏邻近组织)，并且有时转移(通过淋巴或血液扩散到身体中的其他位置)。癌症的这三种恶性特性将其与自限性且不入侵或转移的良性肿瘤区分开。大多数癌症形成肿瘤，即由细胞(称为赘生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长形成的肿胀或病变，但一些像白血病不形成肿瘤。癌症的一些实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的一些实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(hodgkin′sdisease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)赘生物、神经外胚层癌症、脊柱轴肿瘤、胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明的术语“癌症”还包括癌症转移。术语“感染性疾病”是指可以在个体间或生物体之间播散并且由微生物原(microbialagent)引起的任何疾病(例如，感冒)。感染性疾病的一些实例包括病毒感染性疾病，例如aids(hiv)，甲型、乙型或丙型肝炎，疱疹，带状疱疹(鸡痘)，德国麻疹(风疹病毒)，黄热病，登革热等黄病毒，流感病毒，出血性感染性疾病(马尔堡(marburg)或埃博拉(ebola)病毒)，以及严重急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome，sars)；细菌感染性疾病，例如军团病(legionnaire′sdisease)(军团病杆菌属(legionella))，性传播疾病(例如，衣原体或淋病)，胃溃疡(螺杆菌属(helicobacter))，霍乱(弧菌属(vibrio))，结核病，白喉，大肠杆菌(e.coli)、葡萄球菌属(staphylococci)、沙门菌属(salmonella)或链球菌属(streptococci)(破伤风)感染；原生动物病原体感染，例如疟疾、昏睡病、利什曼病；弓形体病，即，疟原虫、锥虫、利什曼原虫和弓形虫感染；或者真菌感染，其例如由新型隐球酵母(cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞浆菌(histoplasmacapsulatum)、粗球孢菌(coccidioidesimmitis)、皮炎芽生菌(blastomycesdermatitidis)或白色念珠菌(candidaalbicans)引起。术语“自身免疫病”是指身体对其自身组织的某组分产生免疫原性(即，免疫系统)应答的任何疾病。换言之，免疫系统丧失其将体内的某组织或系统识别为自身的能力并对其靶向和攻击，如同其为外来的。自身免疫病可分为其中一个器官主要受影响的那些(例如，溶血性贫血和抗免疫甲状腺炎)和其中自身免疫病过程通过许多组织扩散的那些(例如，系统性红斑狼疮)。例如，多发性硬化被认为由t细胞攻击围绕大脑和脊髓的神经纤维的髓鞘所引起。这导致协调丧失、虚弱和视力模糊。自身免疫病是本领域中已知的并且包括例如桥本氏甲状腺炎(hashimoto’sthyroiditis)、格雷夫斯病(grave’sdisease)、狼疮、多发性硬化、风湿性关节炎、溶血性贫血、抗免疫甲状腺炎、系统性红斑狼疮、乳糜泻、克罗恩病(crohn′sdisease)、结肠炎、糖尿病、硬皮病、银屑病等。根据本发明，可以通过向对象中引入编码抗原(例如，疾病相关抗原)或其片段的合适mrna来刺激免疫应答。术语“抗原”涉及包含表位的物质，针对所述表位将产生免疫应答。特别地，术语“抗原”包括蛋白质、肽、多糖、核酸(特别是rna和dna)、和核苷酸。术语“抗原”还包括仅通过转化(例如，中间在分子内或通过用机体蛋白完成)而变得具有抗原性和致敏的物质。优选地，抗原可由例如抗原呈递细胞(如树突细胞或巨噬细胞)的免疫系统细胞呈递。此外，抗原或其加工产物优选地被t细胞或b细胞受体或者被免疫球蛋白分子如抗体识别。在一个优选实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原。术语“疾病相关抗原”以其最广泛含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是包含表位的分子，所述表位将刺激宿主的免疫系统以针对疾病做出细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答。因此，疾病相关抗原可用于治疗目的。优选地，疾病相关抗原与微生物感染有关，通常为微生物抗原或者与癌症(通常为肿瘤)有关。术语“涉及抗原的疾病”是指涉及抗原的任何疾病，例如其特征在于抗原的存在和/或表达的疾病。涉及抗原的疾病可以是感染性疾病、自身免疫病、或者癌症疾病或简单地癌症。如上所述，抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原。在一个实施方案中，疾病相关抗原是肿瘤相关抗原。在该实施方案中，本发明可用于治疗癌症或癌症转移。优选地，病变器官或组织的特征在于病变细胞如表达疾病相关抗原的癌细胞，和/或病变器官或组织的特征在于其表面与疾病相关抗原有关。用完整或基本完整的肿瘤相关抗原或其片段(例如mhci类和ii类肽)或核酸(特别是编码这样的抗原或片段的mrna)进行免疫接种可以引发mhci类和/或ii类类型应答，并且因此刺激t细胞，例如能够裂解癌细胞的cd8+细胞毒性t淋巴细胞和/或cd4+t细胞。这样的免疫接种还可以引发体液免疫应答(b细胞应答)，使得产生针对肿瘤相关抗原的抗体。此外，可以在体外通过用编码肿瘤抗原的核酸转染来向抗原呈递细胞(apc)(例如树突细胞(dc))装载mhci类呈递的肽，并将所述细胞施用于患者。在一个实施方案中，术语“肿瘤相关抗原”是指可以来源于细胞质、细胞表面和细胞核的癌细胞组分。特别地，“肿瘤相关抗原”是指在细胞内或者作为肿瘤细胞上表面抗原产生、优选大量产生的那些抗原。肿瘤抗原的一些实例包括her2、egfr、vegf、campath1-抗原、cd22、ca-125、hla-dr、霍奇金淋巴瘤(hodgkin-lymphoma)或黏蛋白-1(mucin-1)，但不限于此。根据本发明，肿瘤相关抗原优选地包含在肿瘤或癌症以及肿瘤细胞或癌细胞的类型和/或表达水平方面具有特征性的任何抗原。在一个实施方案中，术语“肿瘤相关抗原”指在正常条件下(即在健康对象中)在有限量的器官和/或组织中或在特定发育阶段特异性表达并且在一个或更多个肿瘤或癌组织中表达或异常表达的蛋白质，例如肿瘤相关抗原可以在正常条件下在胃组织(优选地在胃黏膜中)、在生殖器官中(例如在睾丸中)、在滋养层组织中(例如在胎盘中)或在种系细胞中特异性表达。在该情况下，“有限量”优选地意指不超过3，更优选不超过2或1。在本发明上下文中的肿瘤相关抗原包括例如分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即在正常条件下在特定分化阶段在特定细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌症/睾丸抗原，即在正常条件下在睾丸中并且有时在胎盘中特异性表达的蛋白质；以及种系特异性抗原。在本发明的上下文中，肿瘤相关抗原优选地在正常组织中不表达或仅很少表达，或者在肿瘤细胞中突变。优选地，肿瘤相关抗原或肿瘤相关抗原的异常表达鉴定癌细胞。在本发明的上下文中，对象(例如患有癌症疾病的患者)中由癌细胞表达的肿瘤相关抗原优选地是所述对象中的自身蛋白。在一些优选实施方案中，在本发明上下文中的肿瘤相关抗原在正常条件下在非必需组织或器官，即当被免疫系统损害时不导致对象死亡的组织或器官中或者在免疫系统不可及或仅很难可及的机体器官或结构中特异性表达。优选地，肿瘤相关抗原在mhc分子的背景下由表达其的癌细胞呈递。理想地满足本发明考虑作为肿瘤免疫治疗(特别是肿瘤疫苗接种)中靶结构的肿瘤相关抗原的标准的分化抗原的一些实例是密蛋白家族的细胞表面蛋白，例如cldn6和cldn18.2。这些分化抗原在不同来源的肿瘤中表达，并且由于其选择性表达(在毒性相关的正常组织中不表达)和定位在质膜而特别适于作为靶结构与抗体介导的癌症免疫治疗联合。可用于本发明的抗原的另一些实例为p53、art-4、bage、β-连环蛋白/m(beta-catenin/m)、bcr-ablcamel、cap-1、casp-8、cdc27/m、cdk4/m、cea、claudin-12、c-myc、ct、cyp-b、dam、elf2m、etv6-aml1、g250、gage、gnt-v、gap100、hage、her-2/neu、hpv-e7、hpv-e6、hast-2、htert(或htrt)、lage、ldlr/fut、mage-a(优选mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、或mage-a12)、mage-b、mage-c、mart-1/melan-a、mc1r、肌球蛋白/m、muc1、mum-1、mum-2、mum-3、na88-a、nf1、ny-eso-1、ny-br-1、p190微小bcr-abl(p190minorbcr-abl)、pm1/rara、prame、蛋白酶3、psa、psm、rage、ru1或ru2、sage、sart-1或sart-3、scgb3a2、scp1、scp2、scp3、ssx、survivin、tel/aml1、tpi/m、trp-1、trp-2、trp-2/int2、tpte和wt，优选wt-1。术语“病毒抗原”是指具有抗原特性(即，能够激发个体中的免疫应答)的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。术语“细菌抗原”是指具有抗原特性(即，能够激发个体中的免疫应答)的任何细菌组分。细菌抗原可以来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。“抗原加工”是指使抗原降解成为所述抗原之片段的加工产物(例如，将蛋白质降解成肽)并使这些片段中的一种或更多种与mhc分子缔合(例如，通过结合)以用于被细胞、优选抗原呈递细胞呈递于特定t细胞。如本文使用的术语“免疫应答”涉及针对例如免疫原性生物体(例如细菌或病毒)、细胞或物质的免疫系统反应。术语“免疫应答”包括先天性免疫应答和适应性免疫应答。优选地，免疫应答涉及免疫细胞的激活、细胞因子生物合成的诱导和/或抗体产生。优选地，免疫应答包括以下步骤：激活抗原呈递细胞如树突细胞和/或巨噬细胞；通过所述抗原呈递细胞呈递抗原或其片段；以及由于该呈递而激活细胞毒性t细胞。术语“治疗”涉及改善个体的健康状态和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体中的疾病、阻滞或减缓个体中的疾病发展、抑制或减缓个体中的疾病发生、降低个体中症状的频率和严重程度、和/或降低目前患有或先前曾患有疾病的个体中的复发。特别地，术语“疾病的治疗”包括治愈、缩短持续时间、改善、减缓或抑制疾病或其症状的发展或恶化。术语“免疫治疗”涉及优选地涉及特异性免疫反应和/或免疫效应物功能的治疗。术语“免疫接种”或“疫苗接种”描述了出于治疗或预防原因而治疗对象的过程。如本文使用的术语“对象”或“个体”优选地涉及哺乳动物。例如，在本发明的上下文中的哺乳动物是人，非人灵长类，驯养动物如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等，实验室动物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等，以及圈养动物如动物园的动物。在一个优选实施方案中，对象是人。术语“抗原呈递细胞”(apc)涉及能够展示、获得和/或呈递在其细胞表面上(或在其细胞表面处)的至少一种抗原或抗原片段的多种细胞的细胞。抗原呈递细胞可以区分为专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。