针对IL-17A、IL-17F和其他促炎性分子的三特异性抗体的制作方法
免疫系统的主要功能是保护身体免受感染，诸如细菌或病毒，以及免于癌症病变。免疫应答包括炎症，即全身地或在身体的特定部位中免疫细胞的积累。免疫系统的细胞包括几种类型的骨髓和淋巴样细胞，诸如单核白细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、t细胞、b细胞和嗜中性粒细胞。响应于感染或外来物质，免疫细胞分泌称为细胞因子的信号蛋白，其反过来调节免疫细胞的增殖、发育、分化和/或迁移。在某些情况下，免疫应答可导致病理过程，诸如自体免疫疾病(参见例如,abbas等(eds.)(2000)cellularandmolecularimmunology,w.b.saundersco.,philadelphia,pa.；oppenheim和feldmann(eds.)(2001)cytokinereference,academicpress,sandiego,calif.；vonandrian和mackay,newengljmed343:1020-1034(2000)；davidson和diamond,newengljmed345:340-350(2001))。
cd4+т细胞在免疫应答中发挥核心作用，帮助适应性或先天免疫系统的其他细胞。早期研究确定了两类cd4+т细胞(th1和th2)。最近，已经确定了新的cd4+t细胞的亚群：th17细胞。th17细胞已成为适应性免疫系统的分支，专门用于加强保护宿主抵御细胞外细菌以及th1和th2细胞不提供保护的一些真菌和细菌。
已经在发现新的细胞因子家族，il-17家族，的背景下确定了th17细胞，il-17家族目前由六个成员组成(il-17a-f)。il-17(以前称为ctla-8)基本上由th17细胞表达，并且已被指定为作为il-17细胞因子家族中的原始分子的il-17a。il-17家族成员的序列与其他目前已知的哺乳动物蛋白质不具有同源性；因此，il-17家族构成了独立的细胞因子家族。基于il-17f的晶体结构建立的il-17家族成员的结构特征与许多细胞因子相似；尽管结构分析暗示还可能存在异二聚体，但每个家族成员可能作为同型二聚体产生。最近，已经发现由活化的cd4+t细胞表达的异二聚体il-17a和il-17f通过il-17r/il-17rc的复合体传递信号(wrightj.f.等,jimmunol181:2799-2805(2001))。
编码人il-17f的基因位于编码人il-17a的基因附近(hymowitz等,emboj20(19):5332-41(2001))。il-17a和il-17f具有44％的氨基酸序列同一性，而il-17家族的其他成员具有较低的序列同一性(15-27％)。这表明il-17a和il-17f形成il-17家族的特殊亚组(starnes等,jimmunol167(8):4137-40(2001)；aggarwal和gurney,j.leukocbiol71(1):1-8(2002))。已经发现il-17f的生物作用类似于il-17a的生物作用，例如，在多种细胞中刺激il-6、il-8和g-csf产生的能力。与il-17a一样，il-17f能够诱导软骨基质的分泌并且抑制新软骨基质的合成(参见美国2002/0177188)。因此，与il-17a一样，il-17f可能有助于炎性疾病的病理。最近，作者观察到il-17a和il-17f两者均在暴露于白细胞介素23(il-23)的t细胞中被诱导(aggarwal等,jbiolchem278(3):1910-4(2003))。观察到il-17a和il-17f具有相似的染色体定位和显着的序列相似性，以及il-17a和il-17f在响应特异性刺激的相同细胞群体中被诱导的事实导致鉴定出新的人细胞因子，其包含il-17a和il-17f的共价异二聚体。
此外，il-17a与肿瘤坏死因子α(tnfα)和白细胞介素1β(il-1β)协同作用以实现显着的促炎性状态。为了治疗各种炎症、免疫和增殖性病症，包括类风湿性关节炎(ra)、骨关节炎、类风湿性关节炎骨质疏松症，炎性纤维化(例如硬皮病，肺纤维化和硬化)、牙龈炎、牙周变性或牙周疾病、炎性肠疾病(例如，克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和炎性肠疾病)、哮喘(包括过敏性哮喘)、过敏症、慢性阻塞性肺疾病(copd)、多发性硬化症、银屑病、癌症等等，建议用抗体或抗原结合的抗体片段(这些分子的拮抗剂)降低il-17a的活性(参见，例如，美国2003/0166862、wo2005/108616、wo2005/051422和wo2006/013107)。
已知tnfα拮抗剂通过减少炎症并且抑制软骨和骨破坏的进展来治疗关节炎(vandenberg,arthritisres3:18-26(2001))。然而，相当大比例的患者对含有tnfα拮抗剂的药物具有不充分应答。临床前研究表明，tnfα和il-17a在关节炎的病理生理学中表现出相同的特性。虽然单独的tnfα和il-17a对炎症基因的表达具有可忽略的影响，但它们的组合导致强烈的协同应答。tnfα和il-17a的相互作用增加细胞因子(legrand等，arthritisrheum44：2078-2083(2001))和促炎性趋化因子(chabaud等，j.immunol167：6015-6020(2001))的表达，并且还诱导软骨和骨破坏(vanbczooijen等，annrheumpis61：870-876(2002))。
目前，存在许多il-17a双特异性抗体和其他促炎性分子，例如dvd(abbott)和cova322(covagen-janssen)。
国际专利公开号wo2015/014979描述了il-17a和tnfα四价双特异性抗体，其含有针对il-17a的两个结合位点和针对tnfα的两个结合位点。这些抗体在抑制类风湿性关节炎中炎症和组织破坏方面表现出协同效应。
国际专利申请wo2014/137961描述了包括两种多肽的il-17a和tnfα双特异性抗体。这些双特异性抗体是热稳定性和化学稳定性的，表现出低聚集能力，并且可以同时与il-17a和tnfα结合。
美国专利号8,496,936描述了il-17a、il-17f和il-23p19三特异性抗体，其在细胞测定和体内动物模型中表现出针对各种配体的不同活性，但未显示产生稳定的制剂候选物的任何必需的物理-化学特性。
在炎性反应和自体免疫疾病的情况下，能够有效中和il-17a、il-17f和tnfα活性的抗体的产生，尤其是在制剂中保持稳定的抗体，仍然是有意义的。
技术实现要素：
本发明提供了针对il-17a、il-17f和促炎性分子，诸如tnfα的三特异性结合分子。此类抗体可用于治疗自体免疫和/或炎性疾患，诸如类风湿性关节炎、银屑病和银屑病性关节炎。与目前对于这样的疾患的可获得的治疗(包括抗体治疗)相比，预期本发明的三特异性结合分子可单独或与其他抗炎剂和/或免疫抑制疗法组合提供优异的临床反应。
在一个方面，本发明提供三特异性结合分子，其包括结合人il-17a和人il-17-f的第一结合结构域和结合人促炎性分子的第二结合结构域。在某些实施方式中，人促炎性分子是人tnfα。在特定实施方式中，结合分子是抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方式中，第一结合结构域包括seqidno：3的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一结合结构域包括seqidno：1-3的氨基酸序列。在一些实施方式中，第一结合结构域与包括seqidno：4的氨基酸序列的结合结构域竞争结合或结合与包括seqidno：4的氨基酸序列的结合结构域相同的表位。在一些实施方式中，第一结合结构域在序列上具有与seqidno：4的氨基酸序列至少90％的同一性。在某些实施方式中，第一结合结构域包括seqidno：4的氨基酸序列。在特定实施方式中，第一结合结构域由seqidno：4的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，第一结合结构域是人源化的。在某些实施方式中，第一结合结构域是人源化vhh。
在一些实施方式中，第二结合结构域与包括以下的结合结构域竞争结合或结合与包括以下的结合结构域相同的表位，包括：
·包括seqidno：10-12的氨基酸序列的重链和包括seqidno：13-15的氨基酸序列的轻链；
·包括seqidno：8的氨基酸序列的重链可变结构域和包括seqidno：9的氨基酸序列的轻链可变结构域；或
·包括seqidno：5的氨基酸序列的重链和包括seqidno：6的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方式中，第二结合结构域包括含有seqidno：12的氨基酸序列的重链，和含有seqidno：15的氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，第二结合结构域包括含有seqidno：10-12的氨基酸序列的重链和含有seqidno：13-15的氨基酸序列的轻链。在一些实施方式中，第二结合结构域包括在序列上具有与seqidno：8的氨基酸序列至少90％的同一性的重链可变结构域，具有与seqidno：9的氨基酸序列至少90％的同一性的可变结构域，或两者。在一些实施方式中，第二结合结构域包括含有seqidno：8的氨基酸序列的重链可变结构域，含有seqidno：9的氨基酸序列的轻链可变结构域，或两者。在特定实施方式中，第二结合结构域包括由seqidno：8的氨基酸序列组成的重链可变结构域和由seqidno：9的氨基酸序列组成的轻链可变结构域。
在一些实施方式中，第二结合结构域是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、fv、fab、f(ab’)2、fd、单链fv分子(scfv)、双抗体或单结构域抗体(dab)。在一些实施方式中，第二结合结构域是人源化fab。
在一些实施方式中，第二结合结构域包括在序列上具有与seqidno：5的氨基酸序列至少90％的同一性的重链，在序列上具有与seqidno：6的氨基酸序列至少90％的同一性的轻链，或两者。在一些实施方式中，第二结合结构域包括含有seqidno：5的氨基酸序列的重链，含有seqidno：6的氨基酸序列的轻链，或两者。在特定实施方式中，第二结合结构域包括由seqidno：5的氨基酸序列组成的重链和由seqidno：6的氨基酸序列组成的轻链。
在一种实施方式中，本发明提供三特异性结合分子，其包括本文所述的任何第一结合结构域与本文所述的任何第二结合结构域的组合。
在一种实施方式中，本发明提供三特异性结合分子，其包括结合人il-17a和人il-17f的第一结合结构域和结合人tnfα的第二结合结构域，其中所述第一结合结构域包括seqidno：4的氨基酸序列并且所述第二结合结构域包括含有seqidno：5的氨基酸序列的重链，和含有seqidno：6的氨基酸序列的轻链。
在一种实施方式中，本发明提供三特异性结合分子，包括结合人il-17a和人il-17f的第一结合结构域和结合人tnfα的第二结合结构域，其中所述第一结合结构域包括seqidno：4的氨基酸序列并且所述第二结合结构域包括含有seqidno：8的氨基酸序列的重链，和含有seqidno：9的氨基酸序列的轻链。
在一种实施方式中，本发明提供结合人il-17a、人il-17f和人tnfα的三特异性结合分子，其中所述结合分子包括seqidno：5和7的氨基酸序列。
在一些实施方式中，第一结合结构域和第二结合结构域通过大于五个氨基酸的肽接头连接。在某些实施方式中，肽接头的氨基酸残基选自g、a、s、p、e、t、d和k。在特定实施方式中，肽接头包括seqidno：16的氨基酸序列。第一结合结构域可以经由肽接头与第二结合结构域的重链或轻链的n-末端或c-末端连接。
在一些实施方式中，结合分子是同种型igg的抗体或其抗原结合部分。抗体可以具有例如同种型亚型igg1。
在一些实施方式中，结合分子包括具有至少一个突变的fc区域，与没有突变的相同的结合分子相比，其降低adcc和/或cdc。
在一些实施方式中，结合分子具有以下性质中的至少一种：
·对il-17a的kd为10-11m或更低；
·对il-17f的kd为10-7m或更低；
·对tnfα的kd为10-11m或更低；
·在ht1080细胞中的il-6测定中，在低于200ng/ml的浓度下，抑制il-17a和/或il-17a/tnfα的活性至少50％(例如，60％、70％、80％或90％)；
·抑制il-17a依赖的ht080细胞的il-6释放；
·抑制ht1080细胞中il-6的产生；
·在wehi-13var细胞中，在低于100ng/ml的浓度下，抑制tnfα依赖的细胞毒性至少50％(例如，60％、70％、80％或90％)；
·不与兔、小鼠或豚鼠tnfα结合；
·同时与il-17a和tnfα结合；
·与猕猴il-17a和tnfα结合；
·在人血清中，在37℃下温育至少三、四、五、六或七天(例如，在温育七天后)后保持稳定；
·在体内具有超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天(例如，12天)的半衰期；
·在体内关节炎模型中具有抗炎性作用；并且
·在体内抑制il-17和tnfα的活性。
在一个方面，本发明提供药物组合物，其包括本文所述的任何三特异性结合分子和药学上可接受的赋形剂。
在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其包括编码本文所述的任何三特异性结合分子的第一结合结构域的核苷酸序列。
本发明还提供了分离的核酸分子，其包括编码本文所述的任何三特异性结合分子的第二结合结构域的重链、轻链或两者的核苷酸序列。
在一些方面，本发明提供了分离的核酸分子，包括：
·编码本文所述的任何三特异性结合分子的第一结合结构域的核苷酸序列；
·编码本文所述的任何三特异性结合分子的第二结合结构域的重链的核苷酸序列；
·编码本文所述的任何三特异性结合分子的第一结合结构域的核苷酸序列；或
·以上的任何组合。
在一些实施方式中，分离的核酸分子包括编码本文所述的任何三特异性结合分子的第一结合结构域的核苷酸序列和编码本文所述的任何三特异性结合分子的第二结合结构域的轻链的核苷酸序列，任选地还包括编码肽接头的核苷酸序列。分离的核酸分子可包括，例如，编码seqidno：4的核苷酸序列和编码seqidno：6的核苷酸序列，任选还包括编码肽接头的核苷酸序列。在一种实施方式中，肽接头的氨基酸序列是seqidno：16。在一种实施方式中，分离的核酸分子编码seqidno：7。
在一些实施方式中，分离的核酸分子编码seqidno：1-15中任一个的氨基酸序列。
本发明还提供了包括任何上述分离的核酸分子的载体，其中所述载体还包括表达控制序列。
本发明还提供了宿主细胞，包括：
·编码本文所述的任何三特异性结合分子的第一结合结构域的核苷酸序列；
·编码本文所述的任何三特异性结合分子的第二结合结构域的重链的核苷酸序列；和
·编码本文所述的任何三特异性结合分子的第一结合结构域的核苷酸序列。
在特定实施方式中，宿主细胞包括编码seqidno：5的核苷酸序列和编码seqidno：7的核苷酸序列。
在一个方面，本发明提供了用于产生本文所述的任何三特异性结合分子的方法，包括提供如上所述的宿主细胞，在适于结合分子表达的条件下培养所述宿主细胞，并且分离得到的结合分子。
在一个方面，本发明提供了用于治疗有需要的患者的方法，包括向患者给药本文所述的任何三特异性结合分子或药物组合物。在一些实施方式中，患者患有由il-17a、il-17f或tnfα介导的疾患。在特定实施方式中，本发明提供了用于治疗患者的类风湿性关节炎、银屑病或银屑病性关节炎的方法，包括向患者给药本文所述的任何三特异性结合分子或药物组合物。在一些实施方式中，该方法还包括给药抗炎剂或免疫抑制剂。在任何以上治疗方法中，患者可以是人。
附图的简要说明
图1示出了三特异性抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα抗体的产生的概要。
图2显示了il-17a-his6-flag的蛋白质序列。
图3是示出纯化的il-17a-his6-flag蛋白质的凝胶。
图4是示出纯化的对照抗il-17a抗体的凝胶。
图5是示出通过大羊驼(lamaglama)的免疫产生的抗人il-17a抗体滴度的图。
图6是示出用于抗体fab片段噬菌体展示的ph5质粒的图谱。
图7是示出用于在大肠杆菌(e.coli)中分泌表达抗体fab片段的pll-fab质粒的图谱。
图8是示出在从免疫噬菌体文库中选择抗il17-a片段后多克隆噬菌体与特异性和非特异性抗原结合的图。
图9示出了对人il-17a和il-17f特异性的高亲和力vhh结构域(vhh17；seqidno：4)及其亲本/源vhh结构域(vhh；seqidno：17)的氨基酸序列。在人源化过程期间被取代的氨基酸以粗体显示。cdr以灰色突出显示。图9还示出了抗人tnfα抗体的重链和轻链可变结构域氨基酸序列(分别为seqidno：18和9)(ru2303604)。
图10示出了用作抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα三特异性抗体的一部分的抗tnfα抗体变体的cdr中的突变的表(从上到下，seqidno：19-32)。
图11示出了不同的抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα三特异性抗体变体的瞬时发展的结果。
图12示出了使用wehi-13var细胞的细胞毒性tnfα依赖的测定中不同的抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα三特异性抗体变体的抗tnfα活性的比较分析。具有最大抑制活性的变体以灰色标记。
图13示出了使用wehi-13var细胞的细胞毒性tnfα依赖的测定中的三种抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα三特异性抗体变体(mab12，mab31和mab32)的抗tnfα活性的图。
图14示出了使用wehi-13var细胞的tnfα依赖的细胞毒性测定中的对于抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα三特异性抗体bcd-121和两种商业单特异性抗tnfα抗体阿达木单抗和英夫利昔单抗的抗tnfα活性的图。
