与来自于分枝杆菌之抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段的制作方法

本公开内容涉及与作为来自于分枝杆菌之抗原的培养滤液蛋白10(cfp-10)或抗原85b(ag85b)特异性结合的抗体或其抗原结合片段、编码它的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重组载体、以及包含所述重组载体的宿主细胞。[
背景技术：
]一般来说，结核是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)感染引起的疾病，并且被认为是世界上法定感染性疾病中发病率最高的疾病。因此，最重要的是进行用于在短时间内从怀疑感染有结核的患者获得可靠信息的早期诊断和治疗。结核菌素皮肤测试(tuberculinskintest，tst)是用于对结核进行诊断的常用方法，但是具有低特异性并因此在结核感染的标准方面不是高度可靠的。尽管如此，该测试由于高灵敏度和成本损失而仍然被广泛使用。此外，对结核分枝杆菌进行培养的方法是各种结核诊断方法中最可靠的测试方法，并且是通过结核分枝杆菌增殖来明确诊断结核的方法。然而，由于该方法需要分离并培养细菌，因此实验人员感染的风险不可忽视，并且培养细菌最少花费约4周至约6周，因此早期诊断是困难的。近来，已经使用了使用液体培养基或分枝杆菌生长指示管(mycobacteriagrowthindicatortube，mgit)方法的bactec系统。通过这种方法，使用液体培养基可缩短培养时间，并因此可确定结核分枝杆菌在约两周内增殖。然而，这种方法需要另外的明确诊断测试来区别非结核性分枝杆菌，并且存在例如以下问题：由使用放射性同位素导致的废物处理问题、结核分枝杆菌感染的风险，以及对昂贵设备的需求。因此，持续需要开发用于迅速且准确地检测结核分枝杆菌的技术，并且为此，必须开发特异性地检测在结核分枝杆菌增殖时分泌的抗原的方法。[发明详述][技术问题]提供了与作为来自于分枝杆菌之抗原的cfp-10特异性结合的抗体或其抗原结合片段、编码它的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重组载体、以及包含所述重组载体的宿主细胞。提供了与作为来自于分枝杆菌之抗原的ag85b特异性结合的抗体或其抗原结合片段、编码它的多核苷酸、包含所述多核苷酸的重组载体、以及包含所述重组载体的宿主细胞。[解决问题的方法]本公开内容的一个实施方案提供了与来自于分枝杆菌之cfp-10抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：含有seqidno：5的氨基酸序列的重链可变区；以及包含seqidno：6的氨基酸序列的轻链可变区。本公开内容的一个实施方案还提供了与来自于分枝杆菌之cfp-10抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：含有seqidno：7的氨基酸序列的重链可变区；以及含有seqidno：8的氨基酸序列的轻链可变结构域。本公开内容的另一个实施方案提供了与来自于分枝杆菌之ag85b抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：含有seqidno：9的氨基酸序列的重链可变区；以及含有seqidno：10的氨基酸序列的轻链可变区。本公开内容的另一个实施方案还提供了与来自于分枝杆菌之ag85b抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：含有seqidno：11的氨基酸序列的重链可变区；以及含有seqidno：12的氨基酸序列的轻链可变区。本公开内容的另一个实施方案还提供了与来自于分枝杆菌之ag85b抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：含有seqidno：13的氨基酸序列的重链可变区；以及含有seqidno：14的氨基酸序列的轻链可变区。本文中使用的术语“分枝杆菌”是指具有包含蜡质疏水性分枝菌酸的厚细胞壁的需氧抗酸革兰氏阳性菌。分枝杆菌可分类为在培养期间迅速生长的非致病性分枝杆菌和在培养期间缓慢生长的致病性分枝杆菌。cfp-10或ag85b抗原可来自于致病性分枝杆菌，例如结核分枝杆菌、牛分枝杆菌(mycobacteriumbovis)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、堪萨斯分枝杆菌(mycobacteriumkansasii)、胞内分枝杆菌(mycobacteriumintracellulare)、脓肿分枝杆菌(mycobacteriumabscessus)或鸟分枝杆菌(mycobacteriumavium)。