本申请要求2015年12月31日提交的美国临时申请第62/273,654号的优先权，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入。
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本发明包含与病毒样颗粒(vlp)相关的方法和组合物，所述病毒样颗粒含有能够对目标昆虫产生rnai介导的基因抑制效应的异源货物分子。此类组合物和方法在作物保护和昆虫防治的其它方面中具有应用。
背景技术：
首先描述于线虫秀丽隐杆线虫(c.elegans)中的rnai介导的基因抑制已显示为在许多其它生物体中调节基因表达的有效方法。fire等人,秀丽隐杆线虫中通过双链rna的强力和特定基因干扰(potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedrnaincaenorhabditiselegans).《自然(nature)》391:806(1998)。已由多个研究小组使用双链rna(dsrna)展示rnai在防治影响作物的昆虫的增殖中的作用。综述于ivashuta等人食草昆虫中的环境rnai(environmentalrnaiinherbivorousinsects).《核糖核酸(rna)》21:840(2015)中。用于现有技术中描述的rnai目的的重组rna构筑体一般由约18至约25个碱基对的dsrna(sirna)组成，但也包括通常介于约100至约1,000个碱基对(bp)之间的较长dsrna(长dsrna)。为了将dsrna成功地引入至昆虫中，需要长于或等于大致60bp的dsrna以在供应于昆虫的饮食中时高效吸收。bolognesi等人由西方玉米根虫(勒孔特西方玉米根叶甲)的幼虫肠细胞中的snf7rnai引起的超微结构变化(ultrastructuralchangescausedbysnf7rnaiinlarvalenterocytesofwesterncornrootworm(diabroticavirgiferavirgiferaleconte))《公共科学图书馆·综合(plosone)》7:e47534(2012)。长dsrna分子通过宿主的dicer酶复合物在体内裂解成sirna的多样群体。或者，rnai基因抑制也可以通过反义rna针对特定序列的作用，经由相关过程而发生。防治田间昆虫的rnai方法的实际应用受到体外rna合成的成本和rna，甚至dsrna对环境和酶降解的化学脆弱性限制。
已显示噬菌体ms2衣壳介导的毒素和显影剂递送至人类癌细胞是将此类药剂递送至体外真核细胞的有效方法。ashley等人,多种多样的货物通过噬菌体ms2病毒样颗粒的细胞特异性递送(cell-specificdeliveryofdiversecargosbybacteriophagems2virus-likeparticles).《美国化学学会·纳米(acsnano)》5:5729(2011)。此类噬菌体衣壳是否可以在将rnai前体递送至田间昆虫中起类似作用是未知的。将rnai前体有效递送至目标昆虫中需要预防非特异性rna降解、便捷的投药途径和在目标昆虫内的适当点释放rnai前体以使得rnai前体可以被昆虫细胞吸收且经恰当处理的能力。理想地，rnai前体和递送系统必须是经济的且生产和分配必须相对简单。本文中描述的本发明满足所有这些标准且具有允许新rnai分子的快速发现、原型设计和商业规模生产的附加益处。
技术实现要素：
