一种凡纳滨对虾组蛋白抗菌肽及其应用的制作方法

本发明涉及水产养殖的技术领域，尤其涉及一种凡纳滨对虾组蛋白抗菌肽及其应用。

背景技术：

凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)，又称为南美白对虾、万氏对虾，属节肢动物门、甲壳纲、十足目、游泳亚目、对虾科、对虾属、lito-penaeus亚属。在全球形成规模化养殖的对虾品种中凡纳滨对虾的产量占绝对的优势，占全球单品种养殖总产量的75％。伴随着对虾养殖产量的逐年增加，养殖问题也渐渐涌现，其中虾病是对行业的影响是几乎毁灭性的，所以，病害防控技术是养殖环节的关键。主要的病害有三类：对虾白斑综合征、微孢子虫病(ehp)和对虾早期死亡综合征(ems)。近年来抗生素的滥用造成微生物的耐药性、水污染使得开发能代替抗生素的抗菌肽变得尤为重要。

抗菌肽(antibac-terialpeptide)又叫抗微生物肽(antimicrobialpep-tide)、抗生素肽(antibioticspeptide)，是由多种生物细胞特定基因编码经外界条件诱导产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、原虫、抑杀肿瘤细胞等活性作用的多肽。迄今为止，国内外报道大约有2000多种抗菌肽被鉴定、分离出来，以天然抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽已达数千种。在生物界自然存在的抗菌肽根据其结构的不同可以分为四大类：β折叠型抗菌肽、α螺旋型抗菌肽、延伸结构型多肽和loop结构型多肽。

目前，我国对虾养殖业急需解决的共性关键问题包括：对虾传染性疫病的防控、品种的选育、营养研究、养殖环境控制以及对虾加工技术升级等。而要成功解决这些问题，阐明对虾免疫防御机制是前提和基础。有鉴于此，本发明人研究和设计了一种凡纳滨对虾组蛋白抗菌肽及其应用，本案由此产生。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种凡纳滨对虾组蛋白抗菌肽及其应用，通过凡纳滨对虾组蛋白抗菌肽的研究，为寻找新的对虾病害防控、良种选育的策略提供思路，促进我国对虾养殖业的健康、持续发展。

为了解决上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种凡纳滨对虾组蛋白抗菌肽，其氨基酸序列如序列标seqidno：1所示。

作为实施例的优选方式，所述抗菌肽的分子量为1719da。

一种凡纳滨对虾组蛋白抗菌肽的应用，在制备治疗或预防革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌的药物中的应用。

作为实施例的优选方式，所述革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、溶藻弧菌。

作为实施例的优选方式，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、乙型链球菌。

本发明以凡纳滨对虾组蛋白为主要研究对象，通过antibp、campr3、apd3三个在线软件预测可能产生抑菌效果的抗菌肽段，选取最有可能的肽段进一步进行抑菌活性实验。再运用netsurfpver.1.1在线软件对抗菌肽的表面亲和力进行分析，运用swiss-model软件进行3d建模，运用heliquest在线软件分析抗菌肽的理化性质。本发明对抗菌肽h3进行抑菌活性分析，实验结果表明，本发明的抗菌肽h3具有明显抑菌效果，进而为避免抗生素在对虾养殖业中的应用提供了思路。

附图说明

图1为本发明多肽h3对大肠杆菌的抑菌效果图；其中，a：无菌蒸馏水(阴性对照)；b：1mg/ml；c：0.5mg/ml；d：0.25mg/ml；e：0.125mg/ml；f：0.0625mg/ml；g：0.03125mg/ml(最低抑菌浓度)；h：0.0625mg/ml氨苄青霉素(阳性对照)；

图2为本发明多肽h3对溶藻弧菌的抑菌效果图；其中，a：无菌蒸馏水(阴性对照)；b：1mg/ml；c：0.5mg/ml；d：0.25mg/ml；e：0.125mg/ml；f：0.0625mg/ml；g：0.03125mg/ml；h：0.015625mg/ml；i：0.0078125mg/ml(最低抑菌浓度)；j：0.0078125mg/ml氨苄青霉素(阳性对照)；

图3为本发明多肽h3对乙型链球菌的抑菌效果图；其中，a：无菌蒸馏水(阴性对照)；b：1mg/ml；c：0.5mg/ml；d：0.25mg/ml(最低抑菌浓度)；e：0.25mg/ml氨苄青霉素(阳性对照)；