本文中使用的术语“抗体”是指对来自分枝杆菌属之ag85b或cfp-10抗原具有特异性的抗体，其与ag85b或cfp-10抗原特异性结合，并且包括完整抗体以及抗体分子的抗原结合片段。完整抗体包含两条全长轻链和两条全长重链，其中每条轻链通过二硫键与重链连接。重链恒定区是γ、μ、α、δ或ε型的，其可进一步分类为γ1、γ2、γ3、γ4、α1或α2。轻链恒定区是κ或λ型的。本文中使用的术语“重链”包括全长重链及其片段，所述全长重链包含含有足以决定针对抗原之特异性的氨基酸序列的可变区(vh)和具有三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3)的恒定区。另外，本文中使用的术语“轻链”旨在包括全长轻链及其片段，所述全长轻链包含含有足以决定针对抗原之特异性的氨基酸序列的可变区(vl)和恒定区(cl)。本文中使用的术语“抗原结合片段”是指包含抗原结合区的完整免疫球蛋白的片段，以及包含抗原结合区的任何多肽部分。例如，抗原结合片段可以是f(ab′)2片段、fab′片段、fab片段、fv片段或scfv片段，但是本公开内容不限于此。在抗原结合片段中，fab片段具有轻链和重链的可变区、轻链的恒定区、以及重链的第一恒定区ch1，并且具有一个抗原结合位点。fab’片段与fab的不同之处在于fab’另外具有重链的铰链区，在重链ch1结构域的c端包含至少一个半胱氨酸残基。当fab’片段的铰链区的半胱氨酸残基通过二硫键连接时，产生f(ab′)2片段。fv片段是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，并且用于产生fv片段的重组技术是本领域中公知的。双链fv片段可具有其中重链可变区通过非共价键与轻链可变区连接的结构，并且单链fv片段通常可如双链fv片段中那样具有二聚体结构，其中重链可变区通过肽接头与轻链可变区共价结合，或者重链可变区和轻链可变区在其c端彼此直接连接。抗原结合片段可使用蛋白酶获得(例如，将完全抗体用木瓜蛋白酶消化以获得fab片段，以及用胃蛋白酶消化以获得f(ab′)2片段)，并且可通过基因重组技术制备。本文中使用的术语“特异性结合”或“特异性识别”对于本领域普通技术人员来说是公知的，并且表示抗原和抗体(或其抗原结合片段)彼此特异性地免疫反应。与来自于分枝杆菌之cfp-10或ag85b抗原特异性结合的抗原结合片段可包括在能够特异性识别cfp-10抗原或ag85b抗原的范围内的所附序列号中描述的氨基酸序列的变体。例如，为了增强抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性，抗体的氨基酸序列可被突变。例如，这样的突变包括抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或替换。氨基酸突变基于氨基酸侧链取代基的相对类似性而发生，例如疏水性、亲水性、电荷或尺寸。例如，精氨酸、赖氨酸和组氨酸各自是带正电荷的残基，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有类似的尺寸，并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有类似的形状。因此，基于上述考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸可以是生物功能等价物，丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸可以是生物功能等价物，并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可以是生物功能等价物。同时，其中分子活性未完全改变的蛋白质中的氨基酸替换是本领域中已知的。最常见的氨基酸替换可以是ala与ser之间、val与iie之间、asp与glu之间、thr与ser之间、ala与gly之间、ala与thr之间、ser与asn之间、ala与val之间、ser与gly之间、thy与phe之间、ala与pro之间、lys与arg之间、asp与asn之间、leu与ile之间、leu与val之间、ala与glu之间、或asp与gly之间的替换。考虑具有生物学等价活性的突变，与cfp-10抗原或ag85b抗原特异性结合的抗原结合片段也可被解释为包含与序列号中所公开的序列基本上相同的序列。基本上相同的序列可以是以下序列：当序列号的氨基酸序列和任意其他氨基酸序列比对以尽可能多地相互对应并且使用本领域中已知的常用算法分析所比对氨基酸序列时，其与序列号中所述序列具有至少60％同源性、至少70％同源性、至少80％同源性或至少90％同源性。