本文中描述的本发明使用vlp(或者称为apserna容器，或“arc”)的独特性质来提供递送长dsrna和rnai前体(dsrnai)的改进的系统，dsrnai可以在细胞内加工以产生用于抑制优选昆虫宿主，更优选鞘翅目(coleopteran)或鳞翅目(lepidopteran)害虫中的靶基因表达的sirna。备受关注的是鞘翅目昆虫，如树皮甲虫、榆树叶甲虫、亚洲长角甲虫、窃盗甲虫(deathwatchbeetle)、山松甲虫、椰子铁甲虫(coconuthispinebeetle)、各种玉米根虫和科罗拉多马铃薯甲虫(coloradopotatobeetle)。防治科罗拉多马铃薯甲虫的rnai方法是尤其需要的，因为这些甲虫已对几乎所有的已知杀虫剂产生抗性。
已知鞘翅目害虫易受通过直接注射或通过以用rnai前体处理的植物为食而经由肠道引入的rnai影响。由于rna对环境特异性和非特异性降解的敏感性，田间施用裸rna一般不实际。此外，rna高度易受进食和通过昆虫肠道中转过程期间的降解影响。高度稳定形式的vlp用以在体外保护vlp内负载的rna。仍存在的问题是vlp能够将rnai前体有效地递送至目标昆虫的rnai加工路径，如dicer？具体来说，vlp能够保护昆虫消化道内的rnai前体且仍将完整rnai前体递送至目标昆虫的rnai加工路径？本文呈现的结果指示vlp极有效地将rnai前体递送至目标昆虫中。
通过本文所描述的方法产生rnai前体的重要优势是避免高成本且复杂的rna前体体外合成且可以通过简单且经济的发酵方法产生所需rna构筑体。如下促进大量rnai前体的生产和纯化：通过任选地偶合合成表达自组装噬菌体衣壳蛋白质(如噬菌体qβ或ms2的那些)的所需聚核苷酸以产生易于纯化且相对稳定的arc(vlp)，其可以例如通过喷洒直接施用于植物表面，目标害虫在所述植物表面上进食。
在摄入后，arc可以在经过昆虫宿主肠道的过程中消化且rna分子被内衬肠道的细胞吸收。在目标昆虫细胞内，rnai前体尤其通过宿主dicer酶复合物加工以产生针对宿主基因转录物的有效rnai形式以抑制必需宿主基因的表达。此类必需基因的实例包括(但不限于)参与控制蜕皮或其它幼体发育事件的基因、肌动蛋白或其它细胞结构组分，以及与复制、转录或翻译或生存力所需的其它基本过程相关的几乎任何基因。
具体实施方式
本发明包含dna序列，所述dna序列当经转录时产生翻译为噬菌体外壳蛋白的rnai前体分子和mrna，其共同并入到独特稳定的vlp中。vlp可以适合于被进食的昆虫摄入的形式纯化。在被目标昆虫摄入后，vlp经过肠道，接着在肠道中被吸收至昆虫细胞中，rnai前体在所述昆虫细胞中被加工成抑制对昆虫生存力重要的靶基因的表达的rnai形式。在一些实施例中，此类靶基因的抑制经设计以导致目标昆虫的死亡。在另一实施例中，靶基因的抑制经设计以产生无菌后代。vlp的关键特征是其足够稳定以保护衣壳化rnai前体免受非特异性环境因素或昆虫靶细胞rna酶降解，在其被摄入之后仍能够将rnai前体引入至目标昆虫细胞中的rnai路径中。
本文呈现的示例序列经设计以接合至合适的细菌质粒载体中作为asisi-noti消化的dna片段。此类dna序列片段可以通过直接合成或通过使用所属领域的技术人员众所周知的技术亚克隆组成片段而产生。可以视需要修饰特定序列以操纵特定限制酶位点、并入替代核糖核酸酶结合位点、适应替代噬菌体pac序列且rnai序列的特异性可以经修饰以靶向不同基因和昆虫宿主。含有能够诱导转录这些dna序列的转录启动子的细菌质粒载体包括(但不限于)噬菌体t7基因1启动子、噬菌体t5启动子和噬菌体λpl和pr启动子。细菌质粒载体也可以含有从诱导型启动子表达的噬菌体qβ或噬菌体ms2衣壳蛋白编码序列。或者，此类诱导表达的衣壳蛋白可以存在于与携有诱导性货物rna序列的细菌质粒相容的独立细菌质粒上。