图4为本发明多肽h3对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图；其中，a：无菌蒸馏水(阴性对照)；b：1mg/ml；c：0.5mg/ml；d：0.25mg/ml；e：0.125mg/ml；f：0.0625mg/ml；g：0.03125mg/ml；h：0.015625mg/ml；i：0.0078125mg/ml；j：0.00390625mg/ml(最低抑菌浓度)；k：0.25mg/ml氨苄青霉素(阳性对照)；

图5为本发明h3肽段3d模型；

图6为本发明合成多肽h3的理化性质。

具体实施方式

实施例1凡纳滨对虾组蛋白抗菌肽的预测

在ncbi数据库中查找凡纳滨对虾的组蛋白h4(ncbireferencesequence：np_001011609.1)的氨基酸序列。通过antibpserver、camp、apd3三个在线预测软件，预测对虾组蛋白h4抗菌肽段，结果如表2-1所示，一共预测得到了20条也许具有抑菌活性的小分子多肽，它们的分子量大小范围大致在1.4-2.0kda范围内，其中的4条肽段序列(加粗黑体)或许有抑菌作用。并且得到提示，一部分的小分子多肽序列可能形成α螺旋，一部分多肽序列是富含p或疏水性氨基酸的多肽序列。通过该预测可知合成多肽h3与合成多肽h9的综合得分和可信度相对较高，通过swissmodel软件进行同源建模预测结构，结构预测后推断多肽h3(pairrlarrggvkri)与多肽h9(glgkggakrhrkvlr)是可能具有螺旋结构的肽。本发明合成了多肽h3(tkpairrlarrggvkri)并且进行抑菌活性分析找出其可能存在的抑菌机制。

表1对虾组蛋白h4抗菌肽段的预测

注：①加粗多肽序列：根据其理化性质推测可能有抑菌作用；

②ⅰ：序列可能形成α螺旋；ⅱ：富含p或w疏水性氨基酸的多肽序列。

实施例2凡纳滨对虾组蛋白抗菌降解肽段的抑菌活性分析

2.1实验材料

2.1.1主要材料

该实验中所使用的多肽是来自于北京中科亚光生物科技有限公司(scilightbiotechnology,llc)合成，多肽c端酰胺化、n端乙酰化，纯度>95％。

实验中使用的水产致病菌有革兰氏阳性菌(g+)和革兰氏阴性菌(g-)。g+的代表菌种有乙型链球菌(beta-streptococcus)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)；g-的代表菌种有大肠杆菌(e.coli)和溶藻弧菌(solublev.)。

2.1.2主要试剂

营养肉汤：广东环凯微生物科技有限公司；

lb琼脂：广东环凯微生物科技有限公司。

2.1.3主要仪器设备

生化培养箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司

电热恒温鼓风干燥箱(dhg-9140a)：上海秣马恒温设备厂

艾美特电磁炉(ce2132-z)

电热恒温水浴锅(dk-826)：上海精宏实验设备有限公司

双人双面垂直送风(经济型)净化工作台(sw-cj-2d)：苏州智净净化设备有限公司

电子分析天平(me203/ar1530)：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司

双层大容量全温度恒温培养振荡器(双层全温度恒温摇床)(zhwy-2102)：上海智城分析仪器制造有限公司

高压灭菌锅(kt-30l)：日本alp公司

移液枪：赛默飞世尔(上海)仪器有限公司

2.1.4溶液

2.1.4.1人工合成多肽溶液

1.0mg/ml多肽溶液：在实验室冰箱冷冻室中取1mg冻干粉末状的多肽，加1ml无菌蒸馏水混匀，再依次稀释到所需倍数，于零下20℃分装保持备用。

2.1.4.2氨苄青霉素溶液

1.0mg/ml氨苄青霉素溶液：用电子分析天平称取1mg氨苄青霉素，再加入1ml无菌蒸馏水混匀，再依次稀释到所需浓度，于零下20℃分装保持备用。

2.1.4.3培养基

营养肉汤培养基(液体)的配方(每升)：蛋白胨10.0g、牛肉膏粉3.0g、氯化钠5.0g、最终ph7.4±0.2。使用方法：称取本品18g，加入蒸馏水或去离子水1l，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装试管或三角瓶，121℃高压灭菌15min。

lb琼脂(固体)的配方(每升)：蛋白胨10.0g、酵母膏粉5.0g、氯化钠5.0g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g、最终ph7.0±0.2。使用方法：称取本品36g，加入蒸馏水或去离子水1l，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃灭菌15min。

