一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于水产动物育种领域，具体涉及一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记及其应用。

背景技术：

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，又称南美白对虾(white Pacific shrimp)，是我国乃至世界养殖产量最高的对虾品种，也是世界重要的经济贸易品种。由于其生长速度快、抗病力强，且经过淡化后可以在内陆低盐度甚至淡水区域养殖，因此该品种在我国的南北方和沿海内陆地区广泛养殖，我国每年的产量达100多万吨。

良种是凡纳滨对虾产业健康发展的基础和推动力，人工选育是培育生长速度快、成活率高的凡纳滨对虾良种的重要方法，然而，人工选育的周期长，成本高，且选择准确率易受到环境等外界因素的影响。分子标记辅助育种是指通过QTL定位或者关联分析的方法，挖掘出与性状直接相关的分子标记，实现对目标性状的直接选择，可以极大地提高选育效率和准确率。在对虾中，研究人员通过QTL定位方法定位到了若干生长相关的QTL位点，如在在日本对虾生长速度QTL定位中，研究人员定位到了一个与生长性状相关的主效AFLP标记，之后通过图位克隆的方法找到一个与生长相关的基因ELOVL(Elongation of very long chain fatty acids-like)(Lyons RE,Dierens LM,Tan SH,Preston NP,Li Y.Characterization of AFLP markers associated with growth in the kuruma prawn,Marsupenaeus japonicus,and identification of a candidate gene.Mar Biotechnol,2007,9：712-721)，在凡纳滨对虾QTL定位中，也发现了生长相关的QTL位点(Andriantahina F,Liu X,Huang H.Genetic map construction and quantitative trait locus(QTL)detection of growth-related traits in Litopenaeus vannamei for selective breeding applications.PLoS One,2013,8:e75206)，但是并没有定位到与生长直接相关的基因或标记。因此在本发明旨在提供一种与生长性状显著相关的标记，该标记可以用作凡纳滨对虾生长性状的辅助选育。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种与凡纳滨对虾生长相关的分子标记，并应用于对虾生长快品种的辅助培育。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种与凡纳滨对虾生长相关的分子标记，与对虾生长性状显著相关的分子标记位于SEQ1286DNA序列的109bp位置，该标记为T/C型SNP标记。

进一步，一种用于检测所述的与对虾生长相关的分子标记的引物对，其特征在于：引物对为：

M1286F：GCGGGTCTTTTCCTCCTTCT

M1286R：GCCCATCTTCGCACTTCTTTC

进一步地，与对虾生长相关的分子标记的应用，CC基因型个体的生长速度高于TT基因型，在对虾育种过程中，通过SNP分型方法将该标记分型后，选择CC基因型个体进行留种，能够辅助实现生长性状的选择。

本发明所具有的优点：本方法提供的生长相关的分子标记能够从分子水平上对生长快个体进行选择，不受外界环境及个体大小的限制，能够在早期对生长快个体进行选择，提高选择的效率和准确率。

附图说明

图1 M1286-109-T/C位点三种基因型在家系分组1中体重箱线图(箱体中间线代表体重中值，箱体的上顶代表75％分位数，箱体下边缘代表25％分位数)。

图2 M1286-109-T/C位点三种基因型在家系分组2中体重箱线图(箱体中间线代表体重中值，箱体的上顶代表75％分位数，箱体下边缘代表25％分位数)。

具体实施方式

实施例1：凡纳滨对虾生长相关分子标记的获得

(1)凡纳滨对虾生长QTL定位：

用于QTL定位的材料为1个全同胞家系材料，由父本材料、母本材料和对应的子代构成。该材料于2012年6在广西水产所防城港SPF南美白对虾育种基地构建，子代生长至10cm左右时随机取样250个子代，子代取样时使用电子天平测量体重，使用直尺和游标卡尺测量体长、头胸甲长、第三腹节宽、第三腹节高、第一腹节宽、第一腹节高的数据，并进行性别的判定。