用于序列比较的比对方法是本领域中已知的。例如，可使用通过ncbi局部比对检索基本工具(basiclocalalignmentsearchtool，blast)在互联网上可获得的序列分析程序之一，例如blastp、blastx、tblasm和tblastx。本公开内容的另一个实施方案提供了：编码与来自于分枝杆菌之cfp-10抗原特异性结合的抗体的重链可变区的多核苷酸，所述重链可变区包含seqidno：5或seqidno：7的氨基酸序列；以及编码与来自于分枝杆菌之cfp-10抗原特异性结合的抗体的轻链可变区的多核苷酸，所述轻链可变区包含seqidno：6或seqidno：8的氨基酸序列。本公开内容的另一个实施方案还提供了：编码与来自于分枝杆菌之ag85b抗原特异性结合的抗体的重链可变区的多核苷酸，所述重链可变区包含seqidno：9、seqidno：11或seqidno：13的氨基酸序列；以及编码与来自于分枝杆菌之ag85b抗原特异性结合的抗体的轻链可变区的多核苷酸，所述轻链可变区包含seqidno：10、seqidno：12或seqidno：14的氨基酸序列。本文中使用的术语“多核苷酸”是指作为单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物。除非在本文中另外特别地说明，否则多核苷酸包括rna基因组序列、dna(gdna和cdna)、以及由其转录的rna序列，并且包括天然多核苷酸的类似物。多核苷酸还包括编码与cfp-10抗原或ag85b抗原特异性结合的抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列及其互补序列。互补序列不仅包括完全互补的序列，而且还包括基本上互补的序列。这意指例如能够与编码与cfp-10抗原或ag85b抗原特异性结合的抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列杂交的序列。另外，编码与cfp-10抗原或ag85b抗原特异性结合的抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列可被突变。这样的突变包括核苷酸的插入、缺失、或者非保守或保守替换。编码与cfp-10抗原或ag85b抗原特异性结合的抗原结合片段的氨基酸序列的多核苷酸被解释为还包括与该核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列。基本上相同的序列可以是以下序列：当核苷酸序列和任意其他核苷酸序列比对以尽可能多地彼此对应并且使用本领域中常用的算法分析所比对核苷酸序列时，其与核苷酸序列具有至少80％同源性、至少90％同源性或至少95％同源性。根据一个实施方案，编码与cfp-10抗原特异性结合的抗体的重链可变区的多核苷酸可具有seqidno：15或seqidno：16的核苷酸序列。根据一个实施方案，编码与cfp-10抗原特异性结合的抗体的轻链可变区的多核苷酸可具有seqidno：17或seqidno：18的核苷酸序列。根据一个实施方案，编码与ag85b抗原特异性结合的抗体的重链可变区的多核苷酸可以是具有seqidno：19至21的核苷酸序列的多核苷酸中的任一种。根据一个实施方案，编码与ag85b抗原特异性结合的抗体的轻链可变区的多核苷酸可以是具有seqidno：22至24的核苷酸序列的多核苷酸中的任一种。本公开内容的另一个实施方案提供了包含上述多核苷酸的重组载体。本文中使用的术语“载体”是指用于在宿主细胞中表达靶基因的工具。例如，载体可以是质粒载体、黏粒载体和病毒载体，例如噬菌体载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体和腺相关病毒载体，但是本公开内容不限于上述实例。重组载体可通过操作本领域中常用作重组载体的质粒(例如，psc101、pgv1106、pacyc177、cole1、pkt230、pme290、pbr322、puc8/9、puc6、pbd9、phc79、pij61、plafr1、phv14、pgex系列、pet系列、puc19等)、噬菌体(例如，λgt4λb、λ-charon、λδz1、m13等)或病毒(例如，cmv、sv40等)来制备。重组载体可包含多核苷酸的核苷酸序列和与该核苷酸序列有效连接的启动子。本文中使用的术语“有效连接的”意指核苷酸表达调节序列(例如，启动子序列)与其他核苷酸序列之间的功能性连接，并且因此核苷酸表达凋节序列可调节所述其他核苷酸序列的转录和/或翻译。通常可将重组载体构建为用于克隆或表达的载体。用于表达的载体可以是用于在植物、动物或微生物中表达外来蛋白的通用载体。重组载体可使用本领域中已知的多种方法来构建。另外，可使用原核或真核细胞作为宿主细胞来构建重组载体。