图15是示出与阳性对照(单特异性抗il-17a抗体bcd-085)和阴性对照(抗tnfα抗体阿达木单抗)相比的bcd-121阻断ht1080细胞中il-17a依赖的il-6产生的功能的能力的图。
图16是示出与阳性对照(单特异性抗il-17a抗体bcd-085)和阴性对照(再生抗tnfα抗体阿达木单抗)相比的bcd-121阻断ht1080细胞中双重il-17a/tnfα依赖的il-6产生的能力的图。
图17是示出与基于jurkat-tmtnfαc1.8细胞培养的三种商业单特异性抗tnfα抗体(阿达木单抗、英夫利昔单抗和塞妥珠单抗)相比的来自抗体bcd-121的抗体依赖的细胞的细胞毒性(adcc)的图。
图18是示出与基于jurkat-tmtnfαc1.8细胞培养的三种商业单特异性抗tnfα抗体(阿达木单抗、英夫利昔单抗和塞妥珠单抗)相比的来自抗体bcd-121的补体依赖的细胞毒性(cdc)的图。
图19是使用octetred96的将bcd-121与il-17a和人tnfα两者同时“夹心”结合的传感图。
图20是示出对于bcd-121抗体与人il-17家族中不同的配体结合的elisa结果的图。
图21是示出对于bcd-121抗体与不同的直系同源tnfα蛋白质结合的elisa结果的图。
图22是示出使用动态光散射(dls)的bcd-121蛋白质聚集的热稳定性的图。该曲线图显示了对于四种缓冲液的相对于温度的平均粒度(z-平均)。
图23是示出在四种不同缓冲溶液中在使用热应力50℃的长期暴露期间bcd-121的热稳定性的图。
图24示出了根据优化的纯化方案从稳定细胞系生产株的培养基中获得的bcd-121的纯度分析。子图a：还原条件(+β-me)。子图b：非还原条件(-β-me)。泳道2和3：分别施加10和40μg。
图25是通过elisa说明纯人血清中bcd-121稳定性的图。
图26是示出bcd-121在食蟹猕猴(m.fascicularis)胶原诱导的关节炎(cia)模型中的药效动力学性质的图。
图27是示出在以10、50或100mg/kg的剂量单次sc给药后，猴子中elisa测定的bcd-121的药代动力学谱的图。
图28是示出bcd-121可以双重阻断il-17a和tnfα诱导ht1080细胞中il-6产生的能力的图。bcd-121比单特异性抗tnfab1、抗tnffab-peg或抗il17ab(针对il-17的单克隆抗体)更有效地阻断il-6释放，具有20ng/ml的ic50。
图29是示出通过马尔文纳米粒度电位仪(zetasizernanozsp)的振动应力聚集测定(20，以500rpm)的图。数据示出了bcd-121是高度可溶的三特异性分子，其可用在用于皮下注射的高浓度制剂(高于100mg/ml)中。
具体实施方式
定义和一般技术
除非本文另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。以下描述示例性方法和材料，但是与本文描述的那些类似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物和其他参考文献都通过引用以其整体并入。如果发生冲突，以本说明书，包括定义，为准。尽管本文引用了许多文献，但该引用并不构成承认任何这些文献构成本领域公知常识的一部分。
此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学，微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、医疗和药物化学和蛋白质和核酸化学以及杂交相结合使用的术语，和它们的技术是那些本领域熟知并且常用的。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常实现的或如本文所述。
贯穿本说明书和实施方式，词语“具有(have)”和“包括(comprise)”或诸如“具有(has)”，“具有(having)”，“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变化将被理解为暗示包含所述整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
抗体相关定义
除非另有说明，如本文所用，“il-17a”，“il-17f”和“tnfα”分别指人il-17a、il-17f和tnfα。
白细胞介素-17(“il-17”)是20-30kd糖基化的同型二聚体蛋白质。il-17a人基因编码155个氨基酸的蛋白质，其具有19个氨基酸的信号序列和136个氨基酸的成熟区段。il-17f人基因编码163个氨基酸的蛋白质，其具有30个氨基酸的信号序列和133个氨基酸的成熟区段。人il-17a多肽序列可在uniprot登录号q16552下获得。人il-17f多肽序列可在uniprot登录号q96pd4下获得。
术语“肿瘤坏死因子α”或“tnfα”，如本文所用，是指具有在pennica等,nature312:721(1984)中或在aggarwal等,jbc260:2345(1985)中所述的多肽序列的人tnfα分子。
术语“免疫应答”，“自体免疫反应”和“自体免疫炎症”是指，例如，淋巴细胞，抗原呈递细胞，吞噬细胞，粒细胞和由以上细胞或肝脏产生的可溶性大分子的作用(包括抗体、细胞因子和补体，它们导致从人身体中选择性损伤、破坏或消除入侵病原体、病原体感染的细胞或组织、癌细胞或在自体免疫或病理性炎症的情况下的正常人细胞或组织)。
术语“结合分子”涵盖抗体和免疫球蛋白。术语“抗体”(ab)或“免疫球蛋白”(ig)，如本文所用，是指通过二硫键相互连接的包括两条重(h)链(约50-70kda)和两条轻(l)链(约25kda)的四聚体。每条重链由重链可变结构域(vh)和重链恒定区域(ch)组成。每条轻链由轻链可变结构域(vl)和轻链恒定区域(cl)组成。该vh和vl结构域可以进一步再分为高度可变性的区域，称为“互补决定区”(cdr)，穿插有更保守的区域，称为“框架区域”(fr)。vh和vl的每个由三个cdr(h-cdr在本文中表示来自重链的cdr；并且l-cdr在本文中表示来自轻链的cdr)和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端排列，以以下顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。对每个区域的氨基酸分配可以依照
在一些实施方式中，如本文所述的抗体或免疫球蛋白除重链和轻链外可包括vhh结构域或“纳米抗体”。这些单结构域是重链抗体(hcab)的抗原结合部位，其缺乏轻链并且通常在骆驼科物种，诸如美洲驼和羊驼中发现。
抗体的术语“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)，如本文所用，是指抗体的一个或多个部分或片段，其保有特异性结合抗原的能力(例如，人il-17a、人il-17f、tnfα或其部分)。已经显示，全长抗体的某些片段可以执行抗体的抗原结合功能。涵盖在术语“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)fab片段：由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段：包括在铰链区域通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)单结构域抗体(dab)片段，其由vh结构域组成；和(vi)能够特异性结合抗原的分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个结构域，vl和vh，由不同的基因编码，但它们可以通过使得它们能够形成为单个蛋白质链的合成接头使用重组方法连接，其中vl和vh区域配对形成单价分子(称为单链fv(scfv))。此外，在本发明中是包括vh和/或vl的抗原结合分子。在vh的情况下，该分子还可以包括ch1、铰链、ch2或ch3区域中的一个或多个。这样的单链抗体也旨在涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。还涵盖其他形式的单链抗体，诸如双抗体。双抗体是二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。
抗体部分，诸如fab和f(ab’)2片段，可以使用常规技术从完整抗体制备，诸如完整抗体的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组dna技术获得，例如，如本文所述。
术语“重组抗体”是指从包括编码抗体的核苷酸序列的细胞或细胞系表达的抗体，其中所述核苷酸序列不天然地与细胞相关。
如本文所用的术语“变体”抗体是指通过相对于亲本抗体序列添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基，而具有与其“亲本”抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体。在优选的实施方式中，变体抗体包括相对于亲本抗体至少一个或多个(例如，从一至约十二，例如，二、三、四、五、六、七、八、或九、十、十一或十二；并且在一些实施方式中，从一至约十)氨基酸添加、缺失和/或取代。在一些实施方式中，氨基酸添加、缺失和/或取代在变体抗体的cdr中。关于变体抗体序列的同一性或同源性在本文中定义为在对准序列并且引入缺口(如果需要的话，以实现最大百分比序列同一性)之后，变体抗体序列中与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分比。变体抗体保有结合与亲本抗体结合的抗原相同的抗原，和优选表位的能力，并且在一些实施方式中，具有优于亲本抗体的相似性质的至少一种性质或生物活性。例如，与亲本抗体相比，变体抗体可具有例如更强的结合亲和力，更长的半衰期，更低的ic50或增强的抑制抗原的生物学活性的能力。本文特别感兴趣的变体抗体是与亲本抗体相比表现出至少约2倍(优选至少约5倍，10倍或20倍)生物学活性增加的抗体。
术语“嵌合抗体”在其最广泛的意义上是指含有来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体，通常部分地具有人来源和部分地具有非人来源的抗体，即部分来源于非人动物，例如小鼠、大鼠或其他啮齿动物，或骆驼科，诸如美洲驼或羊驼。嵌合抗体优于非人抗体，以便降低人抗抗体应答的风险，例如在鼠抗体的情况下的人抗小鼠抗体应答。典型的嵌合抗体的实例是其中可变区域序列是鼠的，而恒定区域序列是人的抗体。在嵌合抗体的情况下，可以对非人部位进行进一步改变以便使抗体人源化。
术语“人源化”是指，在抗体全部或部分来自非人来源，例如用目标抗原对小鼠或美洲驼分别进行免疫而获得的鼠或美洲驼抗体，或基于这样的鼠或美洲驼抗体的嵌合抗体的情况下，可以替换某些氨基酸，特别是在重链和轻链的框架区域和恒定结构域中，以便避免或最小化人的免疫应答。抗体与靶抗原相互作用的特异性主要在于位于重链和轻链的六个cdr中的氨基酸残基中。因此，cdr内的氨基酸序列的各个抗体之间的可变性比cdr之外的序列的各个抗体之间的可变性更高。因为cdr序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以可以表达模拟特异性天然存在的抗体或更一般地具有给定氨基酸序列的任何特异性抗体的性质的重组抗体，例如通过构建表达来自被移植到来自不同抗体的框架序列中的特异性抗体的cdr序列的表达载体。因此，可以使非人抗体“人源化”并且仍然基本上保持原始抗体的结合特异性和亲和力。尽管不可能精确预测特定抗体的免疫原性而由此精确预测人抗抗体应答，但非人抗体倾向于比人抗体更具免疫原性。外源(例如啮齿动物或骆驼科)恒定区域已用人来源的序列取代的嵌合抗体已被证明通常比完全外源来源的抗体具有更低的免疫原性，并且治疗性抗体的趋势是朝向人源化或完全的人抗体。因此，嵌合抗体或非人来源的其他抗体可以人源化以降低人抗抗体应答的风险。
对于嵌合抗体，人源化通常涉及可变区域序列的框架区域的修饰。作为互补决定区(cdr)的一部分的氨基酸残基通常来说将不会出现与人源化相关的改变，尽管在某些情况下其可能需要改变单个cdr氨基酸残基，例如去除糖基化位点、脱酰胺位点，天冬氨酸异构化位点或不需要的半胱氨酸或甲硫氨酸残基。n-连接的糖基化通过将寡糖链附连到三肽序列asn-x-ser或asn-x-thr中的天冬酰胺残基而发生，其中x可以是除pro之外的任何氨基酸。通过将asn或ser/thr残基突变为不同的残基，优选通过保守取代的方式，可以实现n-糖基化位点的去除。取决于诸如ph和表面暴露的因素，可以发生天冬酰胺和谷氨酰胺残基的脱酰胺作用。天冬酰胺残基主要当存在于序列asn-gly中，并且在较小程度上在其他二肽序列诸如asn-ala中时，特别易受脱酰胺作用。因此当这样的脱酰胺作用位点，特别是asn-gly存在于cdr序列中时，其可能需要通常通过保守取代去除该位点以去除其中一个所涉及的残基。
用于抗体序列人源化的许多方法是本领域已知的；参见，例如，thereviewbyalmagro&fransson,frontbiosci.13:1619-1633(2008)。一种常用的方法是cdr移植，例如对于鼠来源的嵌合抗体，其涉及确定鼠可变区域基因的人种系基因对应物以及将鼠cdr序列移植到该框架中。cdr移植可以基于kabatcdr定义，尽管更新的出版物(magdelaine-beuzelin等,critrev.oncolhematol.64:210-225(2007))已经建议
在某些情况下，还可能需要改变一个或多个cdr氨基酸残基以便改善对靶表位的结合亲和力。这被称为“亲和力成熟”并且可任选地与人源化相关进行，例如在抗体的人源化导致结合特异性或亲和力降低，并且不可能单独通过回复突变充分改善结合特异性或亲和力的情况下。各种亲和力成熟方法是本领域已知的，例如burks等,procnatlacadsciusa,94:412–417(1997)描述的体外扫描饱和诱变方法，以及wu等,procnatlacadsciusa95:6037–6042(1998)的逐步体外亲和力成熟方法。
术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”是指蛋白质、多肽或抗体，由于其来源或衍生源，其(1)与在其天然状态中伴随其的天然相关的成分无关，(2)不含来自同一物种的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成的或在与其天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽将从其天然相关成分“分离”。还可以使用本领域熟知的蛋白质纯化技术通过分离使蛋白质基本上不含天然相关成分。
如本文所用，术语“种系”是指抗体基因和基因区段的核苷酸和氨基酸序列，因为它们经由生殖细胞从亲本传递给后代。种系序列区别于成熟的b细胞中编码抗体的核苷酸序列，其在b细胞成熟的过程期间通过重组和超突变事件而已被改变。“利用”特定种系序列的抗体具有一种核苷酸或氨基酸序列，同其与任何其他种系核苷酸或氨基酸序列的比对相比，其具有相对于该种系核苷酸序列或其指定的氨基酸序列更接近的比对。
术语“亲和力”是指抗原和结合分子，例如抗体，之间吸引力的量度。结合分子对抗原的内在吸引力通常表示为特定结合分子-抗原相互作用的结合亲和力平衡常数(kd)。当kd≤1mm，优选≤100nm时，结合分子被视为与抗原特异性结合。kd结合亲和力常数可以，例如，通过表面等离子体共振(biacoretm)或生物层干涉测量法(bio-layerinterferometry)测量，例如使用来自bio-rad的proteontmxpr36spr系统或octettm系统。
术语“koff”是指特定结合分子-抗原相互作用的解离速率常数。koff解离速率常数可以通过生物层干涉测量法(bio-layerinterferometry)测量，例如使用octettm系统。
如本文所用的术语“表位”是指特异性结合结合分子(例如，和抗体或相关分子，诸如双特异性结合分子)的抗原的一部分(决定簇)。表位决定簇通常由分子的化学活性表面分组组成，诸如氨基酸或碳水化合物或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特性，以及特定的电荷特性。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质(例如抗原)和相互作用分子(诸如抗体)之间的所有相互作用点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。在构象表位中，相互作用点发生在蛋白质上的氨基酸残基上，该氨基酸残基在一级氨基酸序列中彼此分开。一旦确定了抗原上的所需表位，就可以使用本领域熟知的技术产生针对该表位的抗体。此外，抗体或其他结合分子的产生和表征可以阐明关于所需表位的信息。根据该信息，然后可以竞争性筛选结合分子用于结合相同或相似的表位，例如通过进行竞争研究以找到竞争结合抗原的结合分子。
可以通过使用本领域已知的方法，确定抗体或其他结合分子是否结合il-17a、il-17f或tnfα的相对于本发明的三特异性结合分子相同的表位或与本发明的三特异性结合分子交叉竞争结合il-17a、il-17f或tnfα。在一种实施方式中，允许本发明的三特异性结合分子在饱和条件下与il-17a、il-17f或tnfα结合，并且然后测量测试抗体结合所述靶抗原的能力。如果测试抗体能够与参考三特异性结合分子同时结合靶抗原，则测试抗体结合不同于参考三特异性结合分子的表位。然而，如果测试抗体不能同时与靶抗原结合，则测试抗体结合与由三特异性结合分子结合的表位相同的表位，与由三特异性结合分子结合的表位重叠的表位或与由三特异性结合分子结合的表位紧密接近的表位。可以使用elisa、ria、biacoretm、生物层干涉测量法(bio-layerinterferometry)或流式细胞术进行该实验。为了测试本发明的三特异性结合分子是否与另一种结合分子交叉竞争，可以在两个方向上使用上述竞争方法，即确定已知的结合分子是否阻断测试结合分子，并且反之亦然。例如，可以使用ibismx96spr仪器或octettm系统进行这种交叉竞争实验。
在一种实施方式中，本发明的结合分子是单克隆抗体。如本文所用，首字母缩略词“mab”是指单克隆抗体，即由单个克隆的细胞群体合成和分泌的抗体。克隆群体可以是永生化细胞的克隆群体。在一些实施方式中，克隆群体中的永生化细胞是杂交细胞——杂交瘤，其通常通过将来自免疫动物的个体b淋巴细胞与来自淋巴细胞肿瘤的个体细胞融合而产生。杂交瘤是工程细胞类型，并且在自然界中不存在。