术语“专职抗原呈递细胞”涉及组成型表达与初始t细胞相互作用所需的ii类主要组织相容性复合体(mhcii类)分子的抗原呈递细胞。如果t细胞与抗原呈递细胞的膜上的mhcii类分子复合体相互作用，则抗原呈递细胞产生诱导t细胞激活的共刺激分子。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。术语“非专职抗原呈递细胞”涉及不组成型地表达mhcii类分子而是在被诸如干扰素γ的某些细胞因子刺激之后表达mhcii类分子的抗原呈递细胞。示例性的非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“mhc”包括mhci类和mhcii类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合体。mhc蛋白或分子在免疫反应中对淋巴细胞和抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导具有重要意义，其中mhc蛋白或分子与肽结合并将其呈递于被t细胞受体识别。由mhc编码的蛋白质在细胞表面上表达，并且向t细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)二者。根据本发明，术语“嵌合抗原受体”(chimericantigenreceptor，car)与术语“嵌合t细胞受体”和“人工t细胞受体”是同义的。这些术语涉及经改造的受体，其赋予免疫效应细胞(例如t细胞)以任意特异性，例如单克隆抗体的特异性。以这种方式，可以产生大量癌症特异性t细胞用于过继细胞转移。因此，例如代替t细胞自身的t细胞受体或作为其补充，car可存在于t细胞上。这样的t细胞不一定需要抗原的加工和呈递以用于识别靶细胞，而是可优选地以特异性识别存在于靶细胞上的任何抗原。优选地，所述car在细胞的表面进行表达。出于本发明的目的，包含car的t细胞涵盖在如本文使用的术语“t细胞”内。根据本发明，术语“car”(或“嵌合抗原受体”)涉及包含单分子或分子复合体的人工受体，其识别靶细胞(例如癌细胞)上的靶结构(例如抗原)(即与其结合)(例如通过抗原结合结构域与靶细胞表面上表达的抗原结合)并且可赋予免疫效应细胞如在细胞表面上表达所述car的t细胞以特异性。优选地，靶结构被car识别使得表达所述car的免疫效应细胞被激活。car可以包含一个或更多个蛋白质单元，所述蛋白质单元包含如本文所述的一个或更多个结构域。术语“car”不包括t细胞受体。在一个实施方案中，使来自单克隆抗体的单链可变片段(single-chainvariablefragment，scfv)与cd3-ζ跨膜内结构域融合。这种分子使得响应于其在靶细胞上的抗原靶标被scfv识别而传递ζ信号并杀伤表达靶抗原的靶细胞。除此之外，也可使用的抗原识别结构域包括t细胞受体(tcr)α和β单链。实际上，以高亲和力与给定靶标结合的几乎任何物质都可以用作抗原识别结构域。在抗原识别之后，受体聚簇并且信号被传递至细胞。在这方面，“t细胞信号传导结构域”是在抗原被结合之后将激活信号传递至t细胞的结构域，优选内结构域。最常使用的内结构域组分是cd3-ζ。由于car修饰的t细胞可以被改造以靶向几乎任何肿瘤抗原，因此用表达嵌合抗原受体的car改造t细胞进行过继细胞转移治疗是有前景的抗癌治疗。例如，可以将患者的t细胞遗传改造(遗传修饰)成表达特异性针对患者肿瘤细胞上的抗原的car，然后输注回患者中。根据本发明，car可以代替t细胞受体的功能，并且特别地，可以向例如t细胞的细胞赋予反应性，例如溶细胞活性。然而，与t细胞受体与抗原肽-mhc复合体的结合相比，car可以与抗原结合，特别是当在细胞表面上表达时。根据本发明，car通常可以包含三种结构域。第一结构域是识别并结合抗原的结合结构域。第二结构域是共刺激结构域。共刺激结构域用于在car与所靶向部分结合之后提高细胞毒性淋巴细胞的增殖和存活。共刺激结构域的身份仅限于其能够在所靶向部分被car结合之后提高细胞增殖和存活。合适的共刺激结构域包括cd28、cd137(4-1bb)、肿瘤坏死因子(tnf)受体家族的成员、cd134(ox40)、tnfr受体超家族的成员和cd278(icos)，其是在激活的t细胞上表达的cd28-超家族共刺激分子。技术人员将理解，可以使用这些提及的共刺激结构域的序列变体而对本发明无不利影响，其中所述变体与其模拟的结构域具有相同或类似的活性。这样的变体与其来源于的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，car构建体包含两个共刺激结构域。虽然一些具体组合包括四种提及的结构域的所有可能变化方案，但是一些具体实例包括cd28+cd137(4-1bb)和cd28+cd134(ox40)。第三结构域是激活信号传导结构域(或t细胞信号传导结构域)。激活信号传导结构域用于在car与抗原结合之后激活细胞毒性淋巴细胞。激活信号传导结构域的身份仅限于其能够在抗原被car结合之后诱导所选细胞毒性淋巴细胞的激活。合适的激活信号传导结构域包括t细胞cd3[ζ]链和fc受体[γ]。技术人员将理解，可以使用这些提及的激活信号传导结构域的序列变体而对本发明无不利影响，其中所述变体与其模拟的结构域具有相同或类似的活性。这样的变体与其来源于的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。car可以包含以融合蛋白的形式在一起的三种结构域。这样的融合蛋白通常包含在n端至c端方向上连接的结合结构域、一个或更多个共刺激结构域和激活信号传导结构域。然而，car不限于这种布置，并且其他布置是可接受的且包括结合结构域、激活信号传导结构域和一个或更多个共刺激结构域。将理解，由于结合结构域必须自由地结合抗原，因此结合结构域在融合蛋白中的放置将通常使得实现该区域展示在细胞的外部。以相同方式，由于共刺激结构域和激活信号传导结构域用于诱导细胞毒性淋巴细胞的活性和增殖，因此融合蛋白通常将这两个结构域展示在细胞的内部。car可以包含附加元件，例如信号肽，以确保融合蛋白向细胞表面的适当输出；跨膜结构域，以确保融合蛋白被保持为整合膜蛋白；和铰链结构域(或间隔区)，其赋予结合结构域以柔性并使得与抗原强结合。与本发明的car系统联合使用的细胞优选地是t细胞，特别是细胞毒性淋巴细胞，其优选地选自细胞毒性t细胞、自然杀伤(nk)细胞和淋巴因子激活的杀伤(lak)细胞。在激活之后，这些细胞毒性淋巴细胞各自触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性t细胞通过以下方式中的任一种或两种来触发靶细胞的破坏。第一，在激活之后，t细胞释放例如穿孔蛋白、颗粒酶和颗粒溶素的细胞毒素。穿孔蛋白和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，并且颗粒酶进入细胞且触发诱导细胞凋亡(程序性细胞死亡)的细胞质中的胱天蛋白酶级联反应。第二，可以通过t细胞与靶细胞之间的fas-fas配体相互作用来诱导凋亡。尽管可以使用异种细胞或同种细胞，但是细胞毒性淋巴细胞将优选地是自体细胞。多种方法可以用于将car构建体引入t细胞中，包括基于非病毒的dna转染、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的dna转染具有低插入诱变风险。与不包含整合元件的质粒相比，基于转座子的系统可以更高效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易生产，高效且永久转导t细胞，并且已在人初级t细胞中初步证明在整合方面是安全的。慢病毒载体也高效且永久地转导t细胞，但是制造更加昂贵。慢病毒载体相比于基于逆转录病毒的系统还可能更加安全。本文所述rna(例如，使用本文所述核酸分子作为转录模板所获得的)还可用于在体外或体内将体细胞重编程或去分化为干细胞样细胞，即具有干细胞特征的细胞。这可以涉及重编程因子的体外或体内瞬时表达以启动细胞中的重编程或去分化过程。因此，在一个实施方案中，由例如本文所述rna的核酸编码的肽或蛋白质是允许将体细胞重编程为具有干细胞特征的细胞的因子。干细胞样细胞可以在不产生胚胎或胎儿的情况下根据本发明提供。将体细胞去分化成具有干细胞特征(特别是多能性)的细胞可以如下实现：将编码诱导体细胞去分化之因子的rna引入体细胞中(也被称为重编程转录因子(reprogrammingtranscriptionfactor，rtf))，并培养体细胞使得细胞去分化。在去分化之后，可以诱导细胞再分化成相同或不同的体细胞类型，例如神经元细胞、造血细胞、肌细胞、上皮细胞和其他细胞类型。因此，这样的干细胞样细胞具有用于通过“细胞治疗”来治疗退行性疾病的医学应用，并且在以下的治疗中以新颖的治疗策略来利用：心脏病、神经病、内分泌疾病、血管疾病、视网膜病、皮肤病、肌肉-骨骼疾病和其他疾病。因此，本发明还涉及用于提供具有干细胞特征的细胞的方法，其包括以下步骤：(i)提供包含体细胞的细胞群，(ii)将能够表达使得将体细胞重编程为具有干细胞特征的细胞的一种或更多种因子的本发明rna引入体细胞中，以及(iii)使具有干细胞特征的细胞发育。在一个实施方案中，所述方法还包括向体细胞中引入增强体细胞重编程为具有干细胞特征的细胞的mirna。在一个实施方案中，一种或更多种因子包含oct4和sox2。一种或更多种因子还可以包含klf4和/或c-myc和/或nanog和/或lin28。在一个实施方案中，一种或更多种因子包含oct4、sox2、klf4和c-myc，并且还可以包含lin28和任选地nanog。在一个实施方案中，一种或更多种因子包含oct4、sox2、nanog和lin28。在一个实施方案中，所述方法还包括在至少一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂的存在下培养体细胞的步骤，其中所述至少一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂优选地包含丙戊酸、丁酸钠、曲古抑菌素a和/或scriptaid。在一个实施方案中，步骤(iii)包括在胚胎干细胞培养条件下培养体细胞。在一个实施方案中，干细胞特征包括胚胎干细胞形态。在一个实施方案中，具有干细胞特征的细胞具有正常的核型，表达端粒酶活性，表达胚胎干细胞特征性的细胞表面标志物，和/或表达胚胎干细胞特征性的基因。在一个实施方案中，具有干细胞特征的细胞表现出多能状态。在一个实施方案中，具有干细胞特征的细胞具有分化成所有三个原胚层的高级衍生物的发育潜能。在一个实施方案中，体细胞是成纤维细胞，例如肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞或真皮成纤维细胞。优选地，体细胞是人细胞。在一个实施方案中，通过电穿孔或脂质转染将rna引入体细胞中。在一个实施方案中，将rna重复引入体细胞中。在一个实施方案中，将能够表达如本文所公开的某些因子的rna引入体细胞中使得所述因子长时间表达，优选表达至少10天，优选至少11天并且更优选至少12天。为了实现这种长期表达，优选地将rna周期性地(即，重复地)引入细胞中多于一次，优选地使用电穿孔引入。优选地，优选在至少10天的时间内，优选至少11天内，并且更优选至少12天内，将rna引入细胞中至少2次，更优选至少3次，更优选至少4次，甚至更优选至少5次，优选多至6次，更优选多至7次或甚至多至8次、9次或10次，以确保一种或更多种因子长时间表达。优选地，在rna的重复引入之间经过的时间为24小时至120小时，优选48小时至96小时。在一个实施方案中，在rna的重复引入之间经过的时间不长于72小时，优选不长于48小时或36小时。在一个实施方案中，在下一次电穿孔之前，使细胞从之前的电穿孔恢复。在任何情况下，都应选择条件使得因子以支持重编程过程的量和时间在细胞中表达。“干细胞”是具有自我更新、保持未分化和变得分化的能力的细胞。干细胞可以无限制地分裂，至少在动物自然存在的生存期内无限制地分裂。干细胞不是终末分化的；其并不处于分化途径的最后阶段。