例如，当使用原核细胞作为宿主细胞时，所使用的表达载体通常包含能够起始转录的强启动子(例如，pl启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子、t7启动子等)、用于起始翻译的核糖体结合位点、以及转录/翻译终止序列。当使用真核细胞作为宿主细胞时，所使用的载体包含在真核细胞中发挥作用的复制起点，例如f1复制起点、sv40复制起点、pmb1复制起点、腺病毒复制起点aav复制起点、cmv复制起点、bbv复制起点等，但是本公开内容不限于上述实例。另外，还可使用来自于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子和hsv的tk启动子)，并且转录终止序列通常可以是多腺苷酸化序列。与此同时，可用于本公开内容的重组载体可通过操作本领域中常用的质粒(例如，psc101、cole1、pbr322、puc8/9、phc79、puc19、pet等)、噬菌体(例如，λgt4λb、λ-charon、λδz1、m13等)或病毒(例如，sv40等)来制备。本公开内容的重组载体可与其他序列融合以有利于纯化从其表达的抗原结合片段。融合的序列包括例如谷胱甘肽s-转移酶(pharmacia，usa)、麦芽糖结合蛋白(neb，usa)、flag(ibi，usa)、6xhis(六组氨酸；qiagen，usa)等，并且最优选6xhis。由于用于这样的纯化的附加序列，在宿主中表达的蛋白质可通过亲和色谱迅速且容易地纯化。与此同时，本公开内容的表达载体可包含本领域中常用的抗生素抗性基因作为选择标记。例如，抗生素抗性基因可包括针对氨苄西林、庆大霉素、羧苄西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素、潮霉素和四环素的抗性基因。本公开内容的另一个实施方案提供了包含上述重组载体的宿主细胞，即，用重组载体转化的细胞。为了制备本公开内容的转化细胞，可使用基因组dna序列及其转录物。转录物可使用本领域中已知的方法制备，并且当使用重组载体产生转录物时，首先可将载体线性化以制备转录物。能够稳定且连续地克隆或表达重组载体的宿主细胞可以是本领域中已知的任何宿主细胞。原核细胞可以是例如大肠杆菌(e.coli)jm109、大肠杆菌bl21、大肠杆菌rr1、大肠杆菌le392、大肠杆菌b、大肠杆菌x1776、大肠杆菌w3110；芽孢杆菌属(bacillusgenus)细菌，例如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)；肠细菌，例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、黏质沙雷菌(serratiamarcescens)和多种假单胞菌属(pseudomonas)物种；等。转化的真核宿主细胞可以是酵母(例如，酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞，例如sp2/0、cho(中国仓鼠卵巢)k1、chodg44、per.c6、w138、bhk、cos-7、293、hepg2、huh7、3t3、rin、mdck细胞系等。多核苷酸或包含它的重组载体可使用本领域中公知的转移方法转移到宿主细胞中。当使用原核细胞作为宿主细胞时，可使用cacl2法、电穿孔法等进行转移，并且当使用真核细胞作为宿主细胞时，可通过显微注射、磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染、基因轰击等进行转移，但是本公开内容不限于上述实例。当使用微生物(例如大肠杆菌)作为宿主细胞时，抗体的产生高于动物细胞中的抗体产生。然而，由于糖基化问题，微生物不适于产生完整的ig型抗体，但是微生物可用于产生抗原结合片段(例如fab和fv)。转化的宿主细胞可通过本领域中公知的任何方法使用由选择性标志表达的表型来选择。例如，当选择性标志是特定的抗生素抗性基因时，在包含抗生素的培养基中培养转化体，并因此可容易地选择转化体。[发明的有益效果]当使用本发明的抗原结合片段时，可以以高灵敏度检测作为来自于分枝杆菌之抗原的cfp-10或ag85b，可开发能够迅速且准确地检测分枝杆菌的试剂盒。[附图简述]通过以下结合附图对实施方案的描述，这些和/或其他方面将变得明显且更易于理解，在附图中：图1示出了根据生物淘选循环的ag85b特异性人抗体-噬菌体文库的鉴定结果；图2示出了从人抗体-噬菌体文库分离的ag85b特异性单噬菌体与ag85b抗原之间结合的确定结果；图3示出了ag85b特异性单噬菌体与ag85b的结合位点的鉴定结果；图4示出了根据生物淘选循环的cfp-10特异性人抗体-噬菌体文库的鉴定结果；图5示出了cfp-10特异性单噬菌体与cfp-10抗原之间的结合强度的确定结果；图6是示出针对ag85b的人igg重链表达载体或轻链表达载体的图；图7是示出了c12和8b3抗体的抗原结合活性的表面等离子体共振结果图；图8是示出了50b14和8b3抗体的抗原结合活性的表面等离子体共振结果图；图9是示出针对cfp-10的人igg重链表达载体或轻链表达载体的图；以及图10示出了显示第2和3组抗体的抗原结合活性的表面等离子体共振结果。