含有rna货物分子的vlp的生产和纯化以及rna货物分子的回收详细地描述于美国专利申请公开案第2013/0208221号(至少第0013和0014段)、第2014/0302593号(至少第0016、0052、0065和0085-0086段)中且如美国专利第9,181,531号(各处)中所述，其内容各自以引入的方式并入本文中。另外，相关方法也描述于美国专利申请公开案第2010/0167981号和第2012/0046340号、pct/us2012/071419和pct/us2014/041111，以及美国专利第5,443,969号和6,214,982号中，其内容也各自以引入的方式并入本文中。通过这些方法产生的vlp可以所属领域的技术人员已知的多种不同方式加工以便于将此类材料施用至植物上和用于田间。在一个实施例中，纯化的arc经进一步加工以用于喷洒操作。此类加工可以包括喷雾干燥、引入稳定剂或润湿剂或在施用之前形成vlp与其它所需药剂的掺和物。田间施用可以涉及地面或天线喷雾方法或点施。
所属领域的技术人员应理解，本发明可以通过修饰来自实例中描述的那些序列的序列而靶向不同昆虫宿主中的不同基因，以反映靶向的宿主生物体中的靶向基因的序列。因此，本发明向所属领域的技术人员提供用于确定抑制任何给定宿主细胞中的特定基因的最佳rnai标靶的工具和用于产生大量的此类rnai的方法。另外，本发明提供凭经验确定哪种基因或基因组可以构成单一昆虫或昆虫组内的最有效rnai标靶的方法，所述方法是通过以组合克隆方法筛选含有靶向此类昆虫中的特定基因或基因组合的各种rnai前体的vlp的有效性。本发明也支持将对防治田间的某些昆虫有效的vlp与对防治施用点处的其它昆虫有效的不同vlp组合的方法，以使昆虫防治特性适应于施用点处相关的那些。不同昆虫可以具有与由原始vlp靶向的那些不同的目、属或种，或可以包含rnai耐受性或rnai耐受性群体的组合，其中靶向目标昆虫群体内的不同基因的一或多种vlp的组合确保不太可能出现rnai耐受性的组合。
在本发明的一个实施例中，细菌宿主内的第一dna序列经转录以产生编码噬菌体外壳蛋白的第一rna分子，且所述细菌宿主内的第二dna序列经转录以产生第二rna分子，所述第二rna分子包含噬菌体pac位点，接着是来自昆虫的靶基因的反义序列，接着是能够形成单链环的独特rna序列，接着是与靶基因序列的反义序列互补的有义序列，接着是第二噬菌体pac位点。第一rna分子是通过细菌宿主翻译以产生多个噬菌体外壳蛋白的mrna，其与包含噬菌体pac序列的第二rna分子组合而自发地形成vlp，其中第二rna分子包装在vlp内。vlp在施用至植物的外表面之前经分离与纯化。以植物为食的目标昆虫摄入vlp，转而将vlp内负载的rna分子引入至宿主昆虫细胞中，所述rna分子在宿主昆虫细胞中通过宿主昆虫细胞的内源性rnai路径加工，导致宿主昆虫靶基因的基因表达的rnai介导抑制。在一个实施例中，昆虫属于鞘翅目。在优选实施例中，鞘翅目昆虫是科罗拉多马铃薯甲虫。
在本发明的另一实施例中，细菌宿主内的第一dna序列经转录以产生编码噬菌体外壳蛋白的第一rna分子，且所述细菌宿主内的第二dna序列经转录以产生第二rna分子，所述第二rna分子包含噬菌体pac位点，接着是来自昆虫的靶基因的反义序列，任选地接着是一个或多个噬菌体pac位点。第一rna分子是通过细菌宿主翻译以产生多个噬菌体外壳蛋白的mrna，其与包含噬菌体pac序列的第二rna分子组合而自发地形成vlp，其中第二rna分子包装在vlp内。vlp在施用至植物的外表面之前经分离与纯化。以植物为食的目标昆虫摄入vlp，转而将vlp内负载的rna分子引入至宿主昆虫细胞中，所述rna分子在宿主昆虫细胞中导致宿主昆虫靶基因的基因表达的反义rna介导抑制。在一个实施例中，昆虫属于鞘翅目。在优选实施例中，鞘翅目昆虫是科罗拉多马铃薯甲虫。