当干细胞分裂时，每个子细胞可以保持干细胞或开始通向终末分化的过程。全能干细胞是具有全能分化特性并且能够发育成完整生物体的细胞。该特性由卵母细胞被精子受精后直至8细胞期的细胞所拥有。当将这些细胞分离并移植到子宫时，其可以发育成完整生物体。多能干细胞是能够发育成源自外胚层、中胚层和内胚层的不同细胞和组织的细胞。来源于位于在受精后4至5天产生的囊胚内的内细胞团的多能干细胞被称为“胚胎干细胞”，并且可以分化为不同的其他组织细胞，但不可以形成新的活生物体。专能干细胞(multipotentstemcell)是正常仅分化成对其来源组织和器官具有特异性的细胞类型的干细胞。专能干细胞不仅在胚胎、新生儿和成体期间参与不同组织和器官的生长和发育，而且还在组织受损之后参与维持成体组织稳态和诱导再生的功能。组织特异性专能细胞统称为“成体干细胞”。“胚胎干细胞”或“esc”是存在于胚胎中或从其中分离的干细胞。其可以是多能的，具有分化成存在于生物体中的各种和每一种细胞的能力；或者是专能的，具有分化成多于一种细胞类型的能力。如本文使用的，“胚胎”是指在其早期发育阶段的动物。这些阶段的特征在于：植入和原肠胚形成，其中限定和建立了三个胚层；以及胚层分化成各自的器官和器官系统。这三个胚层是内胚层、外胚层和中胚层。“囊胚”是在早期发育阶段的胚胎，其中受精卵已经受分裂，并且正在形成或者已经形成围绕填充有流体的腔的球形细胞层。该球形细胞层是滋养外胚层。在滋养外胚层内是被称为内细胞团(icm)的细胞簇。滋养外胚层是胎盘的前体，并且icm是胚胎的前体。成体干细胞(也被称为体干细胞)是见于成体的干细胞。成体干细胞见于分化的组织，可以自我更新，并且在一些限制的情况下可以分化以产生其来源组织的特化细胞类型。实例包括间充质干细胞、造血干细胞和神经干细胞。“分化细胞”是已经历逐步发育变化成为更特化的形式或功能的成熟细胞。细胞分化是细胞随着其成熟为明显特化的细胞类型经历的过程。分化细胞具有不同的特征，执行特定功能，并且与其较不分化的对应物相比更不可能分裂。“未分化”细胞如未成熟细胞、胚胎细胞或原始细胞通常具有非特异性外观，可执行多种非特异性活性，并且可能在分化细胞通常执行的功能中表现不佳(如果有的话)。“体细胞”是指任何分化细胞和全部分化细胞并且不包括干细胞、种质细胞或配子。优选地，如本文所使用的“体细胞”是指终末分化细胞。如本文使用的“定向”是指被认为对特定功能永久定向的细胞。定向细胞也被称为“终末分化细胞”。如本文使用的“分化”是指细胞适应特定的形式或功能。在细胞中，分化导致更加定向的细胞。如本文使用的“去分化”是指形式或功能的特化的损失。在细胞中，去分化导致较不定向的细胞。如本文使用的“重编程”是指重置细胞的基因程序。优选地，重编程的细胞表现出多能性。术语“去分化的”和“重编程的”或类似术语在本文中可互换使用，以指代具有干细胞特征的体细胞来源细胞。然而，所述术语不旨在通过机理或功能考虑来限制本文公开的主题。术语“诱导出现干细胞特征的rna”或“能够表达使得将体细胞重编程为具有干细胞特征的细胞的一种或更多种因子的rna”是指当被引入体细胞中时诱导细胞去分化的rna。如本文使用的“种质细胞(germcell)”是指生殖细胞(reproductivecell)，例如精母细胞或卵母细胞；或者是指将发育成生殖细胞的细胞。如本文使用的“多能的”是指可以产生除胎盘细胞或子宫的其他支持细胞之外的任何细胞类型的细胞。本文中使用术语如“具有干细胞特征的细胞”、“具有干细胞特性的细胞”或“干细胞样细胞”以指定这样的细胞，尽管其源自分化的非干细胞体细胞，但表现出干细胞(特别是胚胎干细胞)典型的一种或更多种特征。这样的特征包括胚胎干细胞形态，例如紧密的集落、高核质比和突出的核仁、正常的核型、端粒酶活性的表达、胚胎干细胞特征性的细胞表面标志物的表达和/或胚胎干细胞特征性的基因的表达。胚胎干细胞特征性的细胞表面标志物例如选自：阶段特异性胚胎抗原-3(stage-specificembryonicantigen-3，ssea-3)、ssea-4、肿瘤相关抗原-1-60(tumor-relatedantigen-1-60，tra-1-60)、tra-1-81和tra-2-49/6e。胚胎干细胞特征性的基因选自例如：内源性oct4、内源性nanog、生长分化因子3(growthanddifferentiationfactor3，gdf3)、表达降低基因1(reducedexpression1，rex1)、成纤维细胞生长因子4(fibroblastgrowthfactor4，fgf4)、胚胎细胞特异性基因1(embryoniccell-specificgene1，esg1)、发育多能性相关基因2(developmentalpluripotency-associated2，dppa2)、dppa4和端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase，tert)。在一个实施方案中，干细胞典型的一种或更多种特征包括多能性。在本发明的一个实施方案中，干细胞特征包括胚胎干细胞形态，其中所述胚胎干细胞形态优选地包括选自紧密的集落、高核质比和突出的核仁的形态标准。在某些实施方案中，具有干细胞特征的细胞具有正常的核型、表达端粒酶活性、表达胚胎干细胞特征性的细胞表面标志物和/或表达胚胎干细胞特征性的基因。胚胎干细胞特征性的细胞表面标志物可选自：阶段特异性胚胎抗原-3(ssea-3)、ssea-4、肿瘤相关抗原-1-60(tra-1-60)、tra-1-81和tra-2-49/6e；并且胚胎干细胞特征性的基因可选自：内源性oct4、内源性nanog、生长分化因子3(gdf3)、表达降低基因1(rex1)、成纤维细胞生长因子4(fgf4)、胚胎细胞特异性基因1(esg1)、发育多能性相关基因2(dppa2)、dppa4和端粒酶逆转录酶(tert)。优选地，具有干细胞特征的细胞是去分化和/或重编程的体细胞。优选地，具有干细胞特征的细胞表现出胚胎干细胞的基本特征，例如多能状态。优选地，具有干细胞特征的细胞具有分化成所有三种原胚层的高级衍生物的发育潜能。在一个实施方案中，原胚层是内胚层并且高级衍生物是肠样上皮组织。在另一个实施方案中，原胚层是中胚层并且高级衍生物是横纹肌和/或软骨。在另一个实施方案中，原胚层是外胚层并且高级衍生物是神经组织和/或表皮组织。在一个优选实施方案中，具有干细胞特征的细胞具有分化成神经元细胞和/或心肌细胞的发育潜能。在一个实施方案中，体细胞是具有间充质表型的胚胎干细胞来源体细胞。在一个优选实施方案中，体细胞是成纤维细胞，例如胎儿成纤维细胞或出生后成纤维细胞(postnatalfibroblast)或角质形成细胞，优选毛囊来源的角质形成细胞。在另一些实施方案中，成纤维细胞是肺成纤维细胞、包皮成纤维细胞或真皮成纤维细胞。在一些具体实施方案中，成纤维细胞是以目录号ccl-186保藏在美国模式培养物保藏中心(americantypeculturecollection，atcc)、以目录号crl-2097保藏在美国模式培养物保藏中心(atcc)或以目录号crl-2522保藏在美国模式培养物保藏中心(atcc)、或者以目录号pc501a-hff由systembiosciences分配的成纤维细胞。在一个实施方案中，成纤维细胞是成体人真皮成纤维细胞。优选地，体细胞是人细胞。根据本发明，体细胞可以是经遗传修饰的。根据本发明的术语“因子”当与其通过rna的表达联合使用时包括蛋白质和肽以及其衍生物和变体。例如，术语“因子”包括oct4、sox2、nanog、lin28、klf4和c-myc。所述因子可以是任何动物物种例如哺乳动物和啮齿动物的。哺乳动物的实例包括但不限于人和非人灵长类。灵长类包括但不限于人、黑猩猩、狒狒、食蟹猴以及任何其他新大陆猴或旧大陆猴。啮齿动物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠。根据本发明，能够使得将体细胞重编程为具有干细胞特征的细胞的一种或更多种因子包括选自以下的因子集合：(i)oct4和sox2，(ii)oct4、sox2以及nanog和lin28中的一种或两种，(iii)oct4、sox2以及klf4和c-myc的一种或两种。在一个实施方案中，能够由rna表达的所述一种或更多种因子包括oct4、sox2、nanog和lin28，或者oct4、sox2、klf4和c-myc。优选地，通过电穿孔或显微注射将rna引入所述体细胞中。优选地，本发明还包括使具有干细胞特征的细胞发育，例如通过在胚胎干细胞培养条件下、优选适于使多能干细胞保持在未分化状态的条件下培养体细胞。oct4是真核pou转录因子中的转录因子并且是胚胎干细胞多能性的指示物。oct4为母系表达的八聚体结合蛋白。已观察到oct4存在于卵母细胞、胚细胞的内细胞团中，并且还存在于原始种质细胞中。基因pou5f1编码oct4蛋白。该基因名称的同义词包括oct3、oct4、otf3和mgc22487。使胚胎干细胞保持未分化需要存在特定浓度的oct4。优选地，“oct4蛋白”或简单地“oct4”涉及人oct4。sox2是编码具有单个hmgdna结合结构域的转录因子的sox(sry相关hmg盒)基因家族的成员。已发现，sox2通过抑制神经祖细胞的分化能力来控制神经祖细胞。因子的阻遏导致从心室区分层，然后从细胞周期退出。这些细胞也开始通过祖细胞和早期神经元分化标志物的丧失而丧失其祖细胞特征。优选地，“sox2蛋白”或简单地“sox2”涉及人sox2。nanog是nk-2型同源结构域基因，并且已提出其可能通过调节胚胎干细胞更新和分化关键性基因的表达而在维持干细胞多能性中起关键作用。nanog用嵌入其c末端的两个异常强激活结构域表现为转录激活物。nanog表达的降低诱导胚胎干细胞的分化。优选地，“nanog蛋白”或简单地“nanog”涉及人nanog。lin28是保守的细胞质蛋白，其具有以下不常见的rna结合基序配对：冷激结构域和逆转录病毒型cchc锌指对。在哺乳动物中，其在多种类型的未分化细胞中是丰富的。在多能哺乳动物细胞中，在与多聚(a)-结合蛋白的rna酶敏感性复合体中和在蔗糖梯度的多聚核糖体级分中观察到lin28，表明其与翻译mrna相关。优选地，“lin28蛋白”或简单地“lin28”涉及人lin28。krueppel样因子(krueppel-likefactor，klf4)是锌指转录因子，其在不同组织(例如，结肠、胃和皮肤)的有丝分裂后上皮细胞中强烈表达。klf4对于这些细胞的终末分化是必不可少的并且参与细胞周期调控。优选地，“klf4蛋白”或简单地“klf4”涉及人klf4。myc(cmyc)是在广泛多种人癌症中过表达的原癌基因。当myc被特异性突变或过表达时，其增加细胞增殖并发挥癌基因的功能。myc基因编码转录因子，所述转录因子通过结合在增强子盒序列(e盒)上并募集组蛋白乙酰转移酶(hat)来调节所有基因中15％的表达。myc属于myc转录因子家族，所述家族还包括n-myc基因和l-myc基因。myc家族转录因子包含bhlh/lz(碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链)结构域。优选地，“cmyc蛋白”或简单地“cmyc”涉及人cmyc。本文中对例如oct4、sox2、nanog、lin28、klf4或c-myc的特定因子的引用应理解为还包括这些因子的所有变体。具体地，应理解为还包括由细胞天然表达的这些因子的所有剪接变体、翻译后修饰变体、构象体、异构体和物种同源物。术语“mirna”(微rna)涉及见于真核细胞中长度为21至23个核苷酸的非编码rna，其通过诱导靶mrna的降解和/或阻止靶mrna翻译来调节多种细胞功能，包括与esc自我更新/分化和细胞周期进展相关的那些功能。mirna是转录后调节子，其与靶信使rna转录物(mrna)上的互补序列结合，通常导致翻译阻遏或靶标降解和基因沉默。已经发现，正确组合中的mirna能够诱导体细胞直接体外细胞重编程为具有干细胞特征的细胞。例如，已经观察到mirna簇302-367增强体细胞重编程。优选地，使具有干细胞特征的细胞发育的步骤包括：在胚胎干细胞培养条件下，优选在适于将多能干细胞保持在未分化状态的条件下培养体细胞。