[本发明的实施方案]在下文中，将参照以下实施例进一步详细描述一个或更多个实施方案。然而，提供这些实施例仅是出于举例说明的目的，并非旨在限制本公开内容的范围。实施例1：结核分枝杆菌抗原cfp-10和ag85b的重组蛋白的产生和纯化为了产生cfp-10抗体和ag85b(p85)抗体，产生了重组抗原cfp-10和ag85b。每种对应基因使用结核分枝杆菌(m.tuberculosis)的基因组dna作为模板并且使用cfp-10-f引物(seqidno：1)、cfp-10-r引物(seqidno：2)、ag85b-f引物(seqidno：3)和ag85b-r引物(seqidno：4)通过聚合酶链反应(pcr)进行扩增(shin等，clin.vaccineimmunol.，15：1788，2008)(参见表1)。将扩增的pcr产物用限制性酶bamhi和ecori消化，并插入到pet28a(novagen，usa)的bamhi/ecori位点中。将重组质粒转化到大肠杆菌(escherichiacoli，e.coli)bl21(de3)中，并随后在37℃下培养直至od600值达到0.4至0.5。培养之后，通过向所得大肠杆菌中添加iptg至终浓度为1mm来诱导过表达，并将培养溶液离心以回收培养的大肠杆菌。将回收的大肠杆菌悬浮于20mmtris-hcl(ph8.0)、0.5mnacl、20mm咪唑和1mm苯甲磺酰氟(pmsf)中。在此之后，通过超声波破碎细胞，并通过ni-nta琼脂糖柱(invitrogen，usa)纯化重组蛋白。<表1>(加有下划线的部分表示限制性酶位点)实施例2：与结核分枝杆菌抗原ag85b特异性结合的抗原结合片段的选择和纯化使用人抗体-噬菌体文库鉴定与ag85b抗原特异性结合的抗原结合片段。2-1：与ag85b(p85)特异性结合的抗原结合片段的选择通过用2ml根据实施例1产生的ag85b抗原(10μg/ml)包被免疫管并使包被的抗原与人抗体-噬菌体文库反应来进行用于选择初始结合噬菌体的生物淘选。此时，文库中噬菌体的总数为约2×1013cfu。随后，通过洗涤10次去除非特异性噬菌体，并随后用剩余的噬菌体感染大肠杆菌xl-1blue以扩增噬菌体。从扩增的噬菌体中回收初级子文库，并使用该子文库进行总共三次抗原-噬菌体反应和选择过程。每个淘选过程中噬菌体的数目如下表2所示。<表2>为了确定展示在噬菌体上的蛋白质是否识别ag85b抗原，使以ag85b抗原包被的板与所选择的噬菌体反应，并使结合的噬菌体与二抗(抗m13-hrp)结合。随后，向其中添加邻苯二胺二盐酸盐/h2o2底物(opd/h2o2底物)，并随后分析在490nm波长的信号。此时，为了相对地比较与ag85b特异性结合的噬菌体的数目和噬菌体的总数，使用所有噬菌体都表达的重组c-myc标签进行与myc-elisa分析结果的比较。从结果证实，在每次淘选中从文库获得的噬菌体的数目彼此相似，并且在这些噬菌体中，随着淘选循环的进行与ag85b特异性结合的噬菌体的数目增多(参见图1)。2-2：与ag85b特异性结合的抗原结合片段的纯化由于噬菌体文库与ag85b的结合强度在四级淘选之后并未显著提高，因此从在四级淘选中获得的噬菌体文库分离单克隆噬菌体抗体。特别地，从四级噬菌体文库收集约40个集落(xl-1blue)，并单独地表达噬菌体并在培养溶液中收获。随后，在单独地产生的噬菌体中对ag85b和c-myc进行单噬菌体elisa分析。结果证实，总共60％或更多的噬菌体表现出与ag85b的结合活性(参见图2)，并且作为使获得的单噬菌体与ag85b的两个亚基p32和p33结合以确定所得噬菌体与ag85b的哪个位点结合的结果，确定单噬菌体与p32选择性地结合，而不与p33结合(参见图3)。随后，为了分析单噬菌体的特征，提取相应单克隆的噬菌粒，并通过bsti限制性酶处理对其进行dna指纹分析。结果，获得了三种类型的scfv抗体(8b3、50b14和c12)，并分析每种抗体的氨基酸序列(8b3的重链可变区：seqidno：9，8b3的轻链可变区：seqidno：10，50b14的重链可变区：seqidno：11，50b14的轻链可变区：seqidno：12，c12的重链可变区：seqidno：13，以及c12的轻链可变区：seqidno：14)。