在另一实施例中，含有编码噬菌体外壳蛋白的第一dna序列和编码各种rnai序列的不同第二dna序列的一系列宿主细菌经分离。每个分离的宿主细菌以克隆方式扩增且将细菌细胞系存档。每个细菌细胞系的样品随后长大成熟且经诱导以转录第一和第二dna序列，允许vlp在宿主细菌内组装且使vlp与宿主细菌分离。所得vlp系列内的rna序列各自编码不同反义序列和任选地互补有义序列，所述序列与不同昆虫靶基因同源或在给定昆虫靶基因的不同区域上或一起在来自不同昆虫目标的靶基因上。将通过宿主细菌系列产生的不同vlp中的每一个投喂给目标昆虫且测量其抑制宿主昆虫基因表达的能力，例如通过对目标昆虫死亡率评分。产生最大水平的基因表达的rnai介导抑制的那些vlp表示针对所述特定目标昆虫或给定目标昆虫基因内的位置的最有效rna标靶。依赖于产生每一vlp的对应细菌细胞系允许快速识别对应靶序列或基因。同样，依赖于对应宿主细菌细胞系促进宿主昆虫靶基因的基因表达的rnai介导抑制所需的vlp的快速规模放大以用于田间施用或进一步的实验研究。所属领域的技术人员将识别到，可以使用多重或自动化克隆技术筛选基于昆虫基因组序列数据的互补dna序列的随机或伪随机集合或编码可能必需的基因的此类基因组序列的子集。
以下实例说明本发明且不打算限制如在上文详述且如在所附权利要求书中陈述的本发明的范围。
实例1
通过含有rnai前体的vlp防治科罗拉多马铃薯甲虫的功效
为了确定含有靶向科罗拉多马铃薯甲虫(另一鞘翅目昆虫)的β-肌动蛋白基因的dsrnai前体的vlp是否可以与裸dsrnai前体同样有效地抑制β-肌动蛋白表达，进行以下研究。来自科罗拉多马铃薯甲虫的β肌动蛋白的294bp片段(马铃薯甲虫(leptinotarsadecemlineata)品系弗里维尔(freeville)肌动蛋白mrna，genbank序列id：gb|kj577616.1，核苷酸1-294)克隆至papse10136(seqidno:1)中，以此方式产生具有序列的转录物，所述序列包含由非同源序列的短环分离的对应有义和反义链两者。此rna表示针对β肌动蛋白的294bpdsrnai前体。dsrnai前体dna序列是通过使用引物1174(seqidno:2)和1175(seqidno:3)对来自科罗拉多马铃薯甲虫染色体dna的294bp所关注区域进行pcr扩增而产生，pcr产物是通过用限制性核酸内切酶asisi和pmei消化pcr片段和载体而沿相对于载体编码的t7基因1启动子中的一个的有义方向接合至中间质粒中。循环和反义序列通过用引物1213(seqidno:4)和1203(seqidno:5)进行pcr扩增而产生自有义链dna片段。所得pcr片段和中间质粒用pmei和rsrii进行消化且接合在一起。通过限制消化筛选识别编码通过从t7基因启动子表达的短连接子连接的β-肌动蛋白有义和反义链序列的所需重组质粒。所需质粒papse10216(seqidno:6)转化成化学感受态hte115(de3)细胞且针对安比西林(ampicillin)耐受性转化体选择个别克隆体。
在含有100微克/毫升安比西林的lb琼脂板上选择安比西林耐受性转化体。所选克隆体随后在37℃下在100ml含有安比西林的lb培养基中生长直到培养物达到od6000.8，此时添加异丙基β-d-硫代半乳糖苷直至1mm的最终浓度，以诱导ms2衣壳蛋白和294bpsirna前体的t7聚合酶定向转录。允许诱导培养物在诱导后生长至少4小时以允许足以形成vlp的时间。通过在3,000g下在4c下离心来收集细胞。将每个离心块储存在4℃下直到加工。
通过将每个离心块再悬浮于含有10mmnacl的大致10体积的20mmtris-hcl，ph7.0中而纯化含有294bpsirna前体的vlp且经声波处理以溶解细胞。通过在16,000g下离心来去除细胞碎片。通过添加
再悬浮的vlp用于测试相对于对应裸rnai，衣壳化rnai对科罗拉多马铃薯甲虫幼虫的功效。每个实验和对照群体包括10个经历10次相同处理的单个甲虫。每个处理或对照样品以50μl液滴施用至1cm直径马铃薯叶瓣的表面。每次进行一次施用，使用清洁滴管尖。允许处理剂在叶子表面上干燥，随后呈现给幼虫。在处理前时段期间，从幼虫容器移开食物且使幼虫饥饿2小时，随后向幼虫引入经处理的叶子。在饥饿时段之后，将一只幼虫置于皮氏培养皿中的每个经处理的马铃薯叶上，在培养皿中，允许幼虫以叶瓣为食，直到树叶组织被完全吞食。允许幼虫每两天在三个独立时间以经处理的马铃薯叶为食，在其间给予马铃薯叶的正常饮食且每天监测死亡率，直至处理后21天。在最后一次处理之后，将活幼虫再维持于未处理的马铃薯叶上21天。
