使用粘土矿物和碱性溶液制备含核酸样品的方法
【专利说明】使用粘±矿物和碱性溶液制备含核酸样品的方法
[0001] 政府权益声明
[0002] 本文所述的工作由美国陆军医学研究购置活动化S.ArmyMedicalResearch AcquisitionActivity)拨款提供部分资金，合同号为W81XWH-10-2-0158。美国政府对本 发明享有一定的权利。 柳的]背景
技术领域
[0004] 本发明一般地设及用于处理样品的方法，所述样品用于分子诊断应用。
[OCX)日]相关技术描述
[0006] 许多诊断、研究、和研发程序需要检测生物样品中存在的特定核酸值NA或RNA)序 列。例如，核酸检测方法用于鉴别细菌、病毒、或其它微生物，它们的存在可W说明感染性疾 病的原因。核酸生物标志物是几种对全球卫生有高度重要性的感染性疾病，包括人免疫缺 陷病毒化IV)、丙型肝炎病毒（HCV)、乙型肝炎病毒（皿V)、流行性感冒、和登革热的目标分 析物。更复杂样本，例如人组织的样品的测试也越来越普遍，其目的是确定与癌症或遗传病 相关的突变的存在。生物组织，例如从犯罪现场直接采集的血液中的核酸的检测，也被用于 确定作为样品来源的个体的身份，如，例如，亲子鉴定或法医分析。
[0007] 在核酸分子可W进行上述所说的任何目的的检测之前，必需使生物材料样品中的 特定的感兴趣核酸达到可用的状态。从生物样本中释放核酸的过程在本领域中通常被称为 "样品制备"。祀核酸常常被包含在病毒颗粒、细菌细胞、真菌细胞、或更复杂的生物体的细 胞，例如人白细胞内。
[0008] 在样品制备过程中，细胞或病毒颗粒可W进行化学或酶学处理W使膜和蛋白质包 膜溶解或变性，从而导致核酸的释放。运种溶解过程通常被称为"裂解"，所得到的含有运种 裂解物质的溶液被称为"裂解物"或"提取物"。可惜地是，运种释放使核酸暴露，会受到样 品中存在的内源核酸酶的降解，所述内源核酸酶存在的丰度可W使得在核酸释放之后立即 开始降解。在后续纯化过程中残余的任何核酸酶都可W继续降解完整的核酸，导致祀分子 从样品中消失。核酸酶在大多数生物样品中都是高丰度的，并且通常极能抵抗已知使其它 酶失活的处理。特别是，核糖核酸酶（RNases)即使不是在所有的生物样品中，也是在大部 分生物样品中是有活性的，特别是血液，而血液是最常收集的用于诊断目的的组织。除了核 酸酶之外，许多其他蛋白质和污染物常常存在于生物样品中，和/或在裂解物的制备过程 中被释放。例如，血液样品可W包括血红素和肝素（在抽血过程中使用的一种抗凝剂），它 们干扰和/或抑制许多下游的分析步骤。
[0009] 为了克服生物裂解物中存在的核酸酶和其它不希望的产物的问题，有必要设计复 杂的具有失活酶W及进一步纯化核酸二者的方案。例如，阴离子去垢剂和离液剂，例如硫氯 酸脈，已被用于在从细胞和亚细胞结构中释放核酸的同时失活或抑制核酸酶活性。为了进 一步从裂解物中纯化核酸，本领域中通常是使用低分子量的醇类使核酸从溶液中沉淀。由 于在运些条件下，其它大分子也会沉淀，产生包裹着核酸的粘性的、难处理的物质，在进行 乙醇沉淀之前常常必需借助于含有酪、和/或氯仿的危险有机溶剂混合物来提取样品。
[0010] 在制备用于RNA分析的样品中的另外一个挑战是保护运些不稳定分子的完整性。 不像DNA，RNA非常易于水解。因此，虽然可W在严格的条件下从生物样品制备含DNA的裂 解物，用于RNA分析的样品的制备通常需要使用稳定剂、核酸酶抑制剂和冷藏和/或冷冻。 两种方法的变形形式曾被用于制备来自生物样品的RNA:化学提取和固定在玻璃上，通常 被称为"固相提取"。如上所述，化学提取通常使用高度浓缩的离液盐和酸性酪或酪-氯仿 溶液来使RNases失活，并从其它生物分子中纯化RNA。运些方法提供了非常纯的RNA制备 物；但是，通常必须用醇沉淀步骤对RNA进行脱盐和浓缩。固相提取方法，在Boometal的 美国专利No. 5, 234, 809中描述，依赖于离液试剂硫氯酸脈的裂解和核酸酶失活特性，W及 运种试剂存在时的固态二氧化娃颗粒或娃藻类的核酸结合性质。用含有乙醇的高盐缓冲液 洗涂与二氧化娃结合的RNA之后，在低离子强度的缓冲液中洗脱RNA。
[0011] 容易理解，需要使用有机溶剂或离液剂进行水相提取的样品制备方法是冗长的、 危险的、劳动强度大的、和速度慢的。而且，如果在进行运些程序的时候没有特别小屯、，可能 发生核酸酶的残余污染，样本核酸会被降解或消失。用运种样品进行的诊断测试可能由于 运种降解而给出假阴性结果。假阴性结果还可W由于化学干扰造成，例如来自于残留的阴 离子去垢剂、离液盐、或样品中残余的并且会抑制祀序列扩增程序的乙醇。如果已经使用了 阴离子去垢剂和蛋白酶，残余的蛋白水解活性也可能降解祀序列扩增和/或杂交检测反应 中使用的酶，并产生假阴性结果。在'809专利中公开的基于"爆轰裂解度oomlysis)"方 案的样品制备方法通常被认为是充分应对了运些问题。但是，本发明人出人意料地发现，运 些提取方法，即使用离液盐结合固相提取，在制备用于皿V基因组的WPCR为基础的检测的 血液或血浆样品时，并不总是有效的。因此，上述的方案均不适于从复杂生物起始材料，例 如全血或血清中制备用于同时检测DNA和RNA祀序列的通用样品。运对于在临床实验室条 件下和在资源缺乏地区的传染病诊断来说的是千真万确的，在临床实验室条件下对时间的 要求非常高，在资源缺乏地区，成本效益、减少有毒废物流和简易性也很重要。