实施例3：与结核分枝杆菌抗原cfp-10特异性结合的抗原结合片段的选择和纯化3-1：与cfp-10特异性结合的抗原结合片段的选择以与实施例2中相同的方式选择噬菌体，不同之处在于淘洗过程重复三次，并且确定展示在噬菌体上的蛋白质是否识别cfp-10抗原(10kda培养滤液抗原)。结果证实，在每次淘选中c-myc是相似的，而随着淘选循环的进行，与cfp-10特异性结合的噬菌体的数目增多(参见图4)。3-2：与cfp-10特异性结合的抗原结合片段的纯化由于噬菌体文库与cfp-10的结合强度在三级淘选中显著提高，因此以与实施例2中相同的方式从在三级淘选中获得的噬菌体文库分离单噬菌体。从分离的单噬菌体中选择了96个克隆，并且作为通过elisa分析所选克隆与cfp-10的结合强度的结果，鉴定出以高比例与cfp-10结合的抗体(参见图5)。在这96个克隆中，分析了具有强信号的62个克隆的序列，并且作为彼此比较抗原识别位点的序列的结果，鉴定出6种类型的抗体(参见表3)。<表3>克隆的总数：62数目第1组ighv1-69*01/igkv2d-40*0132第2组ighv3-9*01/iglv1-47*0220第3组ighv3-33*01/iglv1-47*015第4组ighv1-69*061第5组ighv3-30*181第6组ighv3-72*01/igkv1-17*022无信号1为了确定各组的单克隆抗体的结合强度，将cfp-10抗原的浓度从1μg/ml按照1/5以逐步方式稀释，并用其包被板，随后进行elisa分析。结果证实，即使在其中抗原被稀释1/3125倍(约350pg/ml)的情况下，定量检测也是可能的，并且第4和6组显示出最强的结合强度。在这六个组中，获得两种类型的scfv抗体(第2组和第3组)，并且分析每种抗体的氨基酸序列(第2组的重链可变区：seqidno：5，第2组的轻链可变区：seqidno：6，第3组的重链可变区：seqidno：7，以及第3组的轻链可变区：seqidno：8)。实施例4：与ag85b特异性结合的igg抗体的产生使用根据实施例2获得的scfv抗体的序列产生完整igg抗体。4-1：针对ag85b的人igg重链或轻链表达载体的构建在针对ag85b的每种scfv抗体的序列中，使用相应的引物扩增重链可变区和轻链可变区，并且用限制性酶sfii/nhei或sfii/bgiii酶切扩增的重链可变区和轻链可变区。随后，将片段插入并连接到pnatabh和pnatabl中，其是用相同限制性酶酶切的人igg重链表达载体或轻链表达载体(参见图6)。将载体转化到xl-1blue中并培养，并随后对其进行菌落pcr以确定抗体序列是否正确地插入到载体中(参见图6)。4-2：ag85b单克隆抗体的表达和纯化将hek293细胞与重链表达载体和轻链表达载体共转染，并且每三天回收细胞培养溶液以获得由hek293细胞表达并分泌的抗体。将约500ml回收的细胞培养溶液浓缩10倍，并随后使用蛋白a珠(琼脂糖：pharmacia)纯化抗体。使用表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance，spr)方法测量所获得ag85b单克隆抗体的抗原结合亲和力。使结合有金结合多肽(gbp)的c12分别以25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的浓度在用金包被的芯片上反应，并随后使用500μg/ml的bsa去除非特异性反应。随后，使10μg/ml根据实施例1制备的ag85b抗原与其结合，并再使用100μg/ml的bsa去除非特异性反应，随后与浓度为50μg/ml的8b3反应。结果，如图7中所示，确定c12和8b3与ag85b抗原高度特异性结合(参见图7)。此外，使结合有gbp的50b14分别以25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml的浓度在用金包被的芯片上反应，使用500μg/ml的bsa去除非特异性反应，使10μg/ml的实施例1的ag85b抗原与其结合，并随后再使用100μg/ml的bsa去除非特异性反应，随后与浓度为50μg/ml的8b3反应。结果，如图8所示，确定50b14和8b3与ag85b抗原高度特异性地结合(参见图8)。实施例5：与cfp-10特异性结合的igg抗体的产生5-1：针对cfp-10的人igg重链表达载体或轻链表达载体的构建以与上述实施例4-1中相同的方式将cfp-10抗体的序列插入到载体中并转化到xl-1blue中(参见图9)。5-2：cfp-10单克隆抗体的表达和纯化将hek293细胞与针对第2组或第3组的轻链表达载体和重链表达载体共转染，并且每三天回收细胞培养溶液以获得从转染的hek293细胞表达且分泌的抗体。将约500ml回收的细胞培养溶液浓缩至约50ml，并随后使用蛋白a珠(琼脂糖：pharmacia)结合抗体并使用甘氨酸纯化。