表1概述用以裸rna形式投予或在产生自papse10216的arc中衣壳化的测试rnai处理科罗拉多马铃薯甲虫幼虫的结果。另外，含有与科罗拉多马铃薯甲虫β-肌动蛋白不具有显著同源性的随机大肠杆菌源性rna的vlp包括为一般非特异性vlp毒性的对照。这些结果指示这些vlp衣壳化rna在通过抑制必需肌动蛋白基因的表达而杀死科罗拉多马铃薯甲虫幼虫中与非衣壳化rnai一样有效：
表i.用rna和vlp调配物处理的科罗拉多马铃薯甲虫(potatobeetle/leptinotarsadecemlineata)幼虫的死亡率的概述。
裸dsrna处理的对照展现较高程度的死亡率，与通过此dsrna抑制肌动蛋白基因表达导致食用其的甲虫幼虫死亡的假设一致。用含有无关rna的vlp处理的群体展现极小死亡率或无死亡率，指示vlp对甲虫幼虫本质上无毒性。arc为rnai活性分子提供有效递送平台且高死亡率水平证实用于制造vlp的包装和加工步骤不抑制从此类dsrna观测到的rnai反应的有效性。
在低于0.5μg，例如0.05μg的剂量下的额外实验展示较低剂量下的具有肌动蛋白发夹rna的arc与靶向相同肌动蛋白序列的较高剂量下的裸dsrna具有类似功效。
这些构筑体杀死科罗拉多马铃薯甲虫幼虫的能力证实这些arc是将目标rnai前体引入至昆虫宿主中的有效工具且这些前体可以通过宿主细胞rnai路径恰当地加工以抑制靶基因的基因表达。这些结果直接展示包含sirna前体的arc是总体上防治科罗拉多马铃薯甲虫和鞘翅目昆虫的有效递送系统。
实例2
通过含有单链反义rna的vlp防治科罗拉多马铃薯甲虫幼虫的功效
为了测试反义rna(ssrnai)是否可以通过使用vlp有效地递送至目标昆虫，由引物1176(seqidno:7)和1177(seqidno:8)构筑对应于科罗拉多马铃薯甲虫的β肌动蛋白基因的一部分的294bpdna序列片段(马铃薯甲虫品系弗里维尔肌动蛋白mrna，genbank序列id：gb|kj577616.1，核苷酸1-294)。引物是从idt(integrateddnatechnologies,inc.,coralville,iowa)订购且用于在添加β肌动蛋白序列片段的asisi限制位点5'和β肌动蛋白序列片段的pmei限制位点3'时通过accuprimepcr来扩增来自科罗拉多马铃薯甲虫基因组dna的β肌动蛋白序列片段。所得pcr产品经asisi和pmei限制性核酸内切酶消化且随后沿相对于上游t7启动子的反义定向接合至先前用asisi和pmei处理的papse10136(seqidno:1)中，以形成papse10190(seqidno:9)。此质粒允许β-肌动蛋白反义链rna(ssrnai)通过将噬菌体pac位点并入至转录物中而高效地包装于vlp中。化学感受态hte115(de3)细胞经转化且通过发酵产生vlp且随后如实例2中所述地分离。接着如实例2中所述地测试vlp抑制科罗拉多马铃薯甲虫幼虫的能力。表2概述结果：
表2.用单链反义rna和vlp调配物处理的科罗拉多马铃薯甲虫(potatobeetle/leptinotarsadecemlineata)幼虫的死亡率的概述。
这些数据指示vlp改进意在抑制必需β-肌动蛋白基因的表达的单链反义rna在杀死科罗拉多马铃薯甲虫幼虫中的功效。另外，这些结果指示这些vlp在通过抑制必需肌动蛋白基因的表达而杀死科罗拉多马铃薯甲虫幼虫中比对应非衣壳化rnai甚至更有效。这些结果表明包含反义ssrna的arc也充当用于防治一般来说的鞘翅目昆虫，且确切地说科罗拉多马铃薯甲虫的有效递送系统。