抗体的类别(同种型)和亚类可以通过本领域已知的任何方法确定。通常，抗体的类别和亚类可以使用对抗体的特定类别和亚类特异性的抗体来确定。此类抗体可商购获得。可通过elisa、蛋白质印迹(westernblot)以及其他技术确定类别和亚类。或者，可以通过以下步骤来确定类别和亚类：测序抗体重链和/或轻链的全部或部分恒定结构域，将它们的氨基酸序列与免疫球蛋白的各种类别和亚类的已知氨基酸序列相比较，并且确定抗体的类别和亚类。
术语“促炎性分子”包括但不限于淋巴因子、单核因子、传统多肽激素、生长激素(诸如人生长激素、n-蛋氨酰人生长激素和牛生长激素)、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素(诸如促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)和促黄体激素(lh))、肝生长因子、纤维母细胞生长因子、催乳激素、胎盘催乳素、因子和肿瘤坏死因子、穆勒氏管抑制物质(mullerianinhibitingsubstance)、促性腺激素相关的小鼠肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整合素、促血小板生成素(tpo)、神经生长因子和血小板源生长因子、转化生长因子(tgf)、胰岛素样生长因子i和ii、促红细胞生成素(epo)、骨诱导因子、干扰素、集落刺激因子(csf)(诸如csf巨噬细胞(m-csf)、csf粒细胞-巨噬细胞(gm-csf)和csf粒细胞(g-csf)的)、白细胞介素(il)(诸如il-1、il-1a、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-15、il-12、il-17a、il-22和il-23)、肿瘤坏死因子和其他多肽因子，诱导白血病抑制因子(lif)和kit配体(kl)。如本文所用，术语“促炎性分子”包括从天然源或从重组细胞培养物中分离的蛋白质和所述蛋白质的生物学活性等同物。
三特异性抗tnfα/抗il-17a/抗il-17f结合分子
本发明提供了针对il-17a、il-17f以及非il-17a或il-17f的促炎性分子(例如tnfα)的三特异性结合分子。在特定实施方式中，三特异性结合分子是三特异性抗体或其抗原结合部分。结合分子包括结合il-17a、il-17f和促炎性分子(例如tnfα)的结构域。在一些实施方式中，结合分子包括结合il-17a和il-17f的第一结合结构域和结合tnfα的第二结合结构域。在一些实施方式中，用于il-17a和il-17f的结合结构域可以是分开的。
在一种实施方式中，本发明的三特异性抗tnfα/抗il-17a/抗il-17f结合分子与vhh竞争结合人il-17a和/或il-17f，或结合所述抗原的相对于vhh相同的表位，该vhh包括：
·seqidno：1-3；或
·seqidno：4。
在一种实施方式中，本发明的三特异性抗tnfα/il-17a/il-17f结合分子与抗体竞争结合人tnfα，或结合所述抗原的相对于该抗体相同的表位，该抗体包括：
·seqidno：10-15；
·seqidno：8和9；或
·seqidno：5号6。
在某些实施方式中，本发明的三特异性抗tnfα/il-17a/il-17f结合分子与vhh竞争结合人il-17a和/或il-17f，或结合所述抗原的相对于该vhh相同的表位，该vhh包括：
·seqidno：1-3；或
·seqidno：4；
并且与抗体竞争结合人tnfα，或结合所述抗原的相对于该抗体相同的表位，该抗体包括：
·seqidno：10-15；
·seqidno：8和9；或
·seqidno：5号6。
在一种实施方式中，三特异性结合分子包括抗il-17a/抗il-17fvhh结构域。在某些实施方式中，抗il-17a/抗il-17fvhh结构域是人源化的。在一些实施方式中，抗il-17a/抗il-17fvhh结构域包括seqidno：1的重链cdr1(h-cdr1)氨基酸序列、seqidno：2的重链cdr2(h-cdr2)氨基酸序列、seqidno：3的重链cdr3(h-cdr3)氨基酸序列，或其任何组合。在一种实施方式中，vhh结构域包括seqidno：1-3的h-cdr1，h-cdr2和h-cdr3氨基酸序列。在一些实施方式中，vhh结构域在序列上具有与seqidno：4至少60％的同一性，例如具有与seqidno：4至少60％、70％或80％的同一性。在一些实施方式中，vhh结构域在序列上具有与seqidno：4至少90％的同一性，例如，具有与seqidno：4至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在特定实施方式中，vhh结构域包括seqidno：4的氨基酸序列或由seqidno：4的氨基酸序列组成。
在一种实施方式中，三特异性结合分子包括抗人tnfα抗体或其抗原结合部分。在某些实施方式中，抗人tnf-α抗体是人源化抗体或其抗原结合部分(例如，人源化fab)。
在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的重链包括seqidno：10的h-cdr1氨基酸序列、seqidno：11的h-cdr2氨基酸序列、seqidno：12的h-cdr3氨基酸序列，或其任何组合。在一种实施方式中，抗人tnfα抗体的重链包括seqidno：10-12的h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3氨基酸序列。在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的重链具有重链可变结构域(vh)，其在序列上具有与seqidno：8至少60％的同一性，例如，具有与seqidno：8至少60％、70％或80％的同一性。在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的重链具有重链可变结构域(vh)，其在序列上具有与seqidno：8至少90％的同一性，例如，具有与seqidno：8至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％的同一性。在特定实施方式中，vh包括seqidno：8的氨基酸序列或由seqidno：8的氨基酸序列组成。vh可以与同种型igg、igm、ige、iga或igd分子的重链恒定结构域(ch)连接。在某些实施方式中，ch属于同种型igg，例如同种型亚型igg1、igg2a或b，igg3或igg4。在特定实施方式中，ch属于同种型亚型igg1。
在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的重链(hc)在序列上具有与seqidno：5至少60％的同一性，例如，具有与seqidno：5至少60％、70％或80％的同一性。在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的重链(hc)在序列上具有与seqidno：5至少90％的同一性，例如，具有与seqidno：5至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在特定实施方式中，hc包括seqidno：5的氨基酸序列或由seqidno：5的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的轻链包括seqidno：13的轻链cdr1(l-cdr1)氨基酸序列、seqidno：14的轻链cdr2(l-cdr2)氨基酸序列、seqidno：15的轻链cdr3(l-cdr3)氨基酸序列，或其任何组合。在一种实施方式中，抗人tnfα抗体的轻链包括seqidno：13-15的l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3氨基酸序列。在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的轻链具有轻链可变结构域(vl)，其在序列上具有与seqidno：9至少60％的同一性，例如，具有与seqidno：9至少60％、70％或80％的同一性。在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的轻链具有轻链可变结构域(vl)，其在序列上具有与seqidno：9至少90％的同一性，例如，具有与seqidno：9至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在特定实施方式中，vl包括seqidno：9的氨基酸序列或由seqidno：9的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的轻链(lc)在序列上具有与seqidno：6至少60％的同一性，例如，具有与seqidno：6至少60％、70％或80％的同一性。在一些实施方式中，抗人tnfα抗体的轻链(lc)在序列上具有与seqidno：6至少90％的同一性，例如，具有与seqidno：6至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在特定实施方式中，vl包括seqidno：6的氨基酸序列或由seqidno：6的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，本发明的三特异性结合分子包括直接或经由接头连接至抗tnfα结合结构域(例如，抗体或其抗原结合部分)的重链或轻链的抗il-17a/抗il-17f结合结构域(例如，vhh结构域)。在一种实施方式中，结合分子包括经由接头连接至抗tnfα抗体的轻链的抗il-17a/抗il-17fvhh结构域以形成融合分子。在一些实施方式中，该接头在序列上具有与seqidno：16至少60％的同一性，例如具有与seqidno：16至少60％、70％或80％的同一性。在一些实施方式中，该接头在序列上具有与seqidno：16至少90％的同一性，例如，具有与seqidno：16至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在特定实施方式中，该接头包括seqidno：16的氨基酸序列或由seqidno：16的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，融合分子在序列上具有与seqidno：7至少60％的同一性，例如具有与seqidno：7至少60％、70％或80％的同一性。在一些实施方式中，融合分子在序列上具有与seqidno：7至少90％的同一性，例如，具有与seqidno：7至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在特定实施方式中，融合分子包括seqidno：7的氨基酸序列或由seqidno：7的氨基酸序列组成。
在一些实施方式中，三特异性结合分子包括抗tnfα结合结构域，其包括任何一种上述重链和任何一种上述轻链，或其抗原结合部分。在某些实施方式中，三特异性结合分子还包括任何一种上述抗il-17a/抗il-17f结合结构域。在特定实施方式中，三特异性结合分子包括与任何上述抗tnfα结合结构域重链相组合的任何一种上述融合分子。
通过本文描述的方法获得的三特异性结合分子的类别可以用另一类别或亚类转换。在本发明的一个方面，使用本领域熟知的方法分离编码vl或vh的核酸分子，使得其不包括编码cl或ch的核酸序列。然后，编码vl或vh的核酸分子可操作地连接编码分别来自不同类别的免疫球蛋白分子的cl或ch的核酸序列。这可以使用包括cl或ch链的载体或核酸分子来实现，如以上所述。例如，最初为igm的结合分子可以是转换为igg的类别。此外，类别转换可用于将一个igg亚类转变成另一个，例如，从igg1到igg2。用于产生具有所需同种型的本发明的结合分子的示例性方法包括以下步骤：分离编码结合分子重链的核酸分子和编码结合分子轻链的核酸分子，获得重链的可变结构域，将重链的可变结构域与所需同种型的重链的恒定结构域连接，在细胞中表达轻链和连接的重链，并且收集具有所需同种型的结合分子。
本发明的三特异性结合分子可以是igg、igm、ige、iga或igd分子，但通常属于igg同种型，例如igg亚类igg1、igg2a或b、igg3或igg4。在一种实施方式中，结合分子是igg亚类igg1的抗体。
在一种实施方式中，三特异性结合分子包括具有至少一个突变的fc区域。已知许多不同的fc突变，其中这些突变提供改变的效应子功能。例如，在许多情况下，将希望减少或消除效应子功能，例如，其中配体/受体相互作用是不希望的，或者在抗体-药物偶联物的情况下。可有利于突变以便降低效应子功能的fc区域氨基酸位置包括位置228、233、234和235中的一个或多个，其中氨基酸位置根据kabat编号方案编号。在一些实施方式中，三特异性结合分子包括具有一个或多个突变的fc区，与没有突变的相同的结合分子相比，其降低adcc或cdc。
在某些实施方式中，本发明的三特异性结合分子可以是较大免疫粘附分子的一部分，较大免疫粘附分子通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价连接形成。此类免疫粘附分子的实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区域以制备四聚体scfv分子(kipriyanov等,humanantibodiesandhybridomas6:93-101(1995))和使用半胱氨酸残基、标志物多肽和c-末端多组氨酸标签以制备二价和生物素化的scfv分子(kipriyanov等,mol.immunol.31:1047-1058(1994))。其他实例包括，其中来自抗体的一个或多个cdr共价或非共价地掺入分子中以使其成为特异性结合目标抗原的免疫粘附素。在此类实施方式中，cdr可以作为较大多肽链的一部分掺入，可以与另一条多肽链共价连接，或者可以非共价地掺入。
在另一实施方式中，可以制备融合抗体或免疫粘附素，其包括与另一种多肽连接的本发明的三特异性结合分子的全部或部分。在某些实施方式中，仅三特异性结合分子的可变结构域与多肽连接。在某些实施方式中，三特异性结合分子的vh结构域与第一多肽连接，而该三特异性结合分子的vl结构域与第二多肽连接，第二多肽以使得vh和vl结构域可彼此相互作用以形成抗原结合位点的方式与该第一多肽结合。在另一优选实施方式中，vh结构域通过接头与vl结构域分开，使得vh和vl结构域可以彼此相互作用(例如，单链抗体)。然后将vh-接头-vl抗体与目标多肽连接。另外，可以生成融合抗体，其中两种(或更多)单链抗体彼此连接。如果想要在单个多肽链上生成二价或多价抗体，或者如果想要生成多特异性抗体，则这是有用的。
为了生成单链抗体(scfv)，编码vh和vl的dna片段与编码柔性接头的另一片段可操作地连接，例如，编码氨基酸序列(gly4-ser)3，使得vh和vl序列可以表达为连续的单链蛋白质，其中vl和vh结构域通过柔性接头连接。参见，例如，bird等,science242:423-426(1988)；huston等,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988)；和mccafferty等,nature348:552-554(1990)。该单链抗体可以是单价的，如果仅使用单个vh和vl；二价的，如果使用两个vh和vl；或者多价的，如果使用多于两个vh和vl。
在其他实施方式中，可以使用编码三特异性结合分子的核酸分子制备其他修饰的抗体。例如，“κ抗体”(ill等,proteineng.10:949-57(1997))，“微抗体”(martin等,emboj.13:5303-9(1994))，“双抗体”(holliger等,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993))，或“janusins”(traunecker等,emboj.10:3655-3659(1991)和traunecker等,int.j.cancer(suppl.)7:51-52(1992))可以按照说明书的教导使用标准分子生物学技术制备。
本发明的三特异性结合分子可以衍生化或与另一分子(例如另一种肽或蛋白质)连接。通常，结合分子(例如，抗体或其抗原结合部分)被衍生化，使得il-17a、il-17f和/或tnfα结合不受衍生化或标记的不利影响。因此，本发明的结合分子可包括本文所述的三特异性结合分子的完整和修饰形式两者。例如，本发明的结合分子可以与一种或多种其他分子实体，诸如另一种抗体、检测剂、药物剂和/或可以介导结合分子与另一分子(诸如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽功能性连接(通过化学偶联，遗传融合，非共价缔合或其他方式)。
一种类型的衍生化结合分子通过交联两种或多种抗体(相同类型或不同类型的抗体，例如生成双特异性抗体)而产生。合适的交联剂包括异双官能的交联剂，具有由适当的间隔基分开的两个不同反应性的基团(例如，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能团的(例如，双琥珀酰亚胺辛二酸酯)。这种接头可从piercechemicalcompany,rockford,il获得。
本发明的三特异性结合分子也可以用化学基团衍生化，诸如聚乙二醇(peg)，甲基或乙基基团或碳水化合物基团。这些基团可用于改善结合分子的生物学特性例如，增加血清半衰期。