将经纯化的cfp-10抗体(约10ml)在透析之后储存在-20℃下，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和银染鉴定所获得抗体。通过表面等离子体共振(spr)方法测量所获得cfp-10单克隆抗体的抗原结合亲和力。使结合有gbp的第3组分别以100μg/ml、50μg/ml、10μg/ml和1μg/ml的浓度在用金包被的芯片上反应，使用100μg/ml的bsa去除非特异性反应，使100μg/ml的实施例1的cfp-10抗原与其结合，并随后再使用100μg/ml的bsa去除非特异性反应，随后与浓度为100μg/ml的结合有二氧化硅结合蛋白(silicabindingprotein，sbp)的第2组反应。结果，如图10中所示，确定第2组和第3组与cfp-10抗原高度特异性地结合(参见图10)。实施例6：ag85b抗体和cfp-10抗体的特异性分析为了测量根据实施例4和5产生的抗体的特异性，通过elisa检测存在于其他分枝杆菌培养溶液中的抗原。结果证实，仅在结核分枝杆菌培养溶液中特异性地检测到cfp-10抗原和ag85b抗原(参见表4)。<表4>尽管已经描述了本公开内容的示例性实施方案，但是本公开内容所属领域的普通技术人员将理解的是，本发明可以以多种经修改的形式具体化而不偏离本发明的范围或其本质特征。因此，本文中描述的实施方案应被认为仅是举例说明性的而不是出于限制的目的。本公开内容的范围由所附权利要求书限定，而不由前面的描述限定，并且在与其等价的范围内的所有差异应被解释为在本公开内容的范围内。<110>中央大学校产学协力团<120>与来自分枝杆菌的抗原结合的抗体或抗原结合片段<130>px160035pct<160>24<170>kopatentin2.0<210>1<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>cfp-10-f引物<400>1ggccggggatccatggcagagatgaagaccg31<210>2<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>cfp-10-r引物<400>2ggccgggaattcgaagcccatttgcgaggac31<210>3<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>ag85-f引物<400>3ggccggggatccagcgaagagccggacgatg31<210>4<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>ag85-r引物<400>4ggccgggaattcgagcatgagactcgatcag31<210>5<211>112<212>prt<213>人工序列<220><223>第2组的重链<400>5leuvalgluserglyglyaspleuvalglnproglyargserleuarg151015leusercysvalalaserglyphethrpheaspaspphealamethis202530trpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalserglyile354045thrtrpasnserglythrilealatyralaaspservallysglyarg505560phethrleuserargaspasnalalysasnserleuserleuglumet65707580asnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcysalaarggly859095histyrglyleuaspvaltrpglyhisglythrlysvalthrvalser100105110<210>6<211>114<212>prt<213>人工序列<220><223>第2组的可变轻链<400>6aspvalhisserglnphevalleuthrglnproproservalsergly151015thrproglyglnargvalthrilesercysserglysertyrserasn202530ileglythrasntyrvaltyrtrptyrhisglnleuproglythrala354045prolysleuvalileglnlysasnthrglnargproserglyvalser505560aspargpheserglyserargserglythrseralaserleualaile65707580serglyleuargsergluaspgluglyasntyrphecysseralatrp859095aspaspserleuseralavalleupheglyglyglythrlysleuthr100105110valleu<210>7<211>125<212>prt<213>人工序列<220><223>第3组的可变重链<400>7aspvalhisserglnvalglnleuvallysserglyglyglyleuval151015glnproglyglyserleuargleusercysalaalaserglyphethr202530phesersertyralametsertrpvalargglnalaproglyglugly354045leuglutrpvalseralailethrglyglyglyglyserthrtyrtyr505560alaaspservalargglyargphethrileserargaspasnserlys65707580asnthrleutyrvalglnmetasnserleuargalagluaspthrala859095valtyrtyrcysalalysprolystyrserserglytrptyraspala100105110pheaspiletrpaspglnglythrmetvalthrvalser115120125<210>8<211>100<212>prt<213>人工序列<220><223>第3组的可变轻链<400>8valserglythrproglyglnargvalthrilesercysserglyser151015tyrserasnileglythrasntyrvaltyrtrptyrhisglnleupro202530glythralaprolysleuvalileglnlysasnthrglnargproser354045glyvalseraspargpheserglyserargserglythrseralaser505560leualaileserglyleuargsergluaspgluglyasntyrphecys65707580seralatrpaspaspserleuseralavalleupheglyglyglythr859095lysvalthrval100<210>9<211>134<212>prt<213>人工序列<220><223>8b3的可变重链<400>9glnvalglnleuvalglnserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleulysleusercysalaalaserglyphethrleuserglyser202530alamethistrpvalargglnalaserglylysglyleuglutrpval354045glyargileargserlysserasnasntyralathralatyralaala505560provallysglyargphethrileserargaspaspserlysasnthr65707580alatyrleuglnmetasnserleulysthrgluaspthralavaltyr859095tyrcysalaargalatyrtyraspphetrpserglytyrtyrargleu100105110vallysvalalaargproprothrtyrpheasptyrtrpglyglngly115120125thrleuvalthrvalser130<210>10<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>8b3的可变轻链<400>10argleuvalleuthrglnserproglythrleuservalserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnseralalysthrasn202530valalatrptyrglnglnlyspheglyglnalaproargvalleuile354045tyrglyalaserthrargalathraspileproalaargphesergly505560serglyserglythrasppheserleuthrileserargleuglupro65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglntyrglyserserprotrp859095thrpheglyglnglythrglnvalgluilelys100105<210>11<211>12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