优选地，为了使具有干细胞特征的细胞发育，在一种或更多种dna甲基转移酶抑制剂和/或一种或更多种组蛋白脱乙酰酶抑制剂的存在下培养细胞。优选化合物选自5’-氮杂胞苷(5’-azac)、辛二酰苯胺异羟肟酸(saha)、地塞米松、曲古抑菌素a(tsa)、丁酸钠(nabu)、scriptaid和丙戊酸(vpa)。优选地，在丙戊酸(vpa)的存在下培养细胞，丙戊酸的浓度优选为0.5mm至10mm、更优选1mm至5mm、最优选浓度为约2mm。本发明的方法可以用于实现任何类型体细胞的去分化。可以使用的细胞包括可以通过本发明方法去分化或重编程的细胞，特别是完全或部分分化的、更优选终末分化的细胞。优选地，体细胞是来源于胚胎前、胚胎、胎儿和出生后多细胞生物体的二倍体细胞。可以使用的细胞的实例包括但不限于成纤维细胞，例如胎儿和新生儿成纤维细胞或成体成纤维细胞；角质形成细胞，特别是初级角质形成细胞，更优选来源于毛发的角质形成细胞；脂肪细胞、上皮细胞、表皮细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、心肌细胞、食管细胞、肌细胞、黑素细胞、造血细胞、骨细胞、巨噬细胞、单核细胞和单个核细胞。可以使用本发明方法的细胞可以是任何动物物种、例如哺乳动物和啮齿动物的。可通过本发明去分化和再分化的哺乳动物细胞的实例包括但不限于人和非人灵长类细胞。可进行本发明的灵长类细胞包括但不限于人、黑猩猩、狒狒、食蟹猴以及任何其他新大陆或旧大陆猴的细胞。可进行本发明的啮齿动物细胞包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙鼠的细胞。预期根据本发明制备的去分化细胞显示出许多与多能干细胞相同的要求，并且可以在用于胚胎干细胞的条件下(例如，es细胞培养基或支持胚胎细胞生长的任何培养基)扩增和维持。当维持在培养物中的失活胎儿成纤维细胞(例如经辐射的小鼠胚胎成纤维细胞或人成纤维细胞(例如人包皮成纤维细胞、人皮肤成纤维细胞、人子宫内膜成纤维细胞、人输卵管成纤维细胞))上时，胚胎干细胞保持其体外多能性。在一个实施方案中，人饲养细胞可以是通过直接分化由重编程细胞的相同培养物获得的自体饲养细胞。此外，人胚胎干细胞可以在经小鼠胎儿成纤维细胞条件化培养基中的matrigel上成功地增殖。在特定培养条件下，人干细胞可以在培养物中长时间生长并且保持未分化。在某些实施方案中，细胞培养条件可以包括使细胞与以下因子接触，所述因子可以抑制细胞分化或以其他方式增强细胞去分化，例如阻止细胞分化成非es细胞、滋养外胚层或其他细胞类型。可以通过包括监测细胞表型变化并表征其基因和蛋白质表达的方法来评价根据本发明制备的去分化细胞。基因表达可以通过rt-pcr来确定，并且翻译产物可以通过免疫细胞化学和western印迹来确定。具体地，可以使用包括转录物组学的本领域公知技术来对去分化细胞进行表征以确定基因表达模式和重编程细胞是否显示出与未分化多能对照细胞如胚胎干细胞预期表达模式相似的基因表达模式。在这方面，可以评估去分化细胞中下列基因的表达：oct4、nanog、生长分化因子3(gdf3)、表达降低基因1(rex1)、成纤维细胞生长因子4(fgf4)、胚胎细胞特异性基因1(esg1)、发育多能性相关基因2(dppa2)、dppa4、端粒酶逆转录酶(tert)、胚胎抗原-3(ssea-3)、ssea-4、肿瘤相关抗原-1-60(tra-1-60)、tra-1-81和tra-2-49/6e。可以与重编程细胞进行比较的未分化细胞或胚胎干细胞可以与分化体细胞来自相同的物种。或者，可以与重编程细胞进行比较的未分化细胞或胚胎干细胞可以与分化体细胞来自不同的物种。在一些实施方案中，如果在未分化细胞中特异性表达的某些基因也在重编程细胞中表达，则重编程细胞与未分化细胞(例如胚胎干细胞)之间存在基因表达模式的相似性。例如，在分化体细胞中通常检测不到的某些基因(例如端粒酶)可用于监测重编程的程度。同样，对于某些基因，缺乏表达可用于评估重编程的程度。以诱导端粒酶活性为特征的自我更新能力是干细胞的另一个特征，其可以在去分化细胞中进行监测。核型分析可以通过以下来进行：来自有丝分裂细胞的染色体扩散、光谱核型分析、端粒长度测定、总基因组杂交或本领域公知的其他技术。使用本发明，例如通过电穿孔将编码合适因子的rna引入一个或更多个体细胞中。在引入之后，优选地使用支持去分化细胞维持的条件(即干细胞培养条件)培养细胞。然后，可以扩增去分化细胞并诱导其再分化成细胞治疗所需的不同类型的体细胞。可以诱导根据本发明获得的去分化细胞以体外或体内分化成一种或更多种期望的体细胞类型。优选地，根据本发明获得的去分化细胞可以产生来自三个胚胎胚层(即内胚层，中胚层和外胚层)中任一个的细胞。例如，去分化细胞可分化成骨骼肌、骨骼、皮肤真皮、结缔组织、泌尿生殖系统、心脏、血液(淋巴细胞)和脾(中胚层)；胃、结肠、肝、胰腺、膀胱；尿道衬里、气管上皮部分、肺、咽、甲状腺、甲状旁腺、肠(内胚层)；或中枢神经系统、视网膜和晶状体、颅和感觉、神经节和神经、色素细胞、头部结缔组织、表皮、毛发、乳腺(外胚层)。根据本发明获得的去分化细胞可以使用本领域已知的技术在体外或体内再分化。在本发明的一个实施方案中，由本发明方法获得的重编程细胞用于产生分化后代。因此，在一方面，本发明提供了用于产生分化细胞的方法，其包括：(i)使用本发明的方法获得重编程细胞；和(ii)诱导重编程细胞分化以产生分化细胞。步骤(ii)可以在体内或体外进行。此外，可以通过存在合适的分化因子来诱导分化，所述分化因子可以添加或原位存在，例如，在已经引入重编程细胞的身体、器官或组织中存在。分化细胞可以用于衍生有利地用于细胞、组织和/或器官移植领域的细胞、组织和/或器官。如果需要，可以在重编程之前将遗传修饰引入例如体细胞中。本发明的分化细胞优选不具有胚胎干细胞或胚胎种质细胞的多能性，并且实质上是组织特异性的部分或完全分化细胞。本发明方法的一个优点是可以在不进行预先选择或纯化或建立细胞系的情况下使通过本发明获得的重编程细胞分化。因此，在某些实施方案中，使包含重编程细胞的异质细胞群分化成期望的细胞类型。在一个实施方案中，使由本发明方法获得的细胞的混合物暴露于一种或更多种分化因子并在体外培养。通过本文公开方法获得的分化重编程细胞的方法可以包括重编程细胞的透化步骤。例如，可以在暴露于一种或更多种分化因子或者包含分化因子的细胞提取物或其他制备物之前，使由本文所述重编程技术产生的细胞或可替选地包含重编程细胞的异质细胞混合物透化。例如，可以如下获得分化细胞：在至少一种分化因子的存在下培养未分化的重编程细胞并从培养物中选择分化细胞。分化细胞的选择可基于表型，例如存在于分化细胞上的某些细胞标志物的表达；或通过功能测定(例如，执行特定分化细胞类型的一种或更多种功能的能力)进行。在另一个实施方案中，根据本发明重编程的细胞通过其dna序列的添加、缺失或修饰而进行遗传修饰。根据本发明制备的重编程或去分化细胞或者源自重编程或去分化细胞的细胞可用于研究和治疗。重编程多能细胞可分化成体内的任何细胞，包括但不限于皮肤细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、肾细胞、肝细胞、血细胞和血液形成细胞、血管前体细胞和血管内皮细胞、胰腺β细胞、神经元细胞、胶质细胞、视网膜细胞、神经元细胞、肠细胞、肺细胞和肝细胞。重编程细胞可用于再生/修复治疗，并且可移植到有此需要的患者中。在一个实施方案中，细胞对患者是自体的。根据本发明提供的重编程细胞可用于例如治疗心脏病、神经病、内分泌疾病、血管疾病、视网膜疾病、皮肤病、肌肉-骨骼疾病和其他疾病的治疗策略中。例如，并非旨在作为限制，本发明的重编程细胞可用于补充由于年龄或消融治疗(例如癌症放射治疗和化学治疗)天然细胞已经耗竭的动物中的细胞。在另一个非限制性实例中，本发明的重编程细胞可用于器官再生和组织修复。在本发明的一个实施方案中，重编程细胞可以用于重新激活受损的肌肉组织，所述肌肉组织包括营养不良肌肉和由于缺血事件如心肌梗死而损伤的肌肉。在本发明的另一个实施方案中，本文公开的重编程细胞可以用于改善动物(包括人)在创伤性损伤或外科手术后的瘢痕形成。在该实施方案中，本发明的重编程细胞被系统(例如静脉内)施用，并且迁移到由受损细胞分泌的循环细胞因子募集的新鲜受创组织的部位。在本发明的另一个实施方案中，重编程细胞可以被局部施用至需要修复或再生的治疗部位。在本发明的一个实施方案中，通过离体方法将核酸如rna施用于患者，所述离体方法即通过从患者中取出细胞，对所述细胞进行遗传修饰并将经修饰的细胞重新引入患者中。转染和转导方法是技术人员已知的。术语“转染”涉及将核酸特别是rna引入细胞中。出于本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞中或通过这样的细胞摄取核酸，其中所述细胞可以存在于对象(例如患者)中。因此，根据本发明，用于转染本文所述核酸的细胞可以存在于体外或体内，例如，细胞可以形成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果转染的遗传物质仅仅是瞬时表达的就足够了。由于在转染过程中引入的核酸通常不整合到核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂被稀释或被降解。允许核酸的附加体扩增的细胞大大降低了稀释率。如果希望转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定转染。可将rna转染入细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。根据本发明，可以使用任何可用于将核酸引入(即转移或转染)到细胞中的技术。优选地，通过标准技术将rna转染到细胞中。这样的技术包括电穿孔、脂质转染和显微注射。在本发明的一个特别优选的实施方案中，通过电穿孔将rna引入细胞中。电穿孔或电通透涉及由外部施加的电场引起的细胞质膜的电导性和通透性的显著提高。其作为将一些物质引入细胞中的方式通常用于分子生物学。根据本发明，优选地，将编码蛋白质或肽的核酸引入细胞中导致所述蛋白质或肽的表达。根据本发明，核酸可针对特定的细胞。在这样的实施方案中，用于向细胞施用核酸的载体(例如，逆转录病毒或脂质体)可以具有结合的靶向分子。例如，可以将以下分子引入核酸载体中或使其与核酸载体结合，所述分子例如对靶细胞上的表面膜蛋白具有特异性的抗体、或靶细胞上的受体的配体。如果希望通过脂质体施用核酸，则可以将结合与内吞相关的表面膜蛋白的蛋白质并入到脂质体制剂中以实现靶向和/或吸收。这样的蛋白质包括：对特定细胞类型具有特异性的衣壳蛋白或其片段、针对内化的蛋白质的抗体、靶向细胞内位点的蛋白质等。“报道子”涉及由报道基因编码并在报道子测定中进行测量的通常为肽或蛋白质的分子。常规系统通常使用酶报道子并测量所述报道子的活性。术语“多克隆位点”是指包含限制性酶位点的核酸区域，其中任一个都可用于切割例如载体和插入核酸。根据本发明，如果例如核苷酸或氨基酸的两个元件彼此直接相邻而没有任何中断，则其是连续的。例如，x个连续核苷酸n的序列是指序列(n)x。“限制性核酸内切酶”或“限制性酶”是指在特定碱基序列中切割dna分子的两条链中的磷酸二酯键的一类酶。其识别双链dna分子上的特定结合位点，被称为识别序列。dna中所述磷酸二酯键被所述酶切割的位点被称为切割位点。在iis型酶的情况下，切割位点位于距dna结合位点确定的距离处。根据本发明，术语“限制性核酸内切酶”包括例如以下酶：sapi、ecii、bpii、aari、aloi、baei、bbvci、ppii和psri、bsrd1、btsi、eari、bmri、bsai、bsmbi、faui、bbsi、bcivi、bfuai、bspmi、bseri、ecii、btgzi、bpuei、bsgi、mmei、cspci、baei、bsami、mva1269i、pcti、bse3di、bsemi、bst6i、eam1104i、ksp632i、bfii、bso31i、bsptni、eco31i、esp3i、bfui、acc36i、aari、eco57i、eco57mi、gsui、aloi、hin4i、ppii和psri。