也可以标记根据本发明的三特异性结合分子。如本文所用，术语“标记(label)”或“标记(labeled)”是指在结合分子中掺入另一分子。在一种实施方式中，标记是可检测的标记物，例如，掺入放射性标记的氨基酸或附连到生物素基部分的多肽，其可以通过标记的抗生物素蛋白检测(例如，含有荧光标记物的链霉抗生物素蛋白或可以通过光学或比色法检测的酶活性)。在另一实施方式中，标记或标记物可以是治疗性的，例如药物缀合物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标记的实例包括,但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3h、14c、15n、35s、90y、99tc、111in、125i、131i)、荧光标记(例如，fitc、罗丹明、镧系元素荧光粉)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记物、生物素基基团、由二级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、磁性剂，诸如钆螯合物、毒素诸如百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素b，短杆菌肽d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d，1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。在一些实施方式中，标记通过各种长度的间隔基臂附连以减少潜在的空间位阻。
在某些实施方式中，本发明的三特异性结合分子可以以中性形式(包括两性离子形式)或作为带正电或带负电的物种存在。在一些实施方式中，抗体可与平衡离子复合以形成药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐”是指包括一种或多种三特异性结合分子和一种或多种平衡离子的复合物，其中平衡离子衍生自药学上可接受的无机和有机酸和碱。
药学上可接受的无机碱包括金属离子，包括但不限于合适的碱金属盐、碱土金属盐和其他生理学上可接受的金属离子。衍生自无机碱的盐包括铝、铵、钙、钴、镍、钼、钒、锰、铬、硒、锡、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰或亚锰盐、钾、铷、钠和锌，例如，以其通常的化合价。
本发明的三特异性结合分子的药学上可接受的酸加成盐可以由以下酸制备，包括但不限于，甲酸、乙酸、乙酰氨基苯甲酸、己二酸、抗坏血酸、硼酸、丙酸、苯甲酸、樟脑酸、碳酸、环拉酸、脱氢胆酸、丙二酸、依地酸、乙基硫酸、芬地柞酸、偏磷酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、鞣酸、柠檬酸、硝酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、叶酸、富马酸、丙酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、赖氨酸、异柠檬酸、三氟乙酸、双羟萘酸、丙酸、氨茴酸、甲磺酸、乳清酸、草酸、草乙酸、油酸、硬脂酸、水杨酸、氨基水杨酸、硅酸盐、p-羟基苯甲酸、烟碱、苯乙酸、扁桃酸、亚甲基双羟萘酸、磺酸、甲磺酸、磷酸、膦酸、乙磺酸、乙二磺酸、铵、苯磺酸、泛酸、萘磺酸、甲苯磺酸、2-羟基乙磺酸、磺胺酸、硫酸、硝酸、亚硝酸、硫酸单甲基酯、环己基氨基磺酸、β-羟基丁酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、谷氨酸、甲次砷酸盐、二氨基己酸、樟脑磺酸、葡萄糖酸、硫氰酸、氧代戊二酸、吡哆醛5-磷酸盐、氯苯氧乙酸、十一烷酸、n-乙酰基-l-天冬氨酸、粘酸和半乳糖醛酸。
药学上可接受的有机碱包括三甲胺、二乙胺、n,n'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二苄胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(n-甲基葡糖胺)、普鲁卡因、环胺、季铵阳离子、精氨酸、甜菜碱、咖啡因、克立咪唑、2-乙基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙二胺、丁胺、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、乙基葡糖胺、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、海巴明、咪唑、异丙胺、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、吡啶、吡哆醇、钕、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三丙胺、三乙醇胺、氨丁三醇、甲胺、牛磺酸、胆酸酯/盐、6-氨基-2-甲基-2-庚醇、2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、芳香酸、脂肪族和芳香族磺酸、锶、三甲基甘氨酸、肼、苯基环己胺、2-(n-吗啉代)乙磺酸、双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷、n-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸、1,4-哌嗪二乙磺酸、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸、1,3-双[三(羟甲基)甲氨基]丙烷、4-吗啉丙磺酸、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸、2-[(2-羟基-1,1-双(羟甲基)乙基)氨基]乙磺酸、n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、4-(n-吗啉代)丁磺酸、3-(n,n-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸、2-羟基-3-[三(羟甲基)甲氨基]-1-丙磺酸、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)、哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸、n,n-双(2-羟乙基)甘氨酸、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(4-丁磺酸)、n-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸、n-三(羟甲基)甲基-4-氨基丁磺酸、n-(1,1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸、2-(环己基氨基)乙磺酸、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸、3-(环己基氨基)-1-丙磺酸、n-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸、4-(环己基氨基)-1-丁磺酸、n-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸、2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇和氨丁三醇。
在一些实施方式中，本公开的双特异性抗体分子包括抗tnfα抗体，其包括两条重链和两条轻链，或其抗原结合部分，和连接(直接或通过接头)到抗体的抗il-17a/抗il-17fvhh。抗il-17a/抗il-17fvhh可以通过其n-末端或c-末端连接至抗tnfα抗体的重链或轻链的n-末端或c-末端。在某些实施方式中，抗il-17a/抗il-17fvhh与抗tnfα抗体的轻链的n-末端连接。本文描述的任何此类融合可根据本领域已知的方法进行。参见，例如，ahmad等,clinicalanddevelopmentalimmunology2012,articleid980250(2012)。在某些实施方式中，抗tnfα抗体通过接头与抗il-17a/抗il-17fvhh连接，更优选通过肽接头，并且最优选通过缺少蛋白水解切割位点的肽接头。在一些实施方式中，接头的氨基酸残基选自g、a、s、p、e、t、d和k。在一些实施方式中，接头包括seqidno：16的氨基酸序列或由seqidno：16的氨基酸序列组成。
核酸分子和载体
本发明还提供了编码本文所述的本发明的三特异性结合分子的核酸分子和序列。在一些实施方式中，不同的核酸分子编码三特异性结合分子的第一结构域和第二结构域氨基酸序列。在第一结构域和/或第二结构域包括重链和轻链的情况下，在一些实施方式中，不同的核酸编码重链和轻链氨基酸序列。在其他实施方式中，相同的核酸分子编码重链和轻链氨基酸序列。在某些实施方式中，核酸分子可以编码第一和第二结构域的氨基酸序列(例如重链和轻链序列)的任何组合。在特定实施方式中，核酸分子可编码第一结合结构域的氨基酸序列和第二结合结构域的轻链氨基酸序列，任选地包括连接两者的任何肽接头序列。
除非另有说明，否则对核苷酸序列的提及包括其补体。因此，对具有特定序列的核酸的提及应理解为包括具有其互补序列的其互补链。如本文提及的术语“多核苷酸”是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式，该核苷酸或为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链的形式。
本发明还提供了具有与一种或多种上述核苷酸序列或与编码选自由seqidno：1-16组成的组的氨基酸序列的核苷酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性的核苷酸序列。在某些实施方式中，该核苷酸序列具有与编码选自由seqidno：4-9组成的组的氨基酸序列的核苷酸序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在核酸序列的上下文中，术语“百分比序列同一性”是指两个序列中的残基在为最大对应性比对时是相同的。序列同一性比较的长度可以在一段至少约九个核苷酸上，通常至少约18个核苷酸，更通常至少约24个核苷酸，典型地至少约28个核苷酸，更典型地至少约32个核苷酸，并且优选至少约36、48或更多个核苷酸。本领域已知有许多不同的算法可用于测量核苷酸序列同一性。例如，可以使用fasta，gap或bestfit来比较多核苷酸序列，其是wisconsinpackageversion10.0、geneticscomputergroup(gcg)、madison、wisconsin中的程序。fasta，其包括例如程序fasta2和fasta3，提供查询和搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(pearson,methodsenzymol.183:63-98(1990)；pearson,methodsmol.biol.132:185-219(2000)；pearson,methodsenzymol.266:227-258(1996)；pearson,j.mol.biol.276:71-84(1998)；通过引用并入本文)。除非另有说明，否则使用用于特定程序或算法的默认参数。例如，核酸序列之间的百分比序列同一性可以使用具有其默认参数的fasta(单词大小为6和nopam因子，用于评分矩阵)或使用具有其默认参数的gap来确定，如gcgversion6.1中所提供，通过引用并入本文。
在一个方面，本发明提供了核酸分子，包括编码选自seqidno：1-16的氨基酸序列的核苷酸序列。该核酸分子还可包括所述核苷酸序列的任何组合。在一种实施方式中，核酸分子包括编码seqidno：4的核苷酸序列。在另一实施方式中，核酸分子包括编码seqidno：4和6的核苷酸序列。在另一实施方式中，核酸分子包括编码seqidno：4、6和16的核苷酸序列。在另一实施方式中，核酸分子包括编码seqidno：7的核苷酸序列。在另一实施方式中，核酸分子包括编码seqidno：5的核苷酸序列。
在任何以上实施方式中，可以分离核酸分子。
在另一方面，本发明提供了适用于表达本文所述任何核苷酸序列的载体。术语“载体”，如本文所用，是指能够转运已经与其连接的另一核酸的核酸分子。在一些实施方式中，载体是质粒，即可以连接额外dna区段的环状双链dna片段。在一些实施方式中，载体是病毒载体，其中可以将额外dna区段连接到病毒基因组中。在一些实施方式中，载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。在其他实施方式中，载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞中时整合到宿主细胞的基因组中，并且从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。
本发明提供了包括编码如本文所述的三特异性结合分子或其部分(例如，第一和/或第二结合结构域的重链和/或轻链序列)的任何氨基酸序列的核酸分子的载体。本发明还提供了包括编码融合蛋白质、修饰抗体、抗体片段和其探针的核酸分子的载体。
本发明的核酸分子可以从产生三特异性结合分子或其部分的任何源中分离。在某些实施方式中，本发明的核酸分子可以合成而不是分离。
在一些实施方式中，本发明的核酸分子可包括编码来自本发明的三特异性结合分子的第一或第二结构域的vh结构域的核苷酸序列，其与编码来自任何源的重链恒定结构域的核苷酸序列符合读框地连接。类似地，本发明的核酸分子可包括编码来自本发明的三特异性结合分子的第一或第二结构域的vl结构域的核苷酸序列，其与编码来自任何源的轻链恒定结构域的核苷酸序列符合读框地连接。
在本发明的另一方面，编码第一或第二结合结构域的重(vh)和/或轻(vl)链的可变结构域的核酸分子可以“转变”为全长抗体基因。在一种实施方式中，通过分别插入到已经编码重链恒定(ch)或轻链恒定(cl)结构域的表达载体中，将编码vh或vl结构域的核酸分子转变为全长抗体基因，使得vh区段与载体内的ch区段可操作地连接，和/或vl区段与载体内的cl区段可操作地连接。在另一实施方式中，通过使用标准分子生物学技术将编码vh和/或vl结构域的核酸分子与编码ch和/或cl结构域的核酸分子连接，例如连结，将编码vh和/或vl结构域的核酸分子转变到全长抗体基因中。然后可以从已经引入它们的细胞中表达编码全长重链和/或轻链的核酸分子。
该核酸分子可用于重组表达大量的三特异性结合分子。如本文所述，该核酸分子还可用于产生人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单链抗体、免疫粘附素、双抗体、突变抗体和抗体衍生物。
在另一实施方式中，本发明的核酸分子用作用于特定氨基酸序列的探针或pcr引物。例如，核酸可以用作诊断方法中的探针或用作pcr引物以扩增dna区域，其可以用于例如，分离编码三特异性结合分子的部分(例如，可变结构域)的其他核酸分子。在一些实施方式中，核酸分子是寡核苷酸在一些实施方式中，寡核苷酸来自三特异性结合分子的高度可变结构域。在一些实施方式中，寡核苷酸编码如本文所述的本发明的三特异性结合分子的一个或多个cdr的全部或部分。
在另一实施方式中，核酸分子和载体可用于制备突变的三特异性结合分子。抗体可以在第一和/或第二结合结构域的重链和/或轻链的可变结构域中突变，例如，以改变三特异性结合分子的结合性质。例如，可以在一个或多个cdr区域中进行突变以增加或减少三特异性结合分子对于l-17a、il-17f和/或tnfα的kd，以增加或减少对于l-17a、il-17f和/或tnfα的koff，或以改变抗体对于l-17a、il-17f和/或tnfα的结合特异性。在另一实施方式中，与对应于本发明的三特异性结合分子的第一或第二结合结构域的抗体中的种系相比，在已知要改变的氨基酸残基处形成一个或多个突变。突变可以在可变结构域的cdr区域或框架区域中进行，或在恒定结构域中进行。在优选的实施方式中，突变在可变结构域中进行。在一些实施方式中，与本发明的三特异性结合分子的可变结构域的cdr区域或框架区域中的种系相比，在已知要改变的氨基酸残基处进行一个或多个突变。
在另一实施方式中，框架区域突变，使得所得的框架区域具有相应种系基因的氨基酸序列。突变可以在框架区域或恒定结构域中进行以增加三特异性结合分子的半衰期。参见，例如，wo00/09560。还可以进行框架区域或恒定结构域中的突变以改变三特异性结合分子的免疫原性，和/或以提供用于与另一分子共价或非共价结合的位点。根据本发明，三特异性结合分子可以在可变结构域的cdr或框架区域中的任何一个或多个中或在恒定结构域中具有突变。
在一些实施方式中，通过将如上述获得的编码第一和第二结合结构域的部分或全长序列的dna(例如重链和轻链序列，在结合结构域包括重链和轻链序列的情况下)插入表达载体，使得基因与必需的表达控制序列，诸如转录和翻译控制序列可操作地连接，来表达本发明的三特异性结合分子。表达载体包括质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(aav)、植物病毒，诸如花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、粘粒、yac、ebv衍生的游离体等等。可以将dna连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节dna转录和翻译的预期功能。可以选择表达载体和表达控制序列以与所用的表达宿主细胞兼容。编码第一和第二结合结构域的部分或全长序列的dna(例如，重链和轻链序列，在结合结构域包括重链和轻链序列的情况下)可插入到单独的载体中，可插入到单独的载体中。在一种实施方式中，将以上dna的任何组合插入到相同的表达载体中。可以通过标准方法将dna插入到表达载体中(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或者平末端连接，如果不存在限制性位点的话)。