使用植物基因组提取试剂盒(天根，北京)提取所有材料DNA，之后采用SLAF-seq的方法对所有的个体进行SNP分型，并构建凡纳滨对虾的高密度遗传连锁图谱(Yu Y,Zhang XJ,Yuan JB,Li FH,Chen XH,Zhao YZ,Huang L,Zheng HK,Xiang JH.Genome survey and high-density genetic map construction provide genomic and genetic resources for the Pacific White Shrimp Litopenaeus vannamei.Scientific reports,2015,5,doi:10.1038/srep15612)，利用图谱上的SNP分型数据使用GenABEL软件进行生长性状的GWAS分析，定位生长相关QTL位点(Aulchenko Y.S.,Ripke S.,Isaacs A.,van Duijn C.M.GenABEL:an R package for genome-wide association analysis.Bioinformatics.23：1294-6(2007).)。

(2)生长相关分子标记的获得：

GWAS分析的结果显示高密度连锁图谱上的7号、8号、10号、17号、33号和38号连锁群上的多个标记与体长和体重性状相关(P<0.01)。

从上述QTL区域中，根据GWAS分析的P值，选择候选标记在另外一个独立群体中进行后续的验证分析，筛选生长相关的SNP位点，验证群体中验证的结果显示SEQ1286DNA序列的109bp位置的1个SNP位点与生长显著相关(P<0.05)，CC基因型的生长速度显著高于TT型。

(1)序列特征：

基因组序列：碱基对；类型：核苷酸；链型：双链；拓扑结构：线性

(2)分子类型：DNA

(3)假设：否

(4)反义：否

序列特性名称：mutation，在此位置处，相关品系的序列中具有突然的，可遗传的变化。

来源：凡纳滨对虾

序列表中第109bp位置(即下表中[T/C]处)为：C或者T/C(T和C)序列表中SEQ ID No.1(下称SEQ1286)GCGGGTCTTTTCCTCCTTCTGTGGCTCTTCAGGCGATTCCTCTTCCCCTTCGCCGCGCGGGAGTTCGATCACGTCGGTCTTAGTGCCATCGACGTCGGGGGAAAAAAG[T/C]GGTAAGAGTATTTTCCCAGTCAGCGACGAGAGAGGAAAGAAGTGCGAAGATGGGC

实施例2：一种凡纳滨对虾生长相关标记在育种中的应用。

(1)育种材料的构建

育种材料构建于2015年，选择26个家系进行M1286-109-T/C标记辅助选择育种研究，将26个家系按照建系时间分成两组，每组包含13个家系。在家系材料生长至3cm时，通过VIE荧光标记每个家系材料后混养。养殖3个月后从两个池中随机挑选个体进行表型性状测定，主要包括体重、体长、全长、头胸甲长、头胸甲宽等性状。

(2)M1286-109-T/C标记分型

使用植物基因组提取试剂盒(天根，北京)提取上述家系材料DNA，使用Nanodrop1000测定DNA浓度，之后使用如下引物对扩增每个个体的目标区域序列：

M1286F：GCGGGTCTTTTCCTCCTTCT

M1286R：GCCCATCTTCGCACTTCTTTC

PCR扩增产物使用ABI3730xl测序仪进行一代测序，测序引物为M1286F引物，根据测序峰图对M1286-109-T/C进行分型，如果该位置仅有1个T碱基峰，则分型结果为TT型，若仅有一个C碱基峰，则分型结果为CC型，如果该位置既有T碱基峰又有C碱基峰，则分型结果为TC型。

(3)M1286-109-T/C标记辅助选择

通过分型结果将所有个体分成TT、TC和CC三种基因型，在家系分组1的材料中，三种基因型的个体中，TC基因型的平均均值最高，其次是CC基因型(图1)，说明该C等位基因具有加性效应，同时还存在一定的显性效应；在家系分组2中，CC基因型的平均值最高，其次是TC基因型，该结果显示C等位基因具有较大的加性效应(图2)。因此通过对M1286-109-T/C标记中的C等位基因型进行选择，可以提高育种群体的生长速度。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此在不偏离本发明精神的基础上所做的一些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种凡纳滨对虾生长相关的分子标记及其应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 164

<212> DNA

<213> 凡纳滨对虾

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(164)

<223> n is t、c or tc.

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(91)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (110)..(110)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gcgggtcttt tcctccttct gtggctcttc aggcgattcc tcttcccctt cgccgcgcgg 60

gagttcgatc acgtcggtct tagtgccatc gacgtcgggg gaaaaaagng gtaagagtat 120

tttcccagtc agcgacgaga gaggaaagaa gtgcgaagat gggc 164

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 2

gcgggtcttt tcctccttct 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工设计

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(21)

<400> 3

gcccatcttc gcacttcttt c 21