术语rna的“稳定性”涉及rna的“半衰期”。“半衰期”涉及消除一半的分子活性、量或数目所需的时间。在本发明的上下文中，rna的半衰期指示所述rna的稳定性。核酸如本文所述rna，特别是当用于本文所述治疗时，可以以药物组合物或药盒的形式存在，所述药物组合物或药盒包含核酸和任选地一种或更多种可药用载体、稀释剂和/或赋形剂。优选地，药物组合物是无菌的且包含有效量的核酸。药物组合物通常以均一剂型提供，并且可以以本领域已知的方式来制备。药物组合物可以是例如溶液或混悬剂的形式。药物组合物可以包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，优选地其全部是可药用的。术语“可药用的”是指不干扰药物组合物的活性组分的作用的物质的无毒性。不可药用的盐可以用于制备可药用盐并且包含在本发明中。这种可药用盐以非限制性方式包含由下列酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。可药用盐还可以制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。用于药物组合物的合适的缓冲物质包括在盐中的乙酸、在盐中的柠檬酸、在盐中的硼酸和在盐中的磷酸。用于药物组合物的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。术语“载体”是指具有天然或非天然(合成)性质的有机或无机组分，其与活性组分组合以促进、增强或实现应用。根据本发明，术语“载体”还包括一种或更多种适合施用于患者的相容性固体或液体填料、稀释剂或封装物质。用于肠胃外施用的可能载体物质是例如无菌水、葡萄糖溶液、林格溶液(ringer)、林格乳酸盐、无菌氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘，并且特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。术语“赋形剂”当在本文中使用时旨在表示可以存在于药物组合物中且不是活性成分的所有物质，例如如载体、黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。本文所述的药物组合物可通过任何常规途径施用，例如通过肠胃外施用，包括通过注射或输注。施用优选肠胃外进行，例如静脉内、动脉内、皮下、淋巴结内、皮内或肌内进行。适合用于肠胃外施用的组合物通常包含优选地与接受者的血液等张的活性化合物的无菌水性或非水性制剂。相容性载体和溶剂的实例为林格溶液和等张氯化钠溶液。此外，通常使用无菌的不挥发油作为溶液或混悬剂介质。本文所述的药剂和组合物优选以有效量施用。“有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情况下，期望反应优选地涉及病程的抑制。这包括减缓疾病的进程，并且特别是中断或逆转疾病的进程。疾病或病症的治疗中的期望反应也可以是所述疾病或所述病症的发作延迟或发作阻止。本文所述的药剂或组合物的有效量将取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状况、身高和体重)、治疗的持续时间、伴随治疗(如果存在的话)的类型、具体施用途径和类似因素。因此，本文所述药剂的施用剂量可以取决于这些参数中的若干个。在患者中反应因初始剂量而不足的情况下，可以使用更高的剂量(或者通过不同的更加局部的施用途径实现的有效更高剂量)。通过以下附图和实施例来详细描述本发明，所述附图和实施例应仅通过说明而不是通过限制来解释。基于说明和实施例，技术人员可以获得其他实施方案并且其同样在本发明的范围内。附图说明图1：体内选择过程的概括为了制备起始文库，在转录抑制剂放线菌素d存在下使人未成熟树突细胞生长5小时以预选择稳定的rna。使用poly(a)purist试剂盒(ambion)提取并纯化剩余的细胞mrna，然后用核酸酶p1(roche)进行片段化。为此，以24μl的总反应体积将10μgrna与在8μl50mmnaac缓冲液(ph5.5)中的0.3unp-1一起孵育45分钟。在用rneasy柱(qiagen)纯化后，将片段即时逆转录成cdna。使用并遵循revertaidpremium第一链cdna合成试剂盒(fermentas)的方案并使用具有确定引物序列和noti限制性位点的六聚体引物进行第一和第二链合成。为了填充5’-突出端并除去3’-突出端，接着将cdna与12.5ut4dna聚合酶一起在15℃下孵育5分钟。添加5μl0.5mmedta(ph8.0)来终止反应，并使用nucleobond柱(macherey-nagel)纯化cdna。用noti(neb)消化cdna文库产生具有平末端和黏性末端的片段。通过凝胶制备对片段进行另外尺寸选择以确保除去所有小于150bp的片段。对于克隆文库，将如图a所示的载体用ecorv和noti消化，分别留下平末端和黏性末端。在下一步中，使用t4dna连接酶(fermentas)使文库与载体连接。如表4所示，将连接混合物直接用作模板以使用phusiontm热启动高保真dna聚合酶(finnzymes)进行pcr。在纯化之后，如表5所示，使用pcr产物作为t7转录模板。在37℃下进行孵育。每30分钟后，向反应中添加0.75μl100mmgtp。2.5小时后通过添加turbodnase(2u/μl，ambion)并在37℃下再孵育15分钟来终止反应。最后通过rneasy柱(qiagen)清洗反应物。然后，rna文库可以用于选择操作，以将rna电穿孔到hidc中开始，如先前所述(kuhn等，2010)。在针对选择进行培养之后，使用rneasy柱(qiagen)并按照制造商的说明进行rna的提取和纯化。然后，使用rna作为模板以使用superscriptii逆转录酶(invitrogen)并遵循制造商的说明并使用dt18-引物进行cdna合成。如上所述，然后使用cdna作为pcr的模板。最后，pcr产物可以用作t7转录的模板(参见上文)以开始下一个选择循环(图b)。分别通过琼脂糖凝胶和agilent2100生物分析仪来进行dna/cdna和rna样品的质量控制。图2：luc2cpmut载体中的样品外观的示意图(a)按给出的方式将单个或两个(上游和下游)元件作为3’-utr克隆到载体中。还示出了对照样品neg(阴性对照，不插入3’utr)、hbg和2hbg。制备rna进行数个选择循环。(b)对于电穿孔到hidc中，使用载体作为模板，以使用包含t7启动子和多聚(a)尾的延长引物来进行pcr。然后，使用pcr产物作为t7-体外合成的模板以产生各自的ivt-rna。图3：所选择序列对编码luc2cpmut的rna的稳定性的作用结果示出了在电穿孔到人未成熟树突细胞中之后与我们的黄金标准2hbg相比包含所选择序列作为3’utr的rna的萤光素酶活性、半衰期和随时间的总蛋白质(neg如图2中所定义)。上图给出了具有指定3’utr的三种示例性rna的时间过程。在左下图中，示出了相对于具有2hbg的rna具有相应指定3’utr的rna的半衰期。类似地，在右下图中给出了与具有2hbg的rna相比的相对总蛋白质表达。图4：使用作为报道基因的luc2mut和新选择的3’-utr的代表性萤光素酶活性在将具有指定3’utr的rna电穿孔到人未成熟树突细胞中之后，在72小时内测量萤光素酶活性。图5：将ivt-rna电穿孔到成纤维细胞中的代表性结果左图：基于luc2cpmut的载体。右图：基于luc2mut的载体。图6：将ivt-rna电穿孔到t细胞中的代表性结果最左侧的图给出了与具有2hbg的rna相比具有fi3’utr的rna在cd4+和cd8+t细胞中的相对总蛋白质表达。类似地，在中间和最右侧的图中分别给出了与具有2hbg的rna相比具有fi3’utr的rna在cd4+和cd8+t细胞中的相对翻译效率和mrna半衰期。图7：具有经修饰核苷酸的测试rna的rna结构和完整性a：按照此处所述构建萤光素酶测定中使用的rna。作为5’帽，使用β-s-arca(d2)。作为5’utr，使用人α珠蛋白5’utr，包括kozak序列。在萤火虫萤光素酶基因之后，克隆了两种待比较的3’utr。作为多聚a尾，使用a30l70序列。b：在转染之前，在2100生物分析仪(agilent)上检查rna的完整性。所有rna都具有足够高且还可比的完整性，并且因此可以用于实验中。图8：fi3’utr对体内rna稳定性和功能性的作用用f12配制包含fi3’utr或2hbg3’utr的萤光素酶和gp70mrna并静脉内施用到balb/c小鼠中。在施用萤光素酶mrna之后，在6小时和24小时后监测表达；在第0天和第6天施用gp70mrna，并在第10天通过cd8和gp70tet+染色来分析免疫激活。a)示出了在注射包含fi3’utr或2hbg3’utr的未经修饰和经m1y修饰mrna后6小时和24小时时的萤光素酶表达水平。包含fi3’utr的未经修饰和经m1y修饰萤光素酶mrna均显示出与包含2hbg3’utr的对应mrna相当的表达水平。b)示出了响应于包含fi3’utr或2hbg3’utr的gp70mrna的gp70特异性cd8t细胞的百分比。这两种3’utr在两次免疫接种之后在诱导抗原特异性免疫方面表现同样良好，其中已接受包含fi3’utr的gp70mrna的那些小鼠的脾中的抗原特异性cd8t细胞显著增加。统计学：单因素anova和tukey事后检验，*p＜0.05。图9：稳定utr对自我复制rna的稳定性的作用将去稳定的萤光素酶(luc2cp)克隆到紧接非细胞毒性塞姆利基森林病毒来源自我复制(复制子)rna的3’保守序列元件的上游。通过体外转录由对应的线性化质粒制备复制子rna并将其电穿孔到细胞中。通过添加发光底物来测量萤光素酶表达96小时至120小时。(a)bhk21细胞的代表性实验中萤光素酶表达的时间过程。(b)在人包皮成纤维细胞(hff)的代表性实验中萤光素酶表达的时间过程。为了降低释放的i型干扰素的细胞毒性，在每个样品中共转染痘苗病毒b18rmrna。为了抑制蛋白激酶r激活并提高整体翻译水平，在每个样品中共转染痘苗病毒e3mrna。图10：fi元件中的同源性段下划线的序列段被预测彼此碱基配对。对于“8nt突变”构建体，第一个元件突变为aaagggcu以破坏与第二个元件的相互作用。图11：使用2hbgutr的基于pcr模板的ivt中的人工产物(artefact)a：通过pcr产生ivt模板的示意图。使5’引物退火在t7启动子上游，3’引物包含120nt多聚a尾并且与质粒编码的多聚a和3’utr之一部分退火。在2hbgutr的情况下，可以发生与第一重复退火的错误引发。b：来自包含2hbgutr的质粒的pcr产物。红色箭头表示副产物，表示1hbg截短。c：由这样的pcr产物转录的rna因此也呈现截短的副产物(箭头)。d：来自包含fi元件作为3’utr的质粒的pcr产物。未见副产物。e：所得mrna具有预期的高完整性，而没有任何另外的副峰。图12：截短utr元件的示意图和对应mrna构建体的半衰期图a的上图示出了参考那些截短变体所覆盖的f元件seqidno：86之全长序列的核酸位置的截短utr元件的示意图。图a的下图示出了参考包含f元件seqidno：86之全长序列的mrna的包含截短utr的mrna的相对半衰期。将编码萤光素酶报道子的mrna电穿孔到hidc中，并通过萤光素酶测量来随时间追踪其表达以确定相对rna半衰期。图b的上图示出了参考那些截短变体所覆盖的i元件seqidno：115之全长序列的核酸位置的截短utr元件的示意图。图b的下图示出了参考包含i元件seqidno：115之全长序列的mrna的包含截短utr的mrna的相对半衰期。将编码萤光素酶报道子的mrna电穿孔到hidc中，并通过萤光素酶测量来随时间追踪其表达以确定相对rna半衰期。图13：相对于随机utr包含f、i或fi元件的mrna构建体的相对半衰期和蛋白质表达图13示出了相对于随机utr包含f、i或fi元件的mrna构建体的相对半衰期和蛋白质表达。