方便的载体是编码功能完整的人ch或cl免疫球蛋白序列的载体，具有工程化的适当的限制性位点，使得任何vh或vl序列可以容易地插入和表达，如上所述。此类载体中的hc和lc编码基因可含有内含子序列，其通过稳定化相关mrna将导致增强的总抗体蛋白质产量。内含子序列的两侧是剪接供体和剪接受体位点，其确定rna剪接将发生的位置。内含子序列的位置可以在抗体链的可变或恒定区域中，或者当使用多个内含子时，在可变和恒定区域两者中。聚腺苷酸化和转录终止可以发生在编码区域下游的天然染色体位点。重组表达载体还可以编码促进来自宿主细胞的抗体链分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与免疫球蛋白链的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除抗体链基因外，本发明的重组表达载体可携带调控序列，其控制抗体链基因在宿主细胞中的表达。本领域技术人员将理解，表达载体的设计，包括调控序列的选择，可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列包括指导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，诸如启动子和/或增强子，其来源于逆转录病毒ltr、巨细胞病毒(cmv)(诸如cmv启动子/增强子)、猿猴病毒40(simianvirus40)(sv40)(诸如sv40启动子/增强子)、腺病毒、(例如，腺病毒主要晚期启动子(admlp))，多瘤和强哺乳动物启动子，诸如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。关于病毒调控元件及其序列的进一步描述，参见例如美国专利5,168,062，4,510,245和4,968,615。用于表达结合分子，诸如在植物中的抗体的方法，包括启动子和载体以及植物的转化的描述，是本领域已知的。参见，例如，美国专利6,517,529。在细菌细胞或真菌细胞，例如酵母细胞，中表达多肽的方法也是本领域熟知的。
除抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体可携带额外的序列，诸如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择已引入载体的宿主细胞(参见例如，美国专利4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，通常选择标记基因赋予已引入载体的宿主细胞对药物，诸如g418，潮霉素或甲氨蝶呤，的抗性。例如，选择标记基因包括二氢叶酸还原酶(dhfr)基因(用于在用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)、neo基因(用于g418选择)和谷氨酸合成酶基因。
如本文所用的术语“表达控制序列”是指影响与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的rna加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定化细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(即kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这种控制序列的性质依据宿主生物体而不同；在原核生物中，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，通常，这种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在在最低限度上包括其存在对于表达和加工必不可少的所有成分，并且还可以包括其存在是有利的其他成分，例如前导序列和融合配偶体序列。宿主细胞和三特异性结合分子产生的方法
本发明的另一方面涉及用于产生本发明的三特异性结合分子的方法。本发明的该方面的一种实施方式涉及用于产生如本文所定义的三特异性结合分子的方法，包括提供能够表达三特异性结合分子的重组宿主细胞，在适于表达三特异性结合分子的条件下培养所述宿主细胞，并且分离所得的三特异性结合分子。在这种重组宿主细胞中通过这种表达产生的三特异性结合分子在本文中称为“重组三特异性结合分子”。当三特异性结合分子是抗体时，它们被称为“重组抗体”。本发明还提供了这种宿主细胞的后代细胞，以及由其产生的三特异性结合分子。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)，如本文所用，是指已引入重组表达载体的细胞。本发明提供了宿主细胞，其可包括例如上述根据本发明的载体。本发明还提供了宿主细胞，其包括编码例如，本发明的三特异性结合分子的第一结合结构域和/或第二结合结构域的重链或其抗原结合部分、轻链或其抗原结合部分或两者的核苷酸序列。应当理解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅指特定的受试细胞，还指这种细胞的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在随后的世代中发生，所以这些后代事实上可能与亲本细胞不相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
编码本发明的三特异性结合分子的核酸分子和包括这些核酸分子的载体可用于转染合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。转化可以通过任何已知的用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的方法进行。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域熟知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的包封以及直接将dna显微注射到细胞核中。另外，可以通过病毒载体将核酸分子引入到哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。转化植物细胞的方法是本领域熟知的，包括例如农杆菌介导的转化、基因枪转化、直接注射、电穿孔和病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也是本领域熟知的。
可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，并且包括许多可从美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)(atcc)获得的永生化细胞系。其中包括、尤其、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0细胞、sp2细胞、hek-293t细胞、293freestyle细胞(invitrogen)、nih-3t3细胞、hela细胞(cell)、幼仓鼠肾(bhk)细胞、非洲绿猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞(例如hepg2)、a549细胞和许多其他细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞系，诸如sf9或sf21细胞。当将编码三特异性结合分子的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以允许在宿主细胞中表达结合分子的一段时间，或者更优选地，将结合分子分泌到宿主细胞生长的培养基中，来产生结合分子。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收三特异性结合分子。植物宿主细胞包括例如烟草属(nicotiana)、拟南芥属(arabidopsis)、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌(e.coli)和链霉菌属(streptomyces)物种。酵母宿主细胞包括粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(pichiapastoris)。
此外，可以使用许多已知技术增强本发明的三特异性结合分子从生产细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(gs系统)是在某些条件下用于增强表达的常用方法。在关于ep专利0216846、0256055、0323997和0338841的全部或部分中讨论了gs系统。
很可能，由不同细胞系或在转基因动物中表达的三特异性结合分子将具有彼此不同的糖基化模式。然而，由本文提供的核酸分子编码的，或包括本文提供的氨基酸序列的所有三特异性结合分子是本发明的一部分，不管结合分子的糖基化状态如何，并且更通常地，不管存在或不存在翻译后修饰。
三特异性结合分子可以使用多种方法制备。例如，可以单独地制备与il-17a、il-17f和/或tnfα或其任何组合结合的结构域(例如，使用化学蛋白质合成、重组表达方法、杂交瘤技术等)，并且然后直接地或通过接头彼此化学地附连。化学缀合分子(例如，抗体或其抗原结合部分)的手段是本领域技术人员熟知的。多肽通常含有多种官能团；例如，羧酸(cooh)或游离胺(-nh2)基团，其可用于与相应多肽上或接头上的合适的官能团反应。抗体也可以衍生化以暴露或附连另外的反应性官能团，并且可以涉及附连一种或多种接头分子，诸如可从piercechemicalcompany，rockford111获得的那些。用于本发明的三特异性结合分子的接头可以是本领域已知的多种合适接头中的任何一种。
在本发明的某些实施方式中，通过在宿主细胞中表达重组抗体或抗原结合部分来产生与il-17a、il-17f和/或tnfα或其任何组合结合的结构域。编码结合结构域的任何组合的序列可以被连接(直接或通过接头)。将编码与il-17a、il-17f和tnfα结合的结构域的所得到的核酸分子插入到表达载体中并且引入到宿主细胞中。然后从表达系统表达，分离和纯化所得到的三特异性结合分子。
在本发明的某些实施方式中，三特异性结合分子的结合结构域可以与设计用于防止结合分子的蛋白水解降解的新型接头分子配对在一起。这种接头通常缺乏蛋白水解切割位点。
药物组合物
本发明的另一方面是药物组合物，包括作为活性组分(或作为唯一的活性组分)的本发明的三特异性结合分子。该药物组合物可包括如本文所述的任何三特异性结合分子。在一些实施方式中，该组合物旨在改善、预防和/或治疗可能受il-17a、il-17f、tnfα的活性影响的疾患和/或自体免疫或炎性疾病。
通常，本发明的三特异性结合分子适用于作为与一种或多种药学上可接受的赋形剂相结合的制剂(例如，如下所述)给药。
本发明的药物组合物可包括至少一种三特异性结合分子，和靶向一种或多种相关的细胞表面受体，例如参与自体免疫或炎症应答的细胞表面受体的一种或多种其他结合分子(例如抗体)。
术语“赋形剂”在本文中用于描述除本发明的化合物之外的任何组分。赋形剂的选择将在很大程度上取决于诸如特定的给药模式、赋形剂对溶解度和稳定性的影响以及剂型性质的因素。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。药学上可接受的赋形剂的一些实例是水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等，及其组合。在许多情况下，优选地在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇诸如甘露醇和山梨糖醇、或氯化钠。药学上可接受的物质的其他实例是润湿剂或少量辅助物质，诸如润湿或乳化剂，防腐剂或缓冲剂，其增强抗体的保质期或有效性。
本发明的药物组合物及其制备的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。这些组合物及其制备的方法可以在，例如remington'spharmaceuticalsciences,第19版(mackpublishingcompany,1995)中找到。药物组合物优选在gmp(良好生产规范)条件下制造。
本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量或作为多个单一单位剂量大量制备、包装或销售。如本文所用，“单位剂量”是包括预定量的活性组分的药物组合物的离散量。活性组分的量通常等于将给药于受试者的活性组分的剂量，或这种剂量的方便的分数诸如，例如这种剂量的一半或三分之一。
本领域所接受的用于给药肽、蛋白质或抗体的任何方法可适当地用于本发明的三特异性结合分子。
本发明的药物组合物通常适用于肠胃外给药。如本文所用，药物组合物的“肠胃外给药”包括特点在于受试者组织的物理破坏和通过组织中的破口给药药物组合物，因此通常导致直接给药于血流中、于肌肉中或于内脏器官中的任何给药途径。因此，肠胃外给药包括但不限于通过注射组合物、通过通过手术切口施加组合物、通过通过组织穿透非手术伤口施加组合物等等来给药药物组合物。特别地，预期肠胃外给药包括但不限于皮下、腹膜内、肌肉内、胸骨内、静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、颅内、滑膜内注射或输注；和肾透析输注技术。瘤内递送，例如瘤内注射，也可以是有利的。还考虑了局部灌注。优选的实施方式包括静脉内和皮下途径。
适于肠胃外给药的药物组合物的制剂通常包括活性组分连同药学上可接受的载体，诸如无菌水或无菌等渗生理盐水。这些制剂可以以适用于推注给药或用于连续给药的形式制备、包装或出售。可以以单位剂量形式制备、包装或销售可注射制剂，诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外给药的制剂包括但不限于油性或水性媒介中的混悬剂、溶液、乳剂、糊剂等等。此类制剂还可包括一种或多种另外的组分，包括但不限于混悬剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外给药的制剂的一种实施方式中，活性组分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供，用于在肠胃外给药重构的组合物之前用合适的媒介(例如无菌无热原水)重构。肠胃外制剂还包括水溶液，其可含有赋形剂诸如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选ph为从3至9)，但是，对于一些应用，它们可更适合配制为无菌非水溶液或为干燥形式，以与合适的载体诸如无菌无热原水一起使用。示例性肠胃外给药形式包括在无菌水溶液中的溶液或混悬液，例如丙二醇水溶液或葡萄糖溶液。如果需要，这些剂型可以被适当地缓冲。其它有用的可肠胃外给药的制剂包括含有微晶形式的或脂质体制剂中的活性组分的制剂。用于肠胃外给药的制剂可以配制为立即释放和/或调节释放。调节释放制剂包括延迟的，持久的，脉冲的，控制的，靶向的和程序化的释放。
例如，在一个方面，无菌可注射溶液可以通过将以所需量的三特异性结合分子与以上列举的组分的一种或组合掺入适当的溶剂中(根据需要)，然后过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，该无菌载体含有基本的分散介质和来自以上列举的那些的所需其他组分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性组分加上来自其先前的无菌过滤溶液的任何其他所需组分的粉末。例如，通过使用包衣诸如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持溶液适当的流动性。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸盐和明胶，和/或通过使用调节释放包衣(例如，缓释包衣)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
本发明的三特异性结合分子还可以鼻内或通过吸入给药，通常以干燥粉末吸入器的干燥粉末的形式(单独、作为混合物或作为混合成分颗粒，例如，与合适的药学上可接受的赋形剂混合)、作为加压容器的、泵、喷雾、雾化器(优选使用电流体动力学的雾化器以产生细雾)或喷雾器的气溶胶喷雾(使用或不使用合适的推进剂)、或作为滴鼻剂。
加压容器、泵、喷雾、雾化器或喷雾器通常含有本发明的结合分子的溶液或混悬剂，包括例如用于分散、溶解或延长活性的释放的合适试剂、作为溶剂的推进剂。
在用于干燥粉末或混悬剂制剂之前，药物产品通常微粉化至适于通过吸入递送的尺寸(通常小于5微米)。这可以通过任何适当的粉碎方法实现，诸如螺旋喷射研磨、流化床喷射研磨、超临界流体加工以形成纳米颗粒、高压均化或喷雾干燥。
用于在吸入器或吹入器中使用的胶囊、泡罩和药盒可以配制成含有本发明化合物、合适的粉末基质和性能改性剂的粉末混合物。
用于使用电流体动力学以产生细雾的雾化器中使用的合适的溶液制剂可以包含每次驱动合适剂量的本发明的三特异性结合分子，并且驱动体积可以例如从1μl至100μl变化。
合适的调味料，诸如薄荷醇和左薄荷脑，或甜味剂诸如糖精或糖精钠，可以加入到用于吸入/鼻内给药的本发明的这些制剂中。
用于吸入/鼻内给药的制剂可以配制成立即释放和/或调节释放。调节释放制剂包括延迟的，持久的，脉冲的，控制的，靶向的和程序化的释放。
在干燥粉末吸入器和气雾剂的情况下，剂量单位借助于阀确定其递送计量量。根据本发明的单位通常设置为给药本发明的结合分子的计量剂量或“喷量(puff)”。总日剂量将典型地以单一剂量给药，或者更通常地，在一天中作为分开的剂量。
本发明的三特异性结合分子也可以配制用于口服途径给药。口服给药可涉及吞咽，使得化合物进入胃肠道，和/或口腔、舌侧或舌下给药，化合物通过其直接从口进入血液流。
适于口服给药的制剂包括固体、半固体和液体体系，诸如片剂；含有多种或纳米微粒、液体或粉末的软胶囊或硬胶囊；锭剂(包括液体填充的)；咀嚼物；凝胶；快速分散剂型；薄膜；囊珠剂(ovule)；喷雾剂；和口腔/粘膜粘着剂贴片。
液体制剂包括混悬液、溶液、糖浆和酏剂。这些制剂可用作软胶囊或硬胶囊(例如由明胶或羟丙基甲基纤维素制成)中的填充剂，并且通常包括载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或合适的油，和一种或多种乳化剂和/或混悬剂。液体制剂也可以通过例如从小袋中重构固体来制备。
在一种实施方式中，本发明的三特异性结合分子配制为在ph5.0至6.5的缓冲液中，包括浓度为1至100mm的组氨酸和乙酸盐的组合物。本发明的三特异性结合分子的治疗性用途