[0012] 虽然在该领域取得了进展，在本领域中仍然存在不同样品核酸的提取和含核酸溶 液的制备方法的需要。本发明满足了运些需要并进一步提供了相关的益处。 阳〇1引发明简述
[0014] 本发明的实施方案提供样品制备方法，所述方法克服了已知过程的缺陷。特别地， 本发明的实施方案的目的是提供样品制备方法，所述方法使得能够同时检测来自普通样 品，例如生物样品的DNA和RNA祀。本发明提供了前所未有的快速的、简单的、和可再现的 方法，W提供无损伤状态的并且具有低污染风险的核酸，W使得运种样品可W被立即用作 诊断分析中的试剂。本发明的实施方案是基于运样的样品制备方法，其中样品在提取或裂 解之前用粘±矿物进行处理。然后，用碱性溶液处理样品，W从含有感兴趣核酸的细胞或病 毒颗粒释放核酸（"碱裂解"）。
[0015] 本发明人令人惊讶地发现，用粘±矿物对样品（例如生物样品）进行预处理保护 核酸分子，特别是RNA，在碱裂解过程中不被水解。根据本发明方法的粘±矿物的使用还保 护核酸不发生核酸酶介导的降解。有利地，发现组合使用粘±矿物和碱溶液的方法使得含 核酸样品的制备不含抑制酶和/或降解酶和/或其它污染物，其足W使得该样品可W直接 用于检测测定，例如核酸扩增程序，而无需任何进一步的纯化步骤。因此，本发明的实施方 案提供快速的、简单的、和相对无危险的复杂生物样品制备方法，所述复杂生物样品用于同 时检测感兴趣的DNA和RNA分子。本发明还特别适合于微型化，并且与自给式"忍片实验 室"微流体盒和其它诊断测试试剂盒和装置兼容。相应地，一些实施方案设及在微流体环境 中，例如在微流体卡上实施所公开的方法。
[0016] 本发明人令人惊讶地发现当基于碱裂解的方法包括用粘±矿物对样品进行处理 时，运种方法可用于制备用于核酸分析的复杂生物样品。本发明的方法可有利地用于制备 普通样品，所述普通样品用于同时检测DNA和RNA祀分子。本发明的方法相对于已知的样 品制备方法提供了改进，所述改进在于本发明的特定实施方案不需要在检测前进一步纯化 或分离核酸。不受理论的束缚，相信粘±矿物提供几种有益效果，包括，但不限于，保护核酸 在碱性条件下不被水解；保护核酸不发生核酸酶介导的降解；保护下游测定试剂，例如DNA 聚合酶不受测试样品中存在的抑制剂和其它污染物影响；W及常规的缓冲性质。根据本发 明制备的核酸样品基本不含核酸酶活性，并且在用于修饰酶的时候是优选的底物。本文公 开的样品制备方法在制备用于同时检测DNA和RNA病毒的血液或血清样品的制备上是特别 有利的。本发明的主要实施方案的主要特征在下文中总结。本发明的其它不同目的和益处 将会随本发明的详细描述和本文提供的实施例而显而易见。
[0017] 在一个实施方案中，本发明设及处理用于核酸分析的含核酸样品的方法。该方法 包括使样品与粘±矿物接触，使样品与粘±矿物混合直至粘±矿物均匀分散在样品中，从 样品中基本上除去粘±矿物，使样品与碱性溶液在适合于细胞和病毒颗粒裂解的抑下接 触，W形成核酸溶液，W及，可选地，使核酸溶液与适合于中和核酸溶液的抑的酸性溶液接 触。在前述的一些实施方案中，样品是生物样品，例如含有生物样品的溶液。
[0018] 附图简述
[0019] 图1显示了定量PCR分析，W检测样品中皿VDNA，所述样品是对含皿V病毒颗粒 的人血浆进行提取产生的，其依据的方案是基于碱裂解。
[0020] 图2显示了定量PCR分析，W检测样品中MS2RNA，所述样品是对含有MS2RNA的人 血液进行提取产生的，其依据的方案是基于用粘±矿物进行处理，然后进行碱裂解。
[0021] 图3显示了定量PCR分析，W检测样品中MS2RNA，所述样品是对含有MS2颗粒的人 血浆进行提取产生的，其依据的方案是基于用粘±矿物进行处理，然后进行碱裂解。
[0022] 图4显示了定量PCR分析，W检测样品中HCVRNA，所述样品是对含有HCV颗粒的 人血液进行提取产生的，其依据的方案是基于用粘±矿物进行处理，然后进行碱裂解。 阳02引 图5显示了定量PCR分析，W同时检测样品中的皿VDNA和肥VRNA，所述样品是 对含有皿V和HCV颗粒的人血液进行提取产生的，其依据的方案是基于用粘±矿物进行处 理，然后进行碱裂解。