为此，相对于随机3’utr(257nt长)比较了全长单独f和i元件以及fi组合。将所有元件克隆到萤光素酶编码构建体中，体外转录成mrna，电穿孔到hidc中，随时间测量萤光素酶表达，并计算相对半衰期和总蛋白质表达。图14：用于细胞重编程的utr元件图14a示出了初级人包皮成纤维细胞的重编程的时间轴。将40,000个细胞平板接种到12孔板中并用mrna混合物脂质转染连续三天(3x)或连续四天(4x)，所述mrna混合物由0.33μg未经修饰的体外转录(ivt)-rna与b18r、e3和k3各0.08μg以及0.17μgmirna混合物(由mirna302a-d和367构成)构成(1∶1∶1∶1∶1∶1)，所述(ivt)-rna编码重编程tfoct4、sox2、klf4、cmyc、nanog和lin28(oskmnl)(1∶1∶1∶1∶1∶1)。因此，rna构建体仅在其3’utr中不同，所述3’utr由人β-珠蛋白3’utr的串联重复(2hbg)、f-i-元件(fi)或i-f-元件(if)组成。从第9天起，观察集落形成，并在第11天进行集落分析。图14b示出了建立的集落的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ap)染色，图14c示出了代表ap阳性集落的计数的对应条形图。图14d示出了使用包含fi-utr的rna所得的ips细胞集落的形态。其类似于hes细胞，其在不同集落中具有紧密排列的小细胞，并且具有明确确定的边界。图14e示出了在4倍和10倍放大倍数下对ap染色阳性的如d中制备的集落。图14f示出了在对hes细胞表面标志物tra-1-60进行活细胞染色中如d中制备的集落。图14g示出了通过粒化集落，分离总rna并通过qrt-pcr量化评价的hes标志物oct4(内源性)、nanog(内源性)、lin28(内源性)、tert和rex1的mrna表达。实施例实施例1：使mrna稳定的序列元件的鉴定为了鉴定使mrna稳定的新序列元件，我们开发了使用hidc作为体外转录rna的选择环境的体内选择过程。使用来源于hidc的天然存在mrna序列构建起始rna文库。在rna分离之前，使细胞在转录抑制剂放线菌素d(actd)存在下生长5小时以预选择稳定的rna。然后，提取剩余的mrna并将其缩短至200至800个核苷酸的片段，进行逆转录，并作为3’-utr克隆在携带hag5’utr序列和报道基因的载体中，其被选作选择过程的基础。用于后续文库mrna转录的dna模板通过pcr进行扩增，在此期间通过5’引物引入t7启动子，并通过3’引物引入a60多聚a尾。然后，将转录的mrna引入体内选择过程，该过程包括数个以下循环：对文库进行体外转录，将对应rna电穿孔到hidc中，并在确定的时间点之后提取和扩增稳定序列。在cdna合成后，用特定引物通过pcr进行所选择序列的扩增。随后，将所得pcr产物用作新mrna文库的模板。这进行6个循环，其中如下提取剩余的rna：在第1个循环中在24小时后、在第2和第3个循环中在48小时后、在第4和第5个循环中在72小时后，并且最后在第6个循环中在96小时以及1周和2周后(在电穿孔之后，将细胞分成三份，然后在给定的时间点单独收获)。监测第1至5个循环后的选择过程表明对应rna库的平均半衰期显著增加，这指示稳定3’-utr元件的富集(表1)。尽管如此，随着循环数更高，稳定性的提高较不明显。因此，在最后第6个循环之后停止选择过程，其中在96小时、一周和两周之后从细胞中提取rna。为了表征所选择的序列，对超过350个单独克隆进行测序：来自第5个循环的108个、来自第6个循环/96小时的88个、来自第6个循环/1周的110个和来自从第6个循环/2周的96个。将所有序列彼此以及与blasted进行比较以鉴定其基因组来源。在此，特别关注序列是来源于内源5’-或3’-utr还是来自编码区。最后，从nextbio(illumina)下载其在hidc中的表达水平。总共，可以鉴定出七个组，其(i)发现多个序列，(ii)来源于内源rna的3’-utr或者来源于内源非编码rna并且(iii)在hidc中明显表达(表2)。这些来源于以下基因：igg-fc片段受体转运蛋白α(b，fcgrt，nm_001136019)、淋巴细胞特异性蛋白1(d，lsp1，nm_002339)、趋化因子配体22(e，ccl22，nm_002990)、氨基末端分裂增强子(f，aes，nm_198969)、磷脂酶d家族成员3(g，pld3，nm_001031696)、线粒体编码的12srna(i，mt_rnr1，nc_012920)、ii类主要组织相容性复合体drβ4(j，hla-drb4，nm_021983)。注意，为简单起见，在下文中使用括号中给出的大写字母b到i作为这些元件的缩写。重要的是，在所有情况下，一种序列的克隆在其准确的5’和3’端不同，表明这些来自不同的起始克隆，并且在该过程期间不是简单地人工富集(对于筛选中所鉴定的所有序列的完整列表，请参见附录)。实施例2：鉴定的各个序列元件的表征为了表征所鉴定的序列元件，选择每个组的代表性候选物(详细序列在附录中标记)。然后，将该序列作为3’-utr克隆在具有萤光素酶报道基因的载体中，所述报道基因的表达水平可以在转移到细胞中后随时间分析。先前已表明，从针对蛋白质观察到的表达模式，可以准确推断rna的相对稳定性和翻译效率(kuhn2010genether.)。本实验中使用的具体报道子luc2cpmut是萤光素酶的去稳定形式(promega)。这允许检测rna稳定性的甚至很小变化。然后，将来自这些载体的体外转录rna与我们的黄金标准mrna(即包含2hbg3’-utr)关于rna稳定性和翻译效率进行比较。作为对照样品，使用无3’-utr(即仅包含用于克隆插入片段的序列)的体外转录rna和仅包含单个β-珠蛋白元件(1hb)的体外转录rna。从包含utr的载体开始，使用包含t7启动子的5’引物和具有60个核苷酸的多聚(a)尾的3’引物通过pcr扩增待转录区域。使用agencourtampurexp(beckmancoulter)进行pcr片段的清洗。向每个pcr反应中添加0.6体积的珠并混合。在rtpcr下孵育15分钟之后，通过磁力架使与珠结合的pcr产物与过量的引物、核苷酸、盐和酶分离。将珠用80％乙醇洗涤两次，每次30秒，以进一步去除污染物。将期望的pcr产物最终用30μlddh2o洗脱两次，并用作对应rna的体外转录的模板。对于体外转录，使用t7rna聚合酶(fermentas)、相应的反应缓冲液和6mmntp。为了有效加帽rna，将gtp浓度降低至1.5mm，向反应中添加6mmβ-s-arca(d2)并在37℃下孵育2.5小时。通过羧化磁珠(invitrogen)来纯化rna，并通过分光光度法和在2100生物分析仪(agilent)上分析来评估rna浓度和质量。与其在筛选方法中的鉴定一致，关于rna稳定性，所有新序列与2hbg相比都显示出非常类似的特征，其中i组(mtrnr1)是最好的(图3；表3)。重要的是，与没有3’-utr的rna相比并且甚至与只有一个β-珠蛋白元件拷贝的rna相比，每种单独的元件都赋予rna稳定。正如通过rna稳定性和随时间表达的总蛋白质之间的直接关系所观察到的，未显著影响翻译效率。实施例3：单独序列元件的组合在另一项实验中，将每组的单个序列以成对方式彼此组合(图2)。这背后的基本原理是我们先前的以下观察，即两个3’-utr的组合对rna的稳定性和翻译效率具有附加作用(holtkamp等，2006)。通过用样条内插测量的萤光素酶值来在r中计算rna的稳定性和翻译效率，由此将最陡的上升斜率定义为翻译效率并将信号的半衰期定义为稳定性。插入样条的积分被解释为总蛋白质表达。总共克隆了64种组合，即7种新鉴定的序列和人β珠蛋白3’-utr的全部可能组合(表6)。如上所述，由这些模板dna制备rna，然后电穿孔到hidc中。作为对照，还包括包含单独元件的rna。对于7种新元件中的大多数，观察到，与具有仅一个元件相比，与另一元件的至少一种组合提供具有更高稳定性的rna(表7至表13)。令人感兴趣的是，在大多数情况下，与i元件(mtrnr1)的组合增加rna的半衰期。在此，与具有2hbg3’-utr的rna相比，rna的稳定性通常甚至更高(表7至表13)。几乎所有的组合对rna的翻译效率都具有有利作用。总的来说，对rna稳定性和翻译效率的组合作用使得总蛋白质表达提高至多至1.74倍。因此，我们可以鉴定产生稳定性和/或翻译效率提高的rna的单个元件(长度小于233个核苷酸)以及两个不同元件的组合，但是同时避免了如上对于2hbg所述的具有一种元件的两个相同拷贝的问题。为了验证用去稳定萤光素酶形式获得的结果，用携带标准萤光素酶(promega)和以下所选择3’-utr的rna重复之前的实验：mtrnr1(i)、mtrnr1-aes(if)、aes-mtrnr1(fi)、mtrnr1-hbg(ihbg)和hbg-mtrnr1(ihbg)。如图4和表14所示，可以获得与以上观察到的等同的结果，验证了新元件单独地或以组合与2hbg元件类似地提高mrna稳定性和/或翻译效率。实施例4：在其他细胞类型中对携带所选择序列元件的mrna的分析还在不同的细胞类型和细胞系中测试了新选择的3’-utrmtrnr1和aes，以观察是否存在hidc特异性。在人成纤维细胞(hff)、鼠成肌细胞(c2c12)(图5)和t细胞(图6)中测试序列以评估其在这些细胞中是否也稳定。收获hff和c2c12细胞并准备用于电穿孔。然后，将2.0μgivt-rna与包含指定3’utr的1.0μggfp编码rna一起电穿孔。在电穿孔之后，将细胞分开。一式三份地将每孔5000个细胞分配到96孔板中，持续总共7个时间点(2小时、4小时、8小时、24小时、48小时和72小时)以测量萤光素酶活性。将每孔2e+05个细胞平板接种到6孔板中以在24小时后收获用于facs(gfp-信号)。这允许监测转染效率。这些在72％至90％之间不同，并且可以包括在半衰期的计算中。用hff和c2c12以及t细胞获得的结果证实先前用hidc获得的结果。i与f的组合与2hbg相比在半衰期方面特别地是其2倍至3倍好。此外，与我们的黄金标准相比，fi在c2c12细胞中显示出3倍好的翻译效率和2倍好的随时间蛋白质产生。这些结果表明，i和f不是hidc特异性的，而且还增强其他细胞中的mrna稳定性和翻译效率。实施例5：fi3’utr提高经修饰mrna的表达对于包括蛋白质替代治疗在内的一些应用，具有经修饰核苷酸的mrna由于其降低的免疫原性而优于未经修饰的mrna(kariko等，2008)。然而，碱基修饰通过直接影响与对应rna结合蛋白的相互作用或通过改变rna的二级结构形成而可能影响mrna的稳定性。因此，所选3’utr在经修饰mrna的情况下可能表现不同。因此，我们在hidc、hff、cd8+和cd4+t细胞以及在鼠mef、c2c12和bmdc中在经m1y修饰mrna的背景下比较了f和i的组合与2hbgutr。作为报道子，使用了萤光素酶(对于构建体设计，参见图7a)。为了产生经修饰的mrna，在ivt反应中u完全被m1y替代。在所有实验中，包括未经修饰的rna作为对照。获得的mrna的完整性不受m1ytp交换utp影响(图7b)。使用表15中所述的设置对细胞进行电穿孔，并在3小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时和96小时时测量萤光素酶水平。未经修饰萤光素酶mrna的电穿孔可以重现之前观察到的效果：在所有细胞类型中，fi元件在传递rna稳定性方面等同于或优于2hbg对照(表16a)。然而，在鼠dc和人t细胞中，在两种3’utr之间，mrna半衰期相当，在hff细胞中fi元件使mrna半衰期增加至多至1.69倍。在所有细胞系中总蛋白量都增加，在hff细胞中最为显著(2.45倍)。对于经修饰mrna，在hidc中，与2hbg相比fi元件也使得mrna半衰期增加，总蛋白量增加至超过两倍(表16b)。其他细胞类型中的结果也类似于用未经修饰mrna获得的结果：在涉及hff、mef和c2c12细胞的所有实验中，fi元件都优于2hbg，并且在t细胞和鼠dc中相当(表16b)。