在一个方面，本发明的三特异性结合分子用于治疗可受il-17a、il-17f和/或tnfα的活性影响的疾患。例如，医生可以通过单独或与其他治疗剂组合(依次或同时)给药本发明的三特异性结合分子来治疗自体免疫或炎性疾患。三特异性结合分子调节il-17a、il-17f和/或tnfα的活性，导致自体免疫或炎症应答的减少。可以通过本发明的三特异性结合分子和方法治疗的疾患可以包括以下任何一种：类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年型慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆骨关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、全身性红斑狼疮、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠疾病、胰岛素依赖型糖尿病、甲状腺炎、哮喘、过敏性疾病、银屑病、斑块状银屑病、特应性皮炎、硬皮病、反应“移植物抗宿主”器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫疾病、结节病、川崎氏病、格雷夫斯病、肾病综合征、慢性疲劳综合征、韦格纳氏肉芽肿病、亨-舍二氏紫癜、微观肾血管炎、慢性活动性肝炎、uvenita、脓毒性休克、中毒性休克综合征、脓毒病综合征、恶病质、获得性免疫缺陷综合征、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、成人(急性)呼吸窘迫综合征、秃头症、斑秃、血清阴性关节病、关节病、莱特尔病、与溃疡性结肠炎关节病相关的银屑病性关节病、特应性过敏、自体免疫性大疱性疾病、寻常型天疱疮、片状天疱疮、类天疱疮疾病、线状iga、自体免疫性溶血性贫血、coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、幼年型恶性贫血、关节炎、原发性硬化性甲型肝炎、隐源性自体免疫性肝炎、纤维化肺疾病、隐源性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺疾病、间质性肺炎、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、感染后间质性肺疾病、痛风性关节炎、自体免疫性肝炎、i型自体免疫性肝炎(经典自体免疫性肝炎或狼疮)、ii型自体免疫性肝炎骨关节炎、原发性硬化性胆管炎、i型银屑病、ii型银屑病、特发性白细胞减少症、自体免疫性中性粒细胞减少症、肾nos疾病、肾小球性肾炎、微观肾血管炎、盘状红斑狼疮、特发性或nos男性不育症、对精子的自体免疫、多发性硬化症(所有亚型)、交感性眼炎、继发于结缔组织疾病的肺动脉高压症、古德帕斯丘综合征、结节状多发性关节炎的肺部表现、急性风湿性发热、类风湿性脊柱炎、强直性脊柱炎、斯提耳氏病、全身性硬化症、圣格雷纳综合征(shengrenasyndrome)、干燥综合症(
在某些实施方式中，本发明的三特异性结合分子用于治疗选自(但不限于)类风湿性关节炎(ra)、骨关节炎、类风湿性关节炎骨质疏松症、炎性纤维化(例如硬皮病、肺纤维化和肝硬化)、牙龈炎、牙周变性或牙周疾病、炎性肠疾病(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎和炎性肠疾病)、哮喘(包括过敏性哮喘)、过敏症、慢性阻塞性肺疾病(copd)、多发性硬化症、银屑病和癌症的疾患。
在特定实施方式中，本发明的三特异性结合分子用于治疗类风湿性关节炎、银屑病或银屑病性关节炎。
“治疗(treat)”，“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指减轻或消除生物学疾患和/或其伴随症状中的至少一种的方法。如本文所用，“减轻”疾病、疾患或病症意指降低疾病，疾患或病症的症状的严重性和/或发生频率。此外，本文对“治疗”的引用包括对治愈性、姑息性和预防性治疗的引用。
在一个方面，治疗受试者或患者是哺乳动物，优选人受试者。所述受试者可以是任何年龄的雄性或雌性。
“治疗有效量”是指将在一定程度上缓解所治疗疾患的一种或多种症状的所给药的治疗剂的量。
本发明的三特异性结合分子可以单独给药或与一种或多种其他药物或抗体(或其任何组合)联合给药。因此，本发明的药物组合物，方法和用途还包括与其他活性剂的组合(共同给药)的实施方式，如以下详述。
如本文所用，术语“共同给药(co-administration)”，“共同给药(co-administered)”和“与......组合”，指的是三特异性结合分子与一种或多种其他治疗剂，旨在表示并且确实是指并且包括以下内容：
·将本发明的三特异性结合分子和治疗剂的这样的组合同时给药于需要治疗的患者，当这些成分一起配制成基本上同时释放所述成分给所述患者的单一剂型时，
·将本发明的三特异性结合分子和治疗剂的这种组合基本上同时给药于需要治疗的患者，当将这些成分彼此分开配制成基本上同时由所述患者服用的单独的剂型时，于是所述成分基本上同时释放给所述患者，
·将本发明的三特异性结合分子和治疗剂的这种组合依次给药于需要治疗的患者,当将这些成分彼此分开配制成由所述患者以连续时间服用的单独的剂型时，在每次给药之间具有显着的时间间隔，于是所述成分在基本上不同的时间释放给所述患者；以及
·本发明的三特异性结合分子和治疗剂的这种组合依次给药于需要治疗的患者，当这些成分一起配制成以受控的方式释放所述成分的单一剂型时，因此它们在相同和/或不同的时间同时、连续和/或重叠释放给所述患者，其中每个部分可以通过相同或不同的途径给药。
本发明的三特异性结合分子可以在没有另外的治疗性治疗下给药，即作为独立的疗法。或者，用本发明的三特异性结合分子的治疗可包括至少一种另外的治疗性治疗(组合疗法)。在一些实施方式中，三特异性结合分子可以与另一种药品/药物共同给药或配制，用于治疗自体免疫或炎性疾患。
在一些实施方式中，本发明的三特异性结合分子与抗炎剂组合给药。可以与本发明的三特异性结合分子一起给药的抗炎剂包括但不限于皮质类固醇(例如倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、强的松龙、强的松和曲安西龙)、非甾体类抗炎药物(例如巴柳氮、塞来昔布、双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬酯、甲芬那酸、美洛昔康、纳布美通、萘普生、奥沙拉嗪、奥沙普嗪、苯基丁氮酮、吡罗昔康、双水杨酸酯、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸和托美汀)、以及对乙酰氨基酚、抗组胺药、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑酮类、水杨酸衍生物(例如柳氮磺吡啶酮(sulfasalazone)和美沙拉嗪)、噻嗪甲酰胺类、e-乙酰胺基己酸、s-腺苷甲硫氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、地芬吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、纳布美通、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗沙唑和替尼达普。
在一些实施方式中，本发明的三特异性结合分子与免疫抑制剂组合给药，诸如但不限于类固醇、环孢菌素、环孢菌素类似物、环磷酰胺甲基强的松、强的松、咪唑硫嘌呤、fk-506、15-脱氧精胍菌素、那他珠单抗和其他通过抑制应答t细胞的功能起作用的免疫抑制剂。
在一些实施方式中，本发明的三特异性结合分子与免疫抑制剂组合给药，诸如但不限于orthoclonetm(okt3)、sandimmunetm/neoraltm/sangdyatm(环孢菌素)，prograftm(他克莫司)，cellcepttm(霉酚酸酯)，咪唑硫嘌呤，糖皮质激素，avonextm(干扰素β1a)和rapamunetm(西罗莫司)。在一种实施方式中，免疫抑制剂可用于预防器官或骨髓移植的排斥。
在一些实施方式中，本发明的三特异性结合分子与tnf拮抗剂组合给药。可以与本发明的结合分子一起给药的tnf拮抗剂包括但不限于英夫利昔单抗(remicadetm)、阿达木单抗(humiratm)、赛妥珠单抗(cimziatm)、戈利木单抗(simponitm)、依那西普(enbreltm)、黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱)和安非他酮(wellburtintm、zybantm)。在某些实施方式中，tnf拮抗剂是tnfα拮抗剂。
在一些实施方式中，本发明的三特异性结合分子与列表中的拮抗剂组合给药，包括但不限于il-6r拮抗剂(例如托珠单抗和serulumab)、il-6拮抗剂、il-1a或il-1b拮抗剂、il-23拮抗剂、il-22拮抗剂和gm-csf拮抗剂。
在一些实施方式中，本发明的三特异性结合分子与il-17a和/或il-17f拮抗剂组合给药。在某些实施方式中，所述拮抗剂是抗il-17a和/或抗il-17f抗体或其抗原结合部分。
包括本发明的三特异性结合分子和至少一种其他药剂(例如免疫抑制剂或抗炎剂)的药物制品可以用作组合治疗，用于在自体免疫或炎性疾患的治疗中同时、分别或连续给药。
应当理解，本发明的三特异性结合分子可以用于如上所述的治疗方法，可以用于在如上所述的治疗中使用，和/或可以用于在制造用于如上所述治疗的医药中使用。
给药剂量和途径
本发明的三特异性结合分子将以用于治疗所讨论的病症的有效量给药，即达到所需结果所必需的剂量和时间段。治疗有效量可根据诸如所治疗的具体病症、患者的年龄、性别和重量的因素，以及三特异性结合分子是作为独立治疗给药还是与一种或多种额外的抗自体免疫或抗炎治疗组合给药而改变。
可以调整剂量方案以提供最佳的所需应答。例如，可以单次推注给药、可以随时间给药若干分开的剂量或者可以由治疗情况的紧急程度的指示按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠胃外组合物对于给药方面性和剂量均匀性是特别有利的。剂量单位形式，如本文所用，是指适合作为用于待治疗的患者/受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算的预定量的活性化合物，以与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。用于本发明的剂量单位形式的规格通常取决于并且直接依赖于(a)化学治疗剂的独特特性和要实现的特定治疗性或预防性效果，和(b)用于治疗个体敏感性的这种活性化合物的配制的本领域固有的局限性。
因此，技术人员将理解，基于本文提供的本公开，剂量和给药方案根据治疗领域中熟知的方法调整。也就是说，可以容易地确定最大可耐受剂量，并且还可以确定向患者提供可检测的治疗益处的有效量，以及给药每种药剂以向患者提供可检测的治疗益处的时间要求。因此，虽然本文举例说明了某些剂量和给药方案，但这些实例决不限制可在实施本发明时提供给患者的剂量和给药方案。
应当注意，剂量值可随待减轻的病症的类型和严重性而改变，并且可包括单一或多剂量。还应当理解，对于任何特定受试者，应根据个体需要和给药或监督组合物给药的人的专业判断随时间调整具体的剂量方案，并且本文陈述的该剂量范围仅是示例性的，并且不旨在限制所呈现的组合物的范围或实施。此外，本发明组合物的剂量方案可以基于多种因素，包括疾病类型、年龄、重量、性别、患者的医疗状况、病症的严重性、给药途径和所用的特定三特异性结合分子。因此，剂量方案可以广泛变化，但可以使用标准方法常规确定。例如，可以基于药代动力学或药效学参数调整剂量，其可以包括临床效果，诸如毒性作用和/或化验值。因此，本发明包括，如由技术人员确定的，患者内剂量递增。确定适当的剂量和方案在相关领域中是公知的，并且一旦提供本文公开的教导，将被理解以由技术人员完成。
以上提供了合适的给药途径的实例。
预期本发明的三特异性结合分子的合适剂量将在0.1-100mg/kg的范围内，诸如约0.5-50mg/kg，例如约1-20mg/kg。三特异性结合分子可以例如以至少0.25mg/kg，例如，至少0.5mg/kg，诸如至少1mg/kg，例如，至少1.5mg/kg，诸如至少2mg/kg，例如至少3mg/kg，诸如至少4mg/kg，例如，至少5mg/kg；并且例如，最高达50mg/kg，诸如最高达30mg/kg，例如最高达20mg/kg，诸如最高达15mg/kg的剂量给药。将通常以适当的间隔重复给药，例如，每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次，并且只要负责的医生认为合适，必要时可任选地增加或减少剂量。
用于自体免疫或炎性疾患治疗的有效量可以通过其稳定疾病进展和/或改善患者症状，优选地逆转疾病进展的能力来测量。本发明的三特异性结合分子抑制自体免疫或炎性疾患的能力可以通过体外测定来评估，例如，如实施例中所述，以及在预测在此类疾患中的功效的合适的动物模型中。合适的剂量方案将被选择以便在每种特定情况下提供最佳治疗反应，例如，以单次推注或以连续输注给药，并且可能根据每种情况的紧急程度指示的剂量调节。
诊断用途和组成物
本发明的三特异性结合分子也可用于诊断过程(例如，体外、离体)。例如，三特异性结合分子可用于检测和/或测量来自患者(例如，组织样品或体液样品，诸如炎性渗出物、血液、血清、肠液、唾液或尿液)的样品中il-17a、il-17f和/或tnfα的水平。合适的检测和测量方法包括免疫学方法，诸如流式细胞术、酶联免疫吸附测定(elisa)、化学发光测定、放射免疫测定和免疫组织学。本发明还涵盖包括本文所述的三特异性结合分子的试剂盒(例如，诊断试剂盒)。
为了可以更好地理解本发明，提出以下实施例。这些实施例仅用于说明的目的，并且不被理解为以任何方式限制本发明的范围。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文。尽管为了理解清楚的目的已经通过说明和实例的方式颇为详细地描述了前述发明，但是根据本发明的教导，将对本领域普通技术人员显而易见的是，可以对其进行某些改变和修改，而不脱离所附实施方式的精神或范围。
实施例
实施例1：三特异性抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα抗体的生成和优化
如图1所示，生成并且优化了三特异性抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα抗体。
实施例2：在哺乳动物细胞的悬浮培养中产生重组抗原和抗体
根据公开的方案(longo等，methodsenzymol529:227–240(2013))，在组成型表达ebna1(epstein-barr病毒核抗原1)的cho-k1细胞中产生抗体和抗原。根据制造商的说明书，使用由lifetechnologiescorporation生产的无血清培养基在定轨振荡器上悬浮培养细胞。对于瞬时表达，用线性聚乙烯亚胺(peimax，polysciences)以2×10e6/ml的浓度转染细胞。dna/pei比例为1:3。转染后5-7天，将培养基以2000g离心20分钟，并且通过0.22μm过滤器过滤。通过亲和色谱法从培养液中提取目标蛋白质。
使用profinityimacni亲和树脂(bio-radcompany)从培养液中提取并且纯化在蛋白质的c-末端处的含有六个氨基酸和flag-肽的重组蛋白质il-17a(图2)。在纯化之前，将nicl2加入培养液中至浓度为1mm。然后将5mlprofinityimacni亲和树脂加入培养液中，并且在室温下在振荡器上搅拌1h。将吸附剂(5ml)转移至thermoscientific聚丙烯柱中并且用5倍柱体积的pbs洗涤以去除非特异性结合成分。使用0.3m咪唑，ph8，150mmnacl洗脱结合的抗原。然后通过使用snakeskin透析管(snakeskindialysistubing)技术透析将蛋白质转移至pbs(ph7.4)，过滤(0.22μm)，转移至管中，并且在-70℃下储存。通过sds凝胶电泳评估所得的蛋白质溶液的纯度(图3)。
测试和对照igg1抗体在hitrap蛋白ff1ml柱(gehealthcare)上根据上述用于il-17a-fc抗原的程序纯化。通过sds-凝胶电泳评估所得的蛋白质溶液的纯度(图4)。
根据变性条件下的电泳纯度数据，重组抗原产物和il-17a-h6f和il-17a-fc适用于免疫和进一步研究。此外，可以在研究中使用纯度令人满意的对照制剂ain457(novartis；重现(us7807155b2))。
实施例3：用人il-17a免疫美洲驼和美洲驼fab噬菌体抗体文库的生成
通过皮下注射混合等体积的完全(第一次注射期间)或不完全(用于剩余的注射)的弗氏佐剂的抗原材料对美洲驼(大羊驼(lamaglama))连续进行5次免疫。使用重组蛋白质的混合物作为抗原(每1次注射0.2mg的每种蛋白质)，其中一种是人il-17a-h6f(实施例2)。在第一次注射后3周进行第二次注射(免疫步骤)，并且然后以两周的间隔进行三次免疫。每次注射后5天抽取血液样品(50ml)，从第三次开始。
免疫后收集的美洲驼血液用含有1mmedta的pbs溶液稀释2次。将35ml稀释的血液以1.077g/ml的密度，15ml的体积，在培养基溶液
根据标准方案证实，得到的针对il-17a的血清免疫球蛋白滴度不低于1/10000，对于抗体文库(5)的构建这是令人满意的。
根据建议的方案(qiagen)，使用美洲驼rneasymini试剂盒提取单核细胞总rna。通过nanovue(gehealthcare)确定rna浓度，并且通过在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检查提取的rna的质量。
使用mmlvrt试剂盒(evrogen)根据推荐的方案使用逆转录酶和随机mmulv六聚体寡核苷酸作为引物进行逆转录反应。
使用一组寡核苷酸和公开的方案，逆转录产物在两级pcr中用作模板以产生两侧为限制性位点的可变结构域基因(dehaard等,jbiolchem274(26):18218-30(1999)；degenst等,devcompimmunol30(1-2):187-98(2006))。然后，通过依次的限制酶切、连接和扩增进行一个片段的可变轻链和重链结构域的基因的化合物。重链的基因分别与轻链的κ基因和λ基因组合。因此，所有反应中估计的基质分子数不小于1011。用限制酶nhei/eco91i处理得到的dna产物vl-ck-vh，并且连接到原始的噬菌粒ph5中。图6显示了所得到的噬菌粒结构。将连接产物转化到根据已知方案获得的电感受态ss320细胞中(bond等,jmolbiol332(3):643-55(2003))。分别地，fab文库的κ衍生物的总数为5.1*10e8，并且fab文库的λ衍生物的总数为-3.7*10e8。
实施例4：噬菌体抗体的fab文库的选择
