一种肉苁蓉产品中掺杂锁阳的鉴定方法与流程

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种肉苁蓉产品中掺杂锁阳的鉴定方法。

背景技术：

肉苁蓉为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉Cistanche deserticola Y.C.Ma或管花肉苁蓉Cistanche tubulosa(Schenk)Wight的干燥带鳞叶的肉质茎。春季苗刚出土时或秋季冻土之前采挖，除去茎尖，切段，晒干。肉苁蓉素有“沙漠人参”之称，在《神农本草经》中被列为上品，具有补肾阳，益精血，润肠通便的作用。用于肾阳不足，精血亏虚，阳痿不孕，腰膝酸软，筋骨无力，肠燥便秘。现代医学研究发现，肉苁蓉还在增强记忆力，提高机体耐力，调节内分泌，保肝，治疗各种机能性障碍，特别是性机能障碍和健忘症等方面具有功效，并提取出了其主要药效成分聚丙烯酰胺(PhGs)和肉苁蓉苷。肉苁蓉除入药外，国内外已经开发了多种以肉苁蓉为主要成分的保健食品，如肉苁蓉口服液、苁蓉酒、苁蓉烟等。肉苁蓉还作为常见的出口药材，远销日本、韩国等。由于其广阔的应用前景，近年来价格不断上涨，掺伪现象频出，市场最常见的伪品为锁阳(Cynomorium songaricum)，锁阳为锁阳科锁阳属多年生肉质寄生草本，文献中多采用性状、显微和理化鉴别等方法对二者进行鉴别。而由于鉴定特征缺失，尚无肉苁蓉中成药中掺杂锁阳的研究报道。

本研究拟以DNA条形码为手段鉴定各种肉苁蓉产品，但实验过程中发现市售药材及中成药存在蒸煮、加工工艺繁杂及保存时间较长等问题导致DNA降解，使PCR扩增困难且扩增序列较长易影响测序质量。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷，提供一种结果准确灵敏，方法简便快速的判断肉苁蓉产品中是否掺杂锁阳的方法。

为达到以上目的，本发明在对大量的样品的筛选过程中，寻找出能够将肉苁蓉产品中鉴定出来的锁阳的特异分子身份证序列，并提供了对肉苁蓉产品鉴别较为快速，简便，廉价的方法。

本研究在大样本量数据分析的基础上，开发了一个30bp的锁阳特异的分子身份证序列，BLAST结果表明，此段序列为锁阳所特有，如图1中所示，以此30bp序列进行BLAST，得到序列覆盖度及相似度为100％的结果有且仅有锁阳，即若ITS2序列中存在该30bp短序列，可判断为锁阳，反之，则不是锁阳。

具体的，本发明首先提供了一种锁阳分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

优选的，所述分子身份证为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种肉苁蓉产品中掺杂锁阳的分子鉴定方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子身份证。当存在所述分子身份证时，鉴定待测样品中存在锁阳成分。

可选的，所述方法包括如下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证。

本发明对于PCR所使用的引物无特别的限制，只要能够对所述分子身份证进行扩增即可，为了获得最佳的鉴定效果，所述PCR扩增使用的引物为：

SYF1 5′-CTCAATGTGCTGCTGCTT-3′(SEQ ID No.2所示的核苷酸序列)，

SYR1 5′-AGACTTACCGCTCACAATG-3′(SEQ ID No.3所示的核苷酸序列)。

可选的，所述PCR扩增的反应程序为：

94℃，3min

72℃，5min。

可选的，所述PCR扩增的反应体系为：

PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 5μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

其中，所述待测样品包括肉苁蓉及含肉苁蓉的产品。

所述待测样品的形式可以为植株、药材及中成药，利用本发明所提供的方法可以对因加工而难以通过形态学鉴定进行区分的检测对象是否掺有锁阳进行准确的鉴别，例如可以对粉末形式的样品及中成药样品进行鉴定，以判断是否含有锁阳。

用于扩增本发明所述锁阳分子身份证的特异性引物对属于本发明的保护范围。

本发明提供了所述方法或所述的分子身份证或上述特异性引物对在鉴定锁阳中的应用。

本发明提供了所述方法或所述的分子身份证或上述特异性引物对在鉴定肉苁蓉产品中掺杂锁阳的应用。

利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的将锁阳从肉苁蓉产品中鉴定出来，本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能够提取出DNA的肉苁蓉任何样品。因此，能够实现肉苁蓉药材、粉末、中成药的快速准确鉴定。