因此，u修饰不改变fi元件使mrna稳定的能力。实施例6：fi3’utr提高mrna的表达而与转染方法无关目前为止，所有的实验都是用电穿孔作为转染方法完成的。使用电穿孔，在通过脂质转染进行转染后获得的内体摄取途径的规避下，递送的mrna直接到达细胞质中。为了观察fi元件在这些条件下是否也起作用，使用rnaimax作为转染试剂，使用与先前实验中所使用相同的包含fi和2hbg的荧光素酶mrna对细胞进行脂质转染。尽管与通过电穿孔递送rna的实验相比提高较不明显，但是在脂质转染后fi元件也提高萤光素酶表达(表16c)。因此，转染方法不影响fi元件的稳定效果。实施例7：包含fi3’utr和2hbgutr的mrna实现相当的体内蛋白质表达和免疫激活为了评估包含fi3’utr的mrna的体内蛋白质表达，用f12配制与先前实验中所使用相同的包含fi和2hbg的萤光素酶mrna并静脉内施用到balb/c小鼠中。如图8所示，对于两种3’utr，萤光素酶表达相当。抗原特异性免疫应答也被诱导至相当的程度，其中包含fi3’utr的mrna在脾中的效果略强。实施例8：ifutr使得提高自我复制rna的体外稳定性体外转录的来源于甲病毒基因组的自我复制rna(复制子rna)是有效的疫苗载体。复制子rna在前三分之二编码复制子rna的细胞质复制所需的酶复合体(复制酶)。该复制酶识别内部rna结构，所述内部rna结构充当用于亚基因组rna的复制酶依赖性合成的亚基因组启动子。用于疫苗接种的转基因或抗原在比整个复制子显著更短的该亚基因组rna上编码。总之，基因组rna(即全长复制子rna)和亚基因组rna二者均类似于细胞mrna。二者都以utr为侧翼，二者都被加帽且多聚腺苷酸化。负责加帽和多聚腺苷酸化的酶包含在复制酶复合体中。utr内的保守序列元件(cse)-在5’cse的情况下与复制酶的orf重叠-是复制酶结合所需要的并且充当负链合成(3’cse)或正链合成(5’cse)的启动子。为了评估对非复制型体外转录mrna鉴定和验证的新稳定utr是否提供复制子rna的更大稳定性并且从而提供更高转基因表达，我们将相应序列克隆到复制子rna模板载体中。由于3’cse需要紧邻多聚-a尾定位，所以我们将新utr插入到紧接编码去稳定萤光素酶(luc2cp)的复制子的3’cse上游。通过与ivtmrna类似的线性化模板质粒的体外转录合成复制子rna。通过电穿孔将复制子rna引入细胞(bhk21和hff)中，并评估萤光素酶表达。如图9所示，所有插入的utr在所使用的两种细胞系中都提高luc2cp的翻译。令人感兴趣的是，“if”utr组合使得翻译显著提高。实施例9：同源性高至90％的核苷酸交换不影响fi元件的稳定特性由于应用于鉴定新稳定utr元件的选择操作，获得了在一定大小范围内的序列。具有延长5’和3’端的相同序列的鉴定给出了所需最小长度的第一个指示。然而，每种元件发挥其稳定效果所需的最小区域可能甚至更短。此外，序列的微小变化可能仍然是功能性的，即任何单独核苷酸的身份对于fi元件的稳定特性可能不是最重要的。为了观察元件针对核苷酸交换的稳健性的程度，针对在hidc中的总蛋白质表达和mrna半衰期测试了与原始fi元件具有97.5％、95.0％、92.5％和90.0％同源性的3’utr序列。在整个序列长度上随机选择被改变的核苷酸(序列208至211，随机修饰)。将具有这些经修饰元件作为3’utr的萤光素酶mrna进行体外转录，电穿孔到hidc中，并在3小时、6小时、24小时、48小时和72小时之后通过萤光素酶测量来随时间追踪其表达。具有经修饰fi元件的萤光素酶mrna产生相同的总蛋白量并且具有大致相同的半衰期(表17)。除如上所述的具有递增程度的随机替换之外，通过合理引入可能破坏fi元件的二级结构的核苷酸替换来产生另一组经修饰fi元件。对于多种天然3’utr序列，已知其二级结构是重要的，因为二级结构提供了影响mrna稳定性的调节蛋白的结合位点(addess等，1997；putland等，2002；crucs等，2000；adams等，2003)。彼此完全互补的两个8nt序列存在于fi元件中，一个在f元件中，另一个在i元件中(图10)。这两个区域的碱基配对也可以见于大多数的mfold预测中。mfold(zuker，2003)是允许输入序列的二级结构预测的计算机程序。为了检测该特定二级结构元件的重要性，以消除碱基配对的方式改变序列(序列212，8nt突变)。除该相当长的互补序列之外，还针对存在于大多数输出折叠中因此应具有高体内形成概率的结构元件筛选对fi3’utr的mfold预测。参与这些折叠的碱基配对的核苷酸通过将其与其碱基配对配偶体交换来改变为与原始fi序列具有97.5％、95.0％、92.5％和90.0％同源性，由此保持序列的二级结构(序列217至220，结构保持修饰)。此外，仅在双链部分的一条链上交换相同的序列，由此故意破坏二级结构。在这些情况下，与原始序列的同一性分别为98.75％、97.50％、96.25％和95.00％(序列213至216，结构去稳定化修饰)。将具有所述经修饰3’utr元件的萤光素酶rna体外转录，电穿孔到hidc中，并在3小时、6小时、24小时、48小时和72小时之后通过萤光素酶测量来随时间追踪其表达。在任何修饰策略的情况下，都未观察到对mrna半衰期的任何显著影响。因此，fi元件的稳定特性显示针对其核苷酸序列或二级结构的变化至少高至10.0％变化核苷酸是稳健的。此外，在修饰fi序列后，未观察到总蛋白量的下降(表18a和18b)。实施例10：使用fi元件代替2hbg避免了rna编码区基于pcr的扩增中的错误引发如已经显示的，关于mrna稳定性和翻译效率，fi元件等同于或优于2hbg3’utr。fi元件的另一个优点是其非重复序列，而hbg3’utr的两个拷贝在一些情况下可以引起问题。这在通过pcr扩增用于rna转录的dna模板时最为明显。在这些情况下，用3’引物寡聚物添加全长多聚a-尾，所述3’引物寡聚物正好结合在3’utr的3’端(图11a)。在2hbgutr的情况下，在pcr期间出现截短的副产物，其在测序后被证实由在utr中仅具有1hbg重复的mrna组成(图11b)。在转录之后，截短也见于mrna中(图11c)。这种现象发生在大多数具有包含2hbgutr元件的构建体的pcr反应中，并且通过包括以下的优化工作不能完全消除：引物退火温度、缓冲液组成、引物序列或替代聚合酶。即使在3’utr与多聚a尾之间插入独特的接头序列之后，问题仍然存在。重要的是，副峰的强度与pcr反应产量相关，表明随着每个pcr循环增加的短截短pcr片段的错误引发为问题的可能原因。因此，对于编码具有2hbg3’-utr的rna的dna模板，不能确定令人满意的条件。相比之下，具有fi元件的dna模板的pcr不产生任何截短的副产物(图11d)，并且此外所得到的mrna在生物分析仪谱中没有显示另外的峰(图11e)。因此，就pcr模板完整性和对应rna质量而言，与2hbgutr相比，fi元件作为3’utr视为相当大的改进。实施例11：f和i元件的子片段的rna稳定特性由于应用于鉴定新稳定utr元件的选择操作，获得了在一定大小范围内的序列。具有延长5’和3’端的相同序列的鉴定给出了所需最小长度的第一个指示。然而，每种元件发挥其稳定效果所需的最小区域可能甚至更短。为此，对于f元件和i元件二者，设计了5种萤光素酶报道子构建体，其各自包含覆盖在5’和/或3’端缩短的原始元件的不同片段的缩短utr(分别参见图12的上图a和b)。将这些报道子构建体体外转录，电穿孔到hidc中，并在电穿孔后3小时、6小时、24小时、48小时和72小时通过萤光素酶测量来随时间追踪其表达。在将包含相应全长的rna设为1的情况下针对相对rna半衰期分析所得表达曲线(分别参见图12的下图a和b)。对于f元件，对于任何测试的子序列，都没有观察到mrna半衰期显著降低，表明沿着f元件的不同子序列在其稳定作用中的冗余非协同性参与。对于i元件可以获得类似的结果，但是当仅使用中心区域(nt37-107)作为3’utr时，可以观察到性能略微下降。为了正确看待这些结果，将全长的单独f和i元件以及fi组合与来自起始文库的随机选择3’utr(257nt长度)进行比较。这通过克隆起始dna库并选择单个随机克隆来获得。如上所述，将具有相应utr序列的萤光素酶编码rna电穿孔到hidc中，随时间测量萤光素酶表达，并计算相对半衰期和总蛋白质表达。与f、i和fi元件相比，具有随机选择的3’utr的rna显著较不不稳定(图13，上图)。所选utr对总蛋白质表达的作用甚至更为显著(图13，下图)。这清楚地表明，如上所述的f元件和i元件的片段的作用对于所选择序列是特异性的，而不是简单地由3’utr序列的存在引起。这与在选择期间观察到的库的rna稳定性提高一致(参见上文)。实施例12：稳定utr元件用于干细胞重编程的用途将40,000个细胞平板接种到12孔板中并用mrna混合物脂质转染连续三天(3x)或连续四天(4x)，所述mrna混合物由0.33μg未经修饰的体外转录(ivt)-rna与b18r、e3和k3各0.08μg(ekb)以及0.17μgmirna混合物(由mirna302a-d和367构成)构成(1∶1∶1∶1∶1∶1)，所述(ivt)-rna编码重编程tfoct4、sox2、klf4、cmyc、nanog和lin28(oskmnl)(1∶1∶1∶1∶1∶1)。因此，rna构建体仅在其3’utr不同，所述3’utr由人β-珠蛋白3’utr的串联重复(2hbg)、f-i-元件(fi)或i-f-元件(if)组成。在人胚胎干(hes)细胞培养基中培养细胞，并使用rnaimax根据制造商的说明进行脂质转染。从第9天起，观察集落形成，并在第11天进行集落分析(关于时间轴概括，参见图14a)。在第11天使用ap染色试剂盒对建立的集落染色碱性磷酸酶(ap)。对于概况，图14b中示出了代表性染色。显而易见的是，fi元件的并入产生更大量的ap阳性集落(暗色)。对针对ap染色的集落进行计数并且确定来自概况的结果：与先前使用的2hbg-utr相比，当细胞被脂质转染3次时，用fi-utr替代产生3至4倍过量的集落。用if-utr替代产生2倍过量。对于四次转染，这些效果较不显著。对于if-utr在此没有观察到改善。一方面，该过程显示对四次转染饱和，而另一方面由于集落过度生长，集落的计数在此在一定程度上有偏差(参见图14c)。使用包含fi-utr的rna得到的ips细胞集落的集落形态类似于hes细胞，其在不同集落中具有紧密排列的小细胞并且具有明确确定的边界(图14d)。这些集落可以对ap(图14e)和hes细胞表面标志物tra-1-60(图14f)呈染色阳性。根据制造商的说明，用stain-alivetra-1-60抗体(stemgent)进行tra-1-60活细胞染色。示出了集落的代表性照片。为了进一步评估集落的多能性，将细胞粒化，分离总rna，并通过qrt-pcr量化hes标志物oct4(内源性)、nanog(内源性)、lin28(内源性)、tert和rex1的mrna表达。将mrna表达相对于hprt的表达归一化，并作为与输入细胞的转录物水平相比的倍数诱导示出。图14g示出了3次脂质转染后的集落分析。与输入细胞相比，所有分析的标志物都高度表达，指示重编程细胞的多能性。与用包含2hbg和if的mrna重编程相比，包含fi的合成mrna的优越性通过较高的内源性标志物表达得以证实。这些结果表明，用fi-utr替代2hbg-utr实现更快速且更有效的基于rna的重编程技术。这可能基于由fi元件取代所产生的更长且更高的重编程转录因子表达。由于对if构建体没有观察到益处，因此fi元件的取向显示是不可缺少的。通过hes细胞样形态、ap活性以及所得ips-细胞集落的hes细胞表面标志物和内源性标志物的表达确定通过包含fi的mrna对细胞成功重编程。附表表1：为监测选择进程由实时逆转录酶-pcr(real-timereversetranscriptase-pcr，rt-pcr)实验的数据计算的以小时(h)计的mrna半衰期。在电穿孔后8小时、24小时和48小时量化mrna。在实验i(左)中，每个样品只分析一次。因此，没有给出标准偏差。