通过进行一系列选择周期，基于重组人il-17a(r&dsystems)从fab展示文库中分离特异性抗il-17a噬菌体fab，如前所述(marks等,jmolbiol222(3):581-597(1991)；dehaard等,jbiolchem274(26):18218-30(1999))。为了通过筛选进行选择，将人il-17a在50mm碳酸盐缓冲液(ph9.5)中在4℃下在吸附管highsorb(nunc)的表面上吸附过夜。用pbs(ph7.4)洗涤管，然后用pbs溶液(ph7.4)-脱脂乳(0.5％wt./vol.)封闭1h。接下来，将在pbs(ph7.4)-脱脂乳(0.5％wt./vol.)中的2.4ml噬菌体溶液以在1ml中1012个噬菌体颗粒的浓度加入到具有抗原的试管中并且在搅拌下温育1小时。使用pbs溶液(ph7.4)-吐温20(0.1％vol./vol.)在一系列洗涤周期期间去除非结合噬菌体。洗涤次数分别从第一轮到第三轮增加到20-30-40次。在搅拌下用100mlgly-hcl(ph2.5)溶液洗脱剩余的结合噬菌体颗粒15min，并且然后用1mtris-hcl(ph7.6)中和。用获得的噬菌体感染细菌菌株大肠杆菌(e.coli)tg1，然后分离噬菌体并且用于下一个选择周期。
在对il-17a的第二轮和第三轮选择后，多克隆噬菌体产物的eia分析显示出显着的富集(图8)。将得到的由对抗il-17a特异性的人fab富集的克隆集群再克隆到表达质粒pll(图7)，其在重链ch1基因的c-末端处含有myc标签和his6标签。
实施例5：fab与人il-17a的特异性结合的分析
eia(elisa)用于测量所选fab片段与人il-17a的结合。作为阳性对照，使用具有公开的序列(novartis)的fab抗体ain457。对于特异性结合测定，用50μlil-17a(在1×包被碳酸盐缓冲液中0.5μg/ml)包被elisa板(nuncimmunomaxisorp)上的孔，然后密封并且在4℃温育过夜。所有后续步骤均使用基于genetixq-pix2xt(moleculardevice)机器人系统和tecanfreedomevo200(tecan)的自动化高性能平台通过标准eia方案进行。为了阻断非特异性结合，加入封闭缓冲液(bb)(pbs中的200μl0.5％脱脂乳)。将板在振荡器上在室温下温育一小时。用pbs-吐温洗涤后，每个孔加入50μl的含有分析的fab的测试细胞上清液，与等体积的封闭缓冲液混合。将板再次在室温下振荡温育一小时，然后用pbs-吐温缓冲液洗涤板的每个孔五次。洗涤后，在pbs-吐温中以1:5000的比例加入50μl/孔的人抗fabhrp缀合的二级抗体(pierce-thermoscientific)。如上所述，将板在旋转振荡器上振荡(50min，室温)并且用pbs-吐温缓冲液洗涤五次。通过加入tmb(100μl/孔)直至饱和(平均3-5分钟)来显示色度信号，然后通过添加终止溶液(100μl/孔，10％硫酸)来停止进一步的显色。使用合适的读板器(tecan-sunrise；tecan)在450nm的波长下测量色彩信号。抗体结合的程度与色彩信号产生成比例。在竞争性eia分析中测试超过背景色彩5倍的信号的克隆，以检测阻断il-17a配体和受体之间相互作用的拮抗性fab。
实施例6：阻断il-17a配体和il-17r受体之间相互作用的竞争性eia分析
竞争性elisa用于分析先前选择的抗人il-17afab的拮抗能力。作为阳性对照，我们使用拮抗性fab抗体ain457(novartis)。将50μl受体il-17ara-fc(r&dsystems)固定在elisa板(nuncimmunomaxisorp)的孔中，以1mg/ml的浓度，在1×包被碳酸盐缓冲液中，并且在4℃下温育过夜。所有后续步骤均使用基于genetixq-pix2xt(moleculardevice)机器人系统和tecanfreedomevo200(tecan)的自动化高性能平台通过标准eia方案进行。为了阻断非特异性结合，加入封闭缓冲液(bb)(pbs中的200μl0.5％的脱脂乳)。将板在振荡器上在室温下温育一小时。
同时，将50μl含有分析的fab的测试细胞上清液在96孔板中与在1％乳pbs-吐温中的浓度为0.4μg/ml的50μlil-17a-his6-flag混合。然后将其在37℃下在振荡器上以500转/min搅拌下温育1小时。
从含有il-17ara-fc受体的板洗涤封闭缓冲液后，将上述反应混合物以每孔90μl转移。将板再次在室温下振荡温育45分钟，然后用pbs-吐温缓冲液洗涤板的每个孔五次。以1μg/ml的浓度添加50μl/孔的小鼠抗flagm2抗体(sigma)。将板在室温下温育45min，然后用pbs-吐温缓冲液洗涤板的每个孔5次。加入在pbs-吐温中以1:5000的比率稀释的50μl/孔的抗小鼠igghrp-缀合的二级抗体(pierce-thermoscientific)。如上所述，将板在旋转振荡器上在室温下振荡45分钟并且用pbs-吐温缓冲液洗涤5次。通过加入tmb(100μl/孔)直至饱和(平均3-5分钟)来显示色度信号，然后通过添加终止溶液(10％硫酸，100μl/孔)来停止进一步的显色。使用合适的读板器(tecan-sunrise；tecan)在450nm的波长下测量色彩信号。抗体结合的程度与色彩信号产生成比例。
在对照fab抗体ain457的水平显示阻断的克隆被记录为阳性并且用于进一步分析。使用appliedbiosystems3130遗传分析仪(appliedbiosystems)根据标准方案对阳性克隆的可变结构域的基因测序并且分析。选择含有vhh可变结构域的克隆用于进一步研究。还发现一个克隆，3vhhfab，以二十三个不同的轻链结构域序列的组合出现，这可能表明其相对的结构耐受性，并且可能提示该vhh结构域，而非轻链，有助于与il-17a的相互作用。
实施例7：通过动力学解离常数koff(kdis)比较筛选抗il-17avhhfab候选物
使用设备octetred96(pall-fortebio)进行用于抗il-17afab候选物的koff的比较筛选。将抗fabch1生物传感器在含有10mmpbs，ph7.2-7.4，0.1％吐温-20，和0.1％bsa的运行缓冲液中再水化30分钟。将大肠杆菌(e.coli)10×-工作缓冲液加入到测试样品中至最终浓度为1×。然后将抗fabch1生物传感器在12℃下浸入候选fab片段和大肠杆菌(e.coli)样品中4小时。将表面上具有固定化的fab片段的传感器转移到具有运行缓冲液的孔中，其中基线是指定的(60sec.)。然后将传感器转移到具有分析物溶液(il-17a，30μg/ml)的孔中，用于结合抗原-抗体复合体(300sec.)。然后将传感器返回到含有运行缓冲液的孔中，用于随后的解离步骤(300sec.)。在每次实验后，通过将它们置于用于再生的三倍缓冲液中(gly-hcl，ph1.7)，将所用的传感器再生以用于以下实验。使用octet数据分析软件(版本7.0)根据标准程序使用相互作用模型1:1进行曲线的分析。
抗il-17afab候选物的koff筛选的结果列于表1中。所有独特的vhhfab都表现出与人il-17a的特异性高亲和力结合，同时3vhhfab表现出非常快的kon和非常慢的kdis(1/sec.)，超出了仪器的灵敏度。
表1.vhhfab对人il-17a的亲和力和对人il-17f的特异性。
*——eia中不具有超过背景50％的信号，
+++超过背景10倍多的强信号。
因此，基于分析数据，3vhhvk4b11的vhh单结构域与其他两个候选物相比显示出最大的结合亲和力。
实施例8：vhhfab与人il-17f的特异性结合
根据实施例5中描述的标准elisa方案对上述三种vhhfab进行elisa测定，但使用人il-17f(r&dsystems)。将fab抗体ain457(公开的序列；novartis)用作阳性对照。表1列出了三种vhhfab候选物相互作用的定性分析的结果。选择vhh单结构域，其在下文中指定为具有下述突变的vhh17(seqidno：1；图9)，用于基于对3vhhvk4b11fab的亲和力和交叉反应性测试的进一步工作。
实施例9：扫描抗il-17avhh17结构域的cdr的诱变
根据制造商的方案，使用
通过扫描诱变获得的结果列于表2中。该表显示了，当与野生型序列相比时，响应突变体vhh17/人il-17a结合信号的≤30％减少的cdr取代。在一个方面，本发明提供了包括这些突变及其任何组合的三特异性结合分子。
表2.扫描诱变vhh17
该筛选鉴定了耐受氨基酸取代的vhh17的cdr中氨基酸位置。已经证明，本组氨基酸取代不会显着改变vhh17对人il-17a亲和的结合亲和力。因此，该取代组可用于改善候选物的各种性质。
实施例10：工程化并且产生抗il-17a/抗il-17f和抗tnfα三特异性抗体：vhh-igg1(lala)
以原始的密码子组成合成用于针对人tnfα的抗体的重链和轻链可变结构域的基因(ru2303604)，并且分别克隆到用于重链和轻链的pee-hc(igg1)和pee-lc质粒中。这允许cho-ebna细胞中的联合瞬时表达产生igg1同种型单克隆抗体。通过测序验证这些构建体，并且命名为针对重链的pee-atnf-igg1hc和针对轻链的pee-atnflc(图9示出了可变结构域的氨基酸序列)。
为获得具有图9中所示的可变结构域的抗tnfαigg1的“无效”lala变体(woodle等,transplantation68(5):608-16(1999))，使用pee-atnf-igg1hc构建体中的寡核苷酸定向诱变，经由pfuultrahs聚合酶(stratagene)，根据公开的方案(
另外，使用实施例8中检测的针对il-17a和il-17f的高亲和力vhh序列作为基础，合成vhh17基因(seqidno：4；图9)。引入了一组特异于人vh种系的原始的突变(q5v、s11l、d61a、y77n、r93v)以及重链和轻链可变结构域(vh和vl)之间亚基间接触的位点处的突变e44g/r45t的组合。如先前所示(ru2014138740)，这提供了vhh衍生物与抗体轻链组合的稳定性。
此外，根据标准的基因工程程序，将vhh17基因(seqidno：1)克隆到轻链pee-atnflc构建体的n末端，通过对在融合分子内两种多肽的正确独立折叠和与不同的抗原独立结合所必需的特异性13-氨基酸柔性接头与轻链分开。所得到的构建体命名为pee-vhh17-77n-atnflc。
使用pfuultrahs聚合酶(stratagene)，根据公开的方案(
含有重链和轻链突变的构建体成对组合以获得各种成对组合并且以保持瞬时积累，如实施例2中所述的。这导致产生在抗tnfα结构域的cdr中没有突变的1种变体(mabc)，和32种三特异性抗体的变体(mab1-32；图11)。所有变体的生产力接近或超过100mg/l，这对于进一步研究其性质是令人满意的。
实施例11：三特异性抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子中和肿瘤-α坏死因子的比较分析
抗体的测试溶液在96孔板中滴定，从浓度为500ng/ml，以2为增量，每孔100μl溶液。制备浓度为500pg/ml的重组人tnfα的溶液，并且然后向具有测试样品的每个孔中加入50μl。将板在37℃下在co2培养箱中温育1小时。
wehi-13var细胞以1×106个细胞/ml的浓度悬浮，并且以50μl引入到具有测试溶液的每个孔中。将板在37℃下在co2培养箱中温育20-24小时。使用活体染色剂阿尔玛蓝(alamarblue)测量活细胞数。温育完成后，将20μl阿尔玛蓝试剂加入到分析物板的每个孔中，然后将板在定轨振荡器上在室温下振荡5分钟。将板在37℃下温育16-20小时。使用fluoroskanascentfl设备在544/590nm的激发/发射波长下以相对荧光单位评估荧光读数。对于数据分析，使用microsoftexcel对荧光信号以及测试和标准样品的浓度绘制依存图。
图12中的表示出了32种突变体三特异性抗体的拮抗活性与未突变的变体mabc和单特异性抗tnfα抗体阿达木单抗相比的比较分析的结果。基于此分析，选择了六种最佳变体，并且测试以确定最佳三种：mab12(ed50＝4ng/ml)，mab31(ed50＝20ng/ml)和mab32(ed50＝4ng/ml)。图13示出了这些变体相对于对照的比较分析图。基于此分析，已选择mab12变体用于后续程序，并且命名为bcd-121。
此外，使用相同的方法，将三特异性候选物bcd-121与两种抗tnfα单特异性抗体英夫利昔单抗和阿达木单抗相比较。结果证实bcd-121表现出比阿达木单抗(5倍过量)和英夫利昔单抗(10倍过量)更好的拮抗活性，ec50为6ng/ml(图14)。
实施例12：三特异性抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子抑制il-17a依赖的il-6产生的比较分析
在人重组il-17a和tnfα的存在下，使用il-17a诱导人ht1080细胞系(atcc：ccl-121)产生il-6的能力，分析三特异性候选物bcd-121(参见实施例10)的中和活性。细胞在添加有10％灭活的胎儿血清、谷氨酰胺和庆大霉素的dmem培养基中生长。将细胞以每孔5×104加入96孔平底细胞培养板并且留置5小时以附着。将40ng/ml的重组il-17a的混合物与抗体的稀释液一起在37℃下温育一小时。然后将细胞因子/抗体混合物加入细胞中并且留置过夜。ht1080细胞培养物中il-6的产生与il-17a的加入量成比例。使用“duosetelisadevelopmentsystemhumanil6”通过elisa确定细胞上清液中释放的il-6的量(r&dsystem,cat.no.dy206)。结果显示在图15中。再生的抗tnfα单特异性抗体阿达木单抗用作阴性对照，并且抗il-17a单特异性抗体bcd-085用作阳性对照(biocad)。从图中可以看出，阿达木单抗不抑制il-6的产生，而bcd-085抑制il-6的产生，ic50为约9.2ng/ml，bcd-121抗体有利地抑制il-6的产生，ic50为3.5ng/ml。因此，候选抗体bcd-121是该测定中il-6产生的最有效的拮抗剂。
实施例13：由三特异性抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子bcd-121抑制双重il-17a/tnfα依赖的il-6产生的比较分析
在人重组il-17a和tnfα的存在下，使用il-17a或双重il-17a/tnfα诱导人ht1080细胞系(atcc：ccl-121)产生il-6的能力来分析三特异性结合分子候选物bcd-121(参见实施例10)的中和活性。细胞在添加有10％灭活的胎儿血清、谷氨酰胺和庆大霉素的dmem培养基中生长。将细胞以每孔5×104个加入96孔平底细胞培养板中。将细胞留置五小时以附着。将40ng/ml的重组il-17a和20ng/ml的tnfα的混合物与抗体的稀释液在37℃下温育一小时。然后，将细胞因子和抗体的混合物加入细胞中并且留置过夜。ht1080细胞培养物中il-6的产生与加入的il-17a的量成比例。细胞上清液中释放的il-6的量通过elisa,使用“duosetelisadevelopmentsystemhumanil6”来确定(r&dsystem,cat.no.dy206)。在图16中示出结果。使用再生的抗tnfα单特异性抗体阿达木单抗和抗il-17a单特异性抗体bcd-085(biocad)作为对照。从图中可以看出，与单特异性抗体相比，bcd-121三特异性抗体显示出有利的效果，显示的ic50值为约25pm，并且在较低平台处il-6的量几乎检测不到。相比之下，对照抗体阿达木单抗具有的ic50值为约100pm。bcd-085显示出相似的ic50值，为约25pm，但具有bcd-12120倍大的较低阈值平台。因此，bcd-121是所用测定中il-6产生的最有效的拮抗剂。
实施例14：jurkat-tmtnfα细胞中三特异性抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子bcd-121的抗体依赖的细胞的细胞毒性(adcc)的分析
为了用于在以下定量测定中使用，从烧瓶中收集jurkat-tmtnfαcl.8细胞培养物，并且以200g离心5分钟。滗析上清液，并且在培养基中再洗涤一次用于定量测定。
将细胞沉淀物悬浮在5ml培养基中用于定量测定。确定细胞活力和数量。以3×105个细胞/ml制备用于接种白色96孔培养板的细胞悬浮液。
将测试样品稀释到96孔板的孔中。在具有测试样品的孔中，加入jurkat-tmtnfαcl.8细胞悬浮液，并且将板在co2培养箱中温育15-30分钟。
制备具有7.5x106个细胞/ml的浓度的pbmc细胞的悬浮液，并且加入到具有测试样品的孔中。将板在37℃下在co2培养箱中温育四小时。
将测定缓冲液与来自于集合“cytotox-glotmcytotoxicityassay”的aaf-glotm底物混合，然后加入具有测试样品的每个孔中。将板在室温下温育15分钟。在fluoroskanascentfl设备上测量发光。通过该方法，确定细胞内蛋白酶的活性；发光信号与裂解细胞的数量成比例。
如图17所示，bcd-121表现出的adcc活性比igg1衍生的抗体阿达木单抗和英夫利昔单抗小大约100倍，并且该活性水平与塞妥珠单抗(fab-peg)相当。
实施例15：jurkat-tmtnfα细胞中三特异性抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子bcd-121的补体依赖的细胞毒性(cdc)的分析
在96孔板中滴定抗体的测试溶液，从15μg/ml的浓度，以2为增量，每孔50μl。将人补体在冷却培养基中1:3溶解用于分析(1％bsa的rpmi)，并且将50μl加入到具有测试样品的孔中。将50μl的jurkat-tmtnfα细胞悬浮液加入到具有浓度为1×106个细胞/ml(每孔5×104个细胞)的样品的每个孔中。将板在室温下在定轨振荡器上振荡3min，并且在37℃的co2培养箱中放置2-3小时。使用活体染色剂阿尔玛蓝测量活细胞数。温育完成后，将15μl阿尔玛蓝试剂加入到分析物板的每个孔中，然后将板在定轨振荡器上在室温下振荡5分钟。将板在37℃下温育18至24小时。使用fluoroskanascentfl设备在544/590nm的激发/发射波长下以相对荧光单位评估荧光读数。
如图18所示，bcd-121在jurkat-tmtnfαcl.8细胞中没有与igg1衍生的抗体阿达木单抗和英夫利昔单抗可比的cdc活性，并且其活性水平与塞妥珠单抗(fab-peg)相当。