开发短的分子身份证序列的优势在于：1)短序列易扩增，适合DNA已降解的中成药或中药材及粉末的鉴定；2)准确性高，锁阳ITS2全长为247bp，在GenBank中锁阳ITS2正确序列共有11条，且均含有该30bp的分子身份证序列，即该分子身份证与锁阳的相似度为100％。因此，该分子身份证序列可以用来鉴定商品肉苁蓉药材、粉末、中成药中是否掺杂混淆品锁阳。

附图说明

图1锁阳种内短序列align图。

图2应用锁阳特异分子身份证的序列BLAST结果图。包含5‘-CAATTATTTGAGGTGCATTGTAAGAAGCGT-3’的比对图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的生化试剂为市售。

实施例1锁阳分子身份证的确定

在大样本量数据分析的基础上，开发了一个30bp的锁阳特异的分子身份证序列，BLAST结果表明，此段序列为锁阳所特有，如图1中所示，以此30bp序列进行BLAST，得到序列覆盖度及相似度为

100％的结果有且仅有锁阳，即若ITS2序列中存在该30bp短序列，可判断为锁阳，反之，则不是锁阳。

锁阳分子身份证，其为如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。应用锁阳特异分子身份证的序列BLAST结果见图2。

表1锁阳(Cynomorium songaricum)GenBank号信息表

表2锁阳(Cynomorium songaricum)样品信息表

实施例2肉苁蓉中成药中鉴定是否掺杂锁阳的方法的建立

1)从北京、四川成都、广东深圳，山东德州等市各大药店及网上药店购买含肉苁蓉中成药27份，每管分别取40mg样品，在MM 400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA，提取时十管样品洗脱为一管DNA。

表3肉苁蓉中成药信息表

2)PCR扩增

引物序列为SYF1：CTCAATGTGCTGCTGCTT；SYR1：AGACTTACCGCTCACAATG，由赛百盛基因技术有限公司(北京)合成。引物用无菌去离子水溶解并稀释至2.5μmol/μL。

25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 5μL(约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：94℃，3min；94℃，15s，51℃，15s，72℃，25s，共40个循环，72℃，5min。

3)测序

PCR产物直接送至中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物为SYF1和SYR1。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。

4)序列拼接

本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 3.7.1(CodonCode Co.,Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的剩余部分需大于123bp，且平均Q值大于等于30。

5)序列比对

用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中锁阳ITS2序列进行比对，其中13份肉苁蓉中成药样品的序列包含5’-CAATTATTTGAGGTGCATTGTAAGAAGCGT-3’，而其他14份样品不包含此段序列。由于此段序列可特异性地用于锁阳的鉴定，表明13/27份肉苁蓉中成药中掺杂锁阳。因此，该方法可以实现对含肉苁蓉中成药的鉴定。

实施例3肉苁蓉粉末的鉴定

采用与实施例2相同的方法进行鉴定，所不同的是以含肉苁蓉粉末为样品，从安徽亳州药材市场共收集到肉苁蓉粉末共计7份，提取DNA，进行鉴定，所有肉苁蓉粉末样品序列中均能特异性地检测到锁阳分子身份证，表明所有7份肉苁蓉粉末样品中均掺杂锁阳。因此，该方法可以实现对含肉苁蓉粉末的鉴定。

表4肉苁蓉粉末信息表

实施例4肉苁蓉饮片的鉴定

采用与实施例2相同的方法进行鉴定，所不同的是以肉苁蓉饮片为样品，从北京某药店购买肉苁蓉饮片8份，提取DNA，进行鉴定，其中1份肉苁蓉饮片样品序列中能特异性地检测到锁阳分子身份证，表明该份肉苁蓉饮片样品中掺有锁阳，因此，该方法可以实现对肉苁蓉饮片的鉴定。

表5肉苁蓉饮片信息表

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院药用植物研究所

<120> 一种肉苁蓉产品中掺杂锁阳的鉴定方法

<130> KHP161119249.4C

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 锁阳

<400> 1

caattatttg aggtgcattg taagaagcgt 30

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcaatgtgc tgctgctt 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agacttaccg ctcacaatg 19