样品mrna半衰期样品mrna半衰期2hbg7.5h2hbg13.5±0.2hlib4.5hrn413.9±0.7hrn14.9hrn516.5±0.7hrn26.7hrn37.5h表2：具有blasted序列的3’-utr中的结合区域(bindingregion，br)的7个主要组的概述。示出了组缩写、对各组鉴定的克隆数目(no.)、具有各自缩写(abbr.)的基因组来源、ncbi编码和相对于编码区在序列中的位置。根据nextbio，所有序列都在hidc中上调。表3：相对于我们的黄金标准2hbg计算的半衰期和随时间的总蛋白质的值。示出了组名称和各自的基因。表4：用于扩增文库和后续选择循环的pcr条件表5：ivt-t7转录反应表6：克隆并与我们的黄金标准2hbg(右下角)比较的组合。突出显示了克隆两次的单一元件。表7：作为单一元件或作为上游元件与作为下游元件的其他组序列之一组合克隆的fcgrt(b组)的结果。粗体值＞1.0。数值是相对于2hbg的。表8：作为单一元件或作为上游元件与作为下游元件的其他组序列之一组合克隆的lsp1(d组)的结果。粗体值＞1.0。数值是相对于2hbg的。表9：作为单一元件或作为上游元件与作为下游元件的其他组序列之一组合克隆的ccl22(e组)的结果。粗体值＞1.0。数值是相对于2hbg的。表10：作为单一元件或作为上游元件与作为下游元件的其他组序列之一组合克隆的aes(f组)的结果。粗体值＞1.0。数值是相对于2hbg的。表11：作为单一元件或作为上游元件与作为下游元件的其他组序列之一组合克隆的pld3(g组)的结果。粗体值＞1.0。数值是相对于2hbg的。表12：作为单一元件或作为上游元件与作为下游元件的其他组序列之一组合克隆的mtrnr1(i组)的结果。粗体值。数值是相对于2hbg的。表13：作为单一元件或作为上游元件与作为下游元件的其他组序列之一组合克隆的hla-drb4(j组)的结果。粗体值＞1.0。数值是相对于2hbg的。表14：在电穿孔到hidc中之后使用作为报道基因的luc2mut和新选择的3’-utr的代表性结果。在96小时期间测量萤光素酶活性。数值是相对于2hbg的。表15：电穿孔设置该表总结了使用的所有细胞类型的电穿孔方案的细节。将细胞计数下规定的细胞量与以μg或pmol规定的rna量在电穿孔杯或96孔电穿孔板(如规格所示)中的x-vivo15培养基(lonza)中混合。通过施加具有指定长度的脉冲和v下所列电压来进行电穿孔。在此之后，将细胞悬液在生长培养基中稀释并以细胞/时间点所列的浓度分布在96孔中。表16在电穿孔后未经修饰和经修饰的mrna以及在脂质转染后未经修饰的rna包含fi元件相对于2hbgutr的半衰期和总蛋白质将编码包含fi或2hbg作为3’utr之萤火虫萤光素酶基因的质粒用iis类限制性酶在多聚(da：dt)的下游线性化，由此产生超过多聚(da：dt)之外不具有另外核苷酸的模板。将线性化质粒dna使用羧化磁珠(invitrogen)纯化，通过分光光度法量化并进行体外转录。对于体外转录，在125mmhepesph8.35、34mmmgoac2、10mmdtt和2mm亚精胺缓冲液中将补充有rnase抑制剂和焦磷酸酶的自制t7rna聚合酶与7.5mmntp一起使用。为了有效地加帽rna，向反应中添加6mm的β-s-arca(d2)，并将初始gtp浓度降至1.5mm，在37℃下在2.5小时期间在补料分批过程中将其调节至7.5mm。通过羧化磁珠(invitrogen)纯化rna，并通过分光光度法和在2100生物分析仪(agilent)上分析评估rna浓度和质量。a)显示，在几种人和鼠细胞系中，包含fi元件的未经修饰mrna的半衰期高于或相当于包含2hbg3’utr的未经修饰mrna的半衰期。将表15中列出的人成纤维细胞(hff)、cd8+和cd4+t细胞、鼠胚胎成纤维细胞(mef)、成肌细胞(c2c12)和鼠dc量与相应量的rna(表15)在x-vivo15培养基(lonza)中混合并进行电穿孔。将指定数量的细胞平板接种在96孔皿中100μl包含添加剂的合适生长培养基中。在接种后2、6、24、48、72和96小时，通过在荧光阅读器(tecan)中添加萤光素(promega)来确定萤火虫萤光素酶活性。b)显示，在不同的人和鼠细胞系中，包含fi元件的经m1y修饰mrna的半衰期高于或相当于包含2hbg3’utr的经m1y修饰mrna的半衰期。将表15中列出的人未成熟树突细胞(idc)、成纤维细胞(hff)、cd8+和cd4+t细胞、鼠胚胎成纤维细胞(mef)、成肌细胞(c2c12)和鼠dc量与相应量的经m1y修饰rna(表15)在x-vivo15培养基(lonza)中混合并进行电穿孔。将指定数量的细胞平板接种在96孔皿中100μl包含添加剂的合适生长培养基中。在接种后2、6、24、48、72和96小时，通过在荧光阅读器(tecan)中添加萤光素(promega)来确定萤火虫萤光素酶活性。c)显示，当通过脂质转染来转染rna时，在不同细胞系中，包含fi元件的未经修饰mrna的半衰期也高于或相当于包含2hbg3’utr的未经修饰mrna的半衰期。将50ngrna与0.2μlrnaimax一起孵育15至30分钟并提供在96孔中的1e04hff、mef或c2c12细胞上。在3、6、12、24、48、72和96小时时，通过在荧光阅读器(tecan)中添加萤光素(promega)来测量萤光素酶水平。表17：将10μg包含fi元件或与原始fi序列具有指定同源性的fi元件变体作为3’utr的萤火虫萤光素酶编码rna电穿孔到96孔规格中的hidc中。在3小时、6小时、24小时、48小时和72小时时随时间追踪萤光素酶表达，并由所得表达曲线计算mrna半衰期和由rna翻译的总蛋白量。表18：将10μg包含fi元件或者含有结构保持或破坏性突变且与原始fi序列具有指定同源性的fi元件变体作为3’utr的萤火虫萤光素酶编码rna电穿孔到96孔规格中的hidc中。在3小时、6小时、24小时、48小时和72小时时随时间追踪萤光素酶表达，并由所得表达曲线计算mrna半衰期和总蛋白量。本文所述的序列如下b组>rn5-2pl-a4_for2>rn5-2pl-a3_for2>rn5c5_for2>rn5e6_for2>rn6-1woc3_for2>rn6-1wob12_for2>rn6-1wob1_for2>rn6-1wof3_for2>rn6-1wo_h11_b>rn6-2wog8_b>rn5-2pl-b3_for2>rn5_f5_b>rn5b8_for2>rn6-1woh9_for2>rn6-2woc11_for2>rn5_c3_b>rn6-2woh5_for2>rn6-96he12_for2>rn6-96h-2pl-e9_f>rn6-96h-2pl-h10_>rn6-1wob11_for2>rn6-1wof7_for2>rn6-1woa7_for2>rn6-2wod11_b>rn6-2wog3_for2>rn6-2woc2_for2>rn6-1wod6_for2>rn6-1wod10_for2>rn6-2wog5_for2>rn6-96h-2pl-g8_f>rn6-1woe7_for2>rn6-1wo_a12_b>rn6-1wog11_for2>rn6-1woh5_for2>rn6-1woh4_for2>rn6-2wob4_for2>rn6-96h-2pl-a5_f>rn6-1woc8_for2>rn5d1_for2>rn6-2wog10_for2>rn6-1wo_e4_b>rn6-2wof3_for2>rn6-96h-2pl-b10>rn6-96h-2pl-c10>rn6-1wob6_for2>rn6-96h-2pl-d6_f>rn6-96h-2pl-e6_f>rn6-2wof10_for2>rn6-1wog9_for2>rn6-96hc12_for2d组>rn6-1wof2_for2>rn6-2wod8_for2>rn6-1wod5_for2>rn5-2pl-d3_for2>rn6-2woa8_for2>rn6-2wod7_for2>rn6-2wob8_for2>rn6-96h-2pl-h6_f>rn6-96h-2pl-f10>rn5h3_for2>rn5g7_for2>rn6-1wog5_for2>rn6-1woa8_for2>rn6-96h_d3_b>rn6-96hc11_for2>rn5h1_for2>rn6-1wog2_for2>rn6-1wog7_for2>rn6-96hb11_for2>rn6-2wof8_for2>rn6-96h_a9_b>rn6-1woh3_for2e组>rn6-2woe2_for2>rn6-1wod3_for2>rn6-2wog7_for2>rn6-2woh2_for2>rn6-2woc1_for2>rn6-1wo_c12_b>rn6-1woe12_for2>rn6-2wof5_for2>rn5-2pl-h3_for2>rn6-2woa3_for2>rn6-96hf12_for2>rn6-96he11_for2>rn6-96h-2pl-a11f组>rn6-1wob5_for2>rn6-2woe11_a>rn6-96h_e3_b>rn6-96h-2pl-b6_fg组>rn5_d5_b>rn5b2_for2>rn5g3_for2>rn6-96hf11_for2>rn6-96h-2pl-d8_f>rn5c4_for2>rn6-2wod3_for2>rn6-96h-2pl-c6_f>rn6-96h-2pl-c7_f>rn6-96h-2pl-f8_f>rn6-96hh9_for2>rn5_f10_b>rn6-2wof11_for2>rn6-1woa9_for2>rn6-1wof9_for2i组>rn5_a7_b>rn5_b6_b>rn5d4_for2>rn5d2_for2>rn6-1wo_d7_b>rn6-96h-2pl-a9_f>rn6-2woh3_for2>rn6-96hg11_for2>rn5e1_for2>rn6-1woa11_for2>rn6-2woe7_for2>rn6-96h-2pl-b5_f>rn5h2_for2>rn6-1wof11_for2>rn6-2wob11_for2>rn6-1woa3_for2>rn6-1wo_d2_bj组>rn5a1_for2>rn5b1_for2>rn5_a10_b>rn5_g1_b>rn6-1wof5_for2>rn6-2woa5_for2>rn6-2woa7_for2>rn6-2wog2_for2>rn6-2woh10_for2>rn6-96h-2pl-g7_f>rn5-2pl-b2_for2>rn5-2pl-d1_for2>rn6-1woa5_for2>rn6-1wo_g10_b>rn6-2woe4_for2>rn6-96hg12_for2>rn6-96h-2pl-c12>rn6-96h-2pl-a6_f>rn6-96h-2pl-h5_f>rn6-2wog1_for2>rn6-96h-2pl-d11>rn6-96h-2pl-f9_f>hbg：无utr：>>bb>bd>be>bf>bg>bhbg>bi>bj>db>dd>de>df>dg>dhbg>di>dj>eb>ed>ee>ef>eg>ehbg>ei>ej>fb>fd>fe>ff>fg>fhbg>fi>fj>gb>gd>ge>gf>gg>ghbg>gi>gj>hbgb>hbgd>hbge>hbgf>hbgg>hbghbg>hbgi>hbgj>ib>id>ie>if>ig>ihbg>ii>ij>jb>jd>je>jf>jg>jhbg>ji>jj>fiutr97.5％同源性(随机修饰)>fiutr95％同源性(随机修饰)>fiutr92.5％同源性(随机修饰)>fiutr90％同源性(随机修饰)>fi8nt突变>fiutr98.75％同源性(结构去稳定化修饰)>fiutr97.5％同源性(结构去稳定化修饰)>fiutr96.25％同源性(结构去稳定化修饰)>fiutr95％同源性(结构去稳定化修饰)>fiutr97.5％同源性(结构保持修饰)>fiutr95％(结构保持修饰)>fiutr92.5％(结构保持修饰)>fiutr90％(结构保持修饰)当前第1页12