实施例16：使用octetred96设备分析bcd-121与人il-17a和人tnfα的同时相互作用
通过octetred96设备(pall-fortebio)使用经典“夹心”分析方法进行bcd-121与人il-17a和人tnfα同时结合的分析(图19)。使用含有0.1％吐温20和0.1％bsa的pbs作为运行缓冲液在30℃下进行分析。在实验期间，将第一抗原(il-17a-生物素)固定在链霉抗生物素蛋白包被的传感器上，浓度为20μg/ml且体积为200μl/孔。将另外的传感器浸入浓度为20μg/ml的抗体的200μl/孔的抗体溶液中。随后将传感器浸入浓度为1mg/ml的200μl/孔的tnfα溶液中，并且浸入不含蛋白质的生理盐水中。
使用octetdataanalysis(版本7.0)根据标准程序分析减去基线信号的结合曲线。
图19中所示的传感图表明三特异性结合分子bcd-121可以同时结合il-17a和tnfα。
实施例17：使用biacoret200设备分析bcd-121与直系同源il-17a和tnfα配体的结合
使用由sinobiologics生产的il-17a和tnfα制剂，使用夹心方法进行分析。活化芯片后，单个配体非特异性地(通过nh2基团)固定化在生物传感器表面上，浓度为20μg/ml。然后以从1至25μg/ml的浓度进行抗体的加载。此后，将传感器浸入运行缓冲液中用于复合体解离步骤。流速为10μl/min。
使用biaevolution3.1软件和异种配体模型进行获得数据的分析。
表3显示了bcd-121与来自人和灵长类动物的直系同源il-17a和tnfα配体相互作用的数据。bcd-121对所有配体表现出非常高的亲和力(低于pm)。
表3.bcd-121对il-17a、il-17f和tnfα的亲和力
*——低于biacoret200设备的阈值灵敏度
实施例18：bcd-121与各种il-17家族抗原(a、b、c、d、e、f和a/f)之间相互作用的酶免疫测定
elisa用于测量bcd-121与人il17家族抗原的比较结合。对于结合分析，elisa板的孔(来自greinerbioone的中等结合力表面)分别包被有浓度为1μg/ml(在1×包被碳酸盐缓冲液中)的50μl人il-17a、il-17b、il-17c、il-17d、il-17e、il-17f或il-17a/f(r&dsystems)，气密密封，并且在4℃下温育过夜。所有后续步骤均通过标准eia方案进行。为了阻断非特异性结合，加入封闭缓冲液bb(200μlpbs中的0.5％脱脂乳)。将板在振荡器上在室温下温育一小时。用pbs-吐温洗涤后，以pbs-吐温中的5μg/ml的浓度向每个孔中加入50μl测试抗体。将板再次在室温下振荡温育一小时，然后用pbs-吐温缓冲液洗涤板的每个孔三次。洗涤后，以pbs-吐温中1:5000的比例加入人抗fabhrp缀合的二级抗体(50μl/孔)(来自pierce-thermoscientific)。如上所述，将板在旋转振荡器上振荡(50min，室温)并且用pbs-吐温缓冲液洗涤三次。通过加入tmb(50μl/孔)直至饱和(平均3-5分钟)来显示色度信号，然后通过加入终止溶液(30l/孔，10％硫酸)来停止进一步的显色。使用合适的读板器(tecan-sunrise；tecan)在450nm下测量色彩信号。抗体结合的程度与色彩信号产生成比例。
bcd-121与人il-17家族的成员相互作用的结果呈现在图20中。从对于bcd-121的光学吸收浓度的曲线可以看出，三特异性结合分子以高亲和力与il-17a和il-17f特异性相互作用，并且以低亲和力与它们的天然异二聚体il-17a/f相互作用。bcd-121不与该家族的其他成员交叉反应。
实施例19：bcd-121与豚鼠、兔和小鼠tnfα相互作用的酶免疫测定
使用与实施例16中所述的方案类似的方案进行elisa测定。人、豚鼠、兔和小鼠tnfα抗原来自r&dsystems。
bcd-121与人、豚鼠、兔和小鼠tnfα相互作用的结果显示在图21中。从对于bcd-121的光学吸收-浓度的曲线可以看出，三特异性结合分子仅与人tnfα特异性并且具有高亲和力地反应。bcd-121不与tnfα直系同源物交叉反应(灵长类动物tnfα直系同源物除外，如实施例17中所示)。
实施例20：通过使用动态光散射法(dls)评估蛋白质聚集点来确定热稳定性。
在zetasizernanozsp设备上进行样品(1mg/ml)的聚集点的确定。将0.5ml溶液置于无尘石英比色皿中，其在装置中以1.5℃的步进从50至85℃逐渐加热。将每个温度保持30秒，同时恒定测量散射光强度。在角度θ＝173°检测散射光的强度。
使用动态光散射法获得的四种不同缓冲液中的蛋白质聚集点的数据显示在图22和表4中。
表4.通过动态光散射测量的bcd-121聚集点
实施例21：通过热应力50℃的方法确定长期暴露期间的热稳定性。
将浓度为～5mg/ml的蛋白质样品分成每份200μl的3部份，并且置于单独的试管中：将用于每种组合物的1个试管储存在+4℃的冰箱中，并且另外两个放置在试管加热器中并且分别在50℃温育6和24小时。升温后，将试管从加热器中取出，允许在室温下静置15min，以8000rpm离心5分钟，并且转移上清液用于带有用uv检测器的凝胶过滤。
使用用于尺寸排阻色谱的研究标准(bio-rad；cat.号151-1901)。在图23的表中显示了在50℃的长时间加热下各种缓冲液中对于bcd-121稳定性的数据。
结果显示，所有测试的缓冲液均提供令人满意的bcd-121热应力稳定性。
实施例22：用于生产bcd-121的稳定细胞系的生成
使用neon转染系统(lifetechnologies)浆状亲本细胞系cho-s载体构建体(其含有优化比例的轻和重抗体链)通过电穿孔转染获得用于bcd-121的稳定生产株细胞系。使用clonepix机器人平台(moleculardevices)获得具有高生产力(高达1000mg/l)的克隆系，并且使用各种培养形式的抗生素进行微集群(minipool)选择的初步阶段。使用分析系统octetred96(palllifesciences)进行生产力分析。对基础培养基和培养方案的选择的doe是使用自动化系统biomekfx机器人技术(beckmancoulter)实施的。为了培养生产细胞，使用不含动物蛋白质的无血清培养基和配合物。用于临床前研究的bcd-121的积累在hyclone单独使用生物反应器(thermofisherscientific)中进行，具有的工作容积为50l。
实施例23：从生产稳定的细胞系环境中分离bcd-121
含有bcd-121的培养液的澄清在深床过滤器millistakc0hc(merck-millipore)上进行。使用特异性靶蛋白质，在蛋白质a的亲和树脂上进行一级抗体纯化，并且用ph3.3-3.8的甘氨酸缓冲液洗脱抗体。将洗出液在酸性ph下温育30-60分钟用于病毒灭活，并且然后用1mtris-oh的溶液中和。在吸附剂chttm陶瓷羟磷灰石(bio-rad)上进行最终的色谱纯化，以去除残留的dna、蛋白质产生细胞、裂解的配体亲和吸附剂聚集体和抗体片段。对于该方法，将蛋白质溶液施加于在ph7.5下制备的吸附剂，然后用氯化钠的特异性洗脱梯度。使用一组viresolvepro过滤器(merckmillipore)从纯化的蛋白质中过滤掉病毒。将蛋白质以切向流在截留极限为50kda的胶带上浓缩，然后用含有乙酸盐缓冲液(ph5.0)、山梨糖醇和聚山梨醇酯-80的最终缓冲液透析过滤。最终溶液中的蛋白质浓度至少为70mg/ml。
纯化结果呈现于图24中。在还原和非还原条件下使用sds的聚丙烯酰胺凝胶的垂直电泳证明了产物的纯度，其足以用于药物组合物中。
实施例24：酶免疫测定显示纯人血清中bcd-121的稳定性
为了估计bcd-121在纯人血清中的稳定性，将三特异性抗体以2、10和50μg/ml的浓度加入到从七个健康供体获得的纯人血清混合物中，用0.01％硫柳汞保存，并且在37℃下储存7天。7天后，通过elisa以两种测定形式测量bcd-121的浓度：使用链霉抗生物素蛋白-hrp缀合物的固定化的tnfα和生物素化的il17形式的检测以及使用山羊抗人iggfc-hrp缀合物的固定化的tnfα形式的检测。将在elisa测量之前立即加入bcd-121至浓度为2,、0和50μg/ml的血清样品用作对照。测量如下进行：将对照和储存的具有2、10或50μg/mlbcd-121的血清样品稀释至100ng/ml(分别为20、100和500倍)，并且根据溶于pbs-吐温的标准校准曲线(从6.25至200ng/ml)测量实际浓度。所有elisa步骤均通过标准eia方案进行。将100μl稀释的样品或校准标准品加入预先包被有tnfα的微孔中。在ph9.5的20mm碳酸盐缓冲液中，包被的tnfα的浓度为2μg/ml。然后将封闭缓冲液(bb：pbs中的200μl0.5％的脱脂乳)加入板中。将板在振荡器上在室温下温育一小时。用pbs-吐温洗涤后，每个孔加入100μl生物素化的il17(3μg/ml)或山羊抗人iggfc-hrp(来自sigma，比例为1:20000)，为pbs-吐温中的浓度。将板再次在室温下振荡温育一小时，然后用pbs-吐温缓冲液洗涤板的每个孔三次。将100μl比例为1:20000的链霉抗生物素蛋白-hrp缀合物(sigma)另外加入到其中预先加入生物素化的il17的孔中。在随后温育一小时并且洗涤后，通过加入tmb(100μl/孔)直至饱和(平均10-15分钟)来显示色度信号，然后通过加入终止溶液(50μl/孔，10％硫酸)来停止进一步的显色。使用合适的读板器(tecan-sunrise；tecan)在450nm下测量色彩信号。bcd-121结合的量与色彩信号产生成比例。将校准曲线浓度乘以稀释因子，并且表示为理论上加入血清bcd-121浓度的％。
实施例25：评估bcd-121抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子在体内的有效性
以下研究是使用胶原蛋白诱导性关节炎模型对雄性猕猴猴类(食蟹猕猴(macacafascicularis))进行的。实验中的动物总数为20只，分成五组，每组四只猴子。在实验中，使用了产品的四个剂量：0.2mg/kg；1.0mg/kg；5.0mg/kg；和10.0mg/kg。对照组动物接受安慰剂。在用胶原蛋白初步致敏后开始给药产品和安慰剂。在该研究期间，测量所有组的动物以计算apw的关节面。在研究的最后，采用掌指关节和跖趾-趾骨关节来评估破坏性变化的严重性。在以下表5中示出了对于实验组的概要。
表5.
为了诱导关节炎，向动物施用牛ii型胶原蛋白(sigma)的乳剂三次。
胶原蛋白的首次施用：
施用的胶原蛋白的总量为每实验动物2mg。为此目的，将2mg胶原蛋白溶解于0.7ml的0.1m乙酸中。向该溶液中加入0.7ml完全弗氏佐剂。
首次施用胶原蛋白后，将动物饲养28天。
胶原蛋白的第二次施用：
施用的胶原蛋白的总量为每实验动物3mg。为此目的，将3mg胶原蛋白溶解于1ml的0.1m乙酸中。向该溶液中加入1ml完全弗氏佐剂。
第二次施用胶原蛋白后，将动物饲养21天。
胶原蛋白的第三次施用
施用的胶原蛋白的总量为每实验动物3mg。为此目的，将3mg胶原蛋白溶解于1ml的0.1m乙酸中。向该溶液中加入1ml完全弗氏佐剂。
在以下时间点通过分规/分割器进行关节尺寸的测量：
·在首次施用胶原蛋白之前；
·在第二次施用胶原蛋白的时候；以及
·第二次给药后的每周，在施用胶原蛋白之前即刻，持续7周。
在测量过程期间，估计关节的纵轴和横轴。除拇指外，对所有掌指关节和跖趾关节进行了该程序。面积的计算通过以下公式进行：
ja＝纵轴的值×横轴的值×3,14×0,25。
对每只动物的16个关节的数据用于计算炎症面积(pia)的百分比。该计算通过以下公式进行：
实验当天的ja值×100
关节炎诱导前ja的平均值
结果如图26所示，证明了bcd-121在猴子cia模型中的剂量依赖的抗炎作用。
实施例26：评估bcd-121抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子的毒代动力学
对食蟹猴(猕猴)进行毒代动力学测定。该研究使用了三种剂量水平的bcd-121产品。在以下表6中示出实验组的概要。
表6.
在研究过程中，评估了以下参数：
-临床检验结果；
-动物的重量(给药前和实验的第7、14、21、28、35、和42天)；
-体温(给药前和在实验第7、14、21、28、35和42天的给药后1、2、4、6和24小时)；
-尿液分析(给药前和实验的第7、14、21、28、35、和42天)；
-对参数的临床血液分析：红细胞数、白细胞数、血红蛋白浓度(给药前和实验的第7、14、21、28、35、和42天)；
-血清比率的生化分析：ldh、总胆红素、总蛋白质、葡萄糖、天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶(给药前和实验的第7、14、21、28、35、和42天)；和
-灵长类动物的血清中的药物浓度(给药后0.5、1、3、6、24、30、48、72、96、120、144、168、192、264、336、408、504、624、720、816、912和1008小时)。
使用elisa和辣根过氧化物酶作为指示酶评估血清中药物的水平。
用重组人tnfα(r&dsystems，catn210-ta/cf)致敏96孔微量滴定板(“costar”,cat.no.3590)的孔，基于每孔250ng/100μl的ph9.020mmtrishcl缓冲溶液，并且在4°с下温育16-18小时。从孔中去除未被结合的抗原。为了阻断非特异性结合位点，将ph7.2-7.4(tb)，200μl含有1.0％bsa、0.14mnacl和0.05％吐温20的20mmtrishcl缓冲溶液(封闭缓冲液-bb)引入到每个孔中，并且然后将孔在37℃下温育30分钟。去除bb溶液，并且将用bb稀释1000-10000倍的100μl测试血清引入到每个孔中。同时，将100μl含有范围为3.9-250ng/ml的不同浓度的bcd-121的bb引入到每个孔中。将板在37℃下温育30分钟。去除孔内容物，孔用含有0.05吐温20的200μltb各洗涤3次，将含有用辣根过氧化物酶标记的针对人iggfc片段的抗体的100μlbb(《sigma》,usa,cat.no.a0170,以工作稀释度)引入到每个孔中，并且将孔在37℃下温育30分钟。去除孔内容物，孔用含有0.05吐温20的200μltb各洗涤4次，并且将含有0.1mg/ml四甲基联苯胺和0.003％h2o2的100μlph5.0的0.1m乙酸钠缓冲溶液引入到每个孔中。为了淬灭反应，将50μl的2mh2so4引入到每个孔中，然后使用板分光光度计在450nm下测量孔中吸光度。
为了确定测试样品中bcd-121的浓度，绘制参考标准中bcd-121的吸光度和浓度之间关系的校准曲线，并且使用用测试样品获得的吸光度值，确定bcd-121的浓度。
可靠的bcd-121检测的下限为2ng/ml。根据以下公式计算测试血清中bcd-121的浓度(х)，以μg/ml计，：
x＝a×f
其中，a——使用校准曲线确定的测试样品中bcd-121表的浓度，ng/ml；
f——初始血清的稀释度；
pk曲线的结果证明了bcd-121的预期水平(图27)。终末处置半衰期计算超过12天。获得的猴子中bcd-121的pk曲线与天然人igg抗体的pk曲线相似，并且具有典型的剂量依赖的特性。
实施例27：对于猕猴猴类重复的皮下给药一个月，接着是免于给药一个月的时间段的毒性的评估
在爪哇猕猴上进行重复的皮下给药bcd-121一个月，接着是一个月的恢复期的毒性测定。在实验中使用三个剂量水平。在以下表7中示出实验组的概要。
表7.
在研究过程中，评估了以下参数：
-临床检验结果；
-动物重量(给药前和然后每周一次)；
-体温(给药前和然后每周一次，直到实验终止)；
-对心血管系统的影响，使用poly-spectrum系统评估心脏的生物电活动；评估在给药前以及然后在实验的第3、5和7周进行；
-尿液分析(给药前和实验的第3、5和7周)；
-对参数的临床血液分析：红细胞数、白细胞数、血红蛋白浓度、淋巴细胞数、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的数量以及血小板计数(给药前，然后从实验的第一周开始每周一次)；
-以下方面对血液凝血系统影响的评估：活化部分促凝血酶原激酶时间，纤维蛋白原浓度和凝血酶原时间(给药前，然后在实验的第3、5和7周)；
-血清比率的生化分析：钠、钾、肌酸酐、尿素、碱性磷酸酶、ldh、总胆红素、总蛋白质、葡萄糖、甘油三酯、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、总胆固醇(给药前，以及在实验的第3、5和7周)；
-在给药期结束时，对伴随组3*的动物实施安乐死并且随后病理检查；在研究结束时，第3组和对照组的动物经历相同处理；
-作为毒性研究的一部分，还通过选择注射部位的软组织并且进行组织学检查来评估了局部刺激性药物的影响。
实施例28：探究bcd-121抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子的免疫毒性
对爪哇猕猴进行重复的皮下给药1个月，随后一个月恢复期的免疫毒性测定。在实验中使用三个剂量水平。在下表8中示出实验组的概要。
表8.
在研究过程中，评估了以下参数：
-淋巴细胞的亚群组成，其在给药前，以及然后在实验的第2、4和6周评估；
-免疫球蛋白类比率，其在给药前以及在实验的第2、4和6周评估；
-对吞噬作用的影响，在给药前以及然后在实验的第2、4和6周评估。
实施例29：对重复的皮下给药bcd-121抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子的免疫原性的评估
对爪哇猕猴进行重复的皮下给药1个月，随后一个月恢复期的免疫毒性测定。在实验中使用三个剂量水平。在以下表9中示出实验组的概要。
表9.
在给药前以及然后在实验的第3、5和7周，选择并且分离血液血清，以在抗体结合的水平上进行免疫原性测定。
实施例30：在重复的皮下给药bcd-121抗il-17a/抗il-17f/抗tnfα结合分子期间的药代动力学测定
对爪哇猕猴进行重复的皮下给药一个月，随后一个月恢复期的药代动力学测定。使用三个剂量水平。在以下表10中示出实验组的概要。
表10.
为了估计产品水平，在实验的第0、1、2、8、9、15、16、22、23、29、36和43天进行血液取样。
表11：seqidno图表
序列表
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