2.2平板菌落计数法分析抑菌活性

方法流程如下：

第一步，从冰箱冷冻室将金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、溶藻弧菌、大肠杆菌取出，在常温下一段时间后，取50μl的致病菌于1ml的营养肉汤培养基中进行活化，并放置于37℃的恒温摇床培养箱中培养6-12h至对数生长期。

第二步，取一环活化好的菌液接种于lb琼脂固体小斜面上放置于37℃生化培养箱中培养6-12h,接着用3ml的无菌蒸馏水将小斜面上的菌洗入装有97ml无菌蒸馏水的三角瓶中，稀释成10^-2的菌液。

第三步，根据菌液的原有浓度，用无菌蒸馏水将菌液稀释为所需浓度，取稀释后的50μl菌液与50μl的对应浓度的肽液进行混合。将菌肽混合液放置于30℃恒温水浴锅中孵化2h，并且取50μl混合液用涂布法涂平板，做两个平行，将涂布完成的培养皿倒扣放置于37℃生化培养箱中培养12-24h后计数菌落并拍照。无菌蒸馏水为阴性对照，氨苄青霉素为阳性对照。

第四步，进行抑菌率的计算。

抑菌率(％)＝(阴性对照菌落数-实验组菌落数)/阴性对照菌落数×100。结果以“平均值±标准差”表示。

2.3结果分析

2.3.1合成多肽h3的抑菌活性结果分析

表2多肽h3对大肠杆菌、溶藻弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌率(％)

表3氨苄青霉素对大肠杆菌、溶藻弧菌、乙型链球菌、金黄色葡萄球菌最低的抑菌率(％)

由图1至图4，及表2和表3可知，合成多肽h3对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.03125mg/ml，对溶藻弧菌的最低抑菌浓度为0.0078125mg/ml，对乙型链球菌的最低抑菌浓度为0.25mg/ml，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.00390625mg/ml。而阳性对照氨苄青霉素对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.00625mg/ml，对溶藻弧菌的最低抑菌浓度为0.0078125mg/ml，对乙型链球菌的最低抑菌浓度为0.25mg/ml，对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.25mg/ml。同浓度的多肽h3与氨苄青霉素比较，多肽h3的抑菌效果甚至比氨苄青霉素还要强，这样的发现对于未来h3抗菌肽代替抗生素提供了可能，同时在制药方面也存在着无限的可能。

实施例3凡纳滨对虾组蛋白h4抗菌肽的预测及结构分析

3.1组蛋白h4抗菌肽表面亲和力及二级结构预测

组蛋白h4的表面亲和力和二级结构通过netsurfpver.1.1-proteinsurfaceaccessibilityandsecondarystructurepredictions(http：//www.cbs.dtu.dk/services/netsurfp/)网站预测，结果如下：

3.1.1合成多肽h3表面亲和力和二级结构预测

表4合成多肽h3表面亲和力和二级结构预测值

从表4可以看出，从空间结构的可能性来看，h3形成α螺旋的可能性较大，形成β折叠的可能性较小。

3.2合成多肽h3的3d模型预测及结构分析

已知凡纳滨对虾组蛋白h4的序列，并取出包含h3肽段的一段序列：kvlrdniqgitkpairrlarrggvkrisgliyeetrgvlkvflen(其中加粗部分为h3肽段的序列)，通过swiss-model|workspace(http：//swissmodel.expasy.org/interactive)网站预测，对这段序列进行同源建模，得到如下模型。

如图5所示，箭头所指螺旋部分为h3肽段的3d结构模型，通过模型可以看出，h3肽段的结构中存在α-螺旋。由图5可知h3肽段存在α-螺旋结构和线状的松散结构。

3.3合成多肽h3的理化性质分析

合成多h3通过heliquest(http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/)软件预测结果如下：

表5合成多肽h3的理化性质

根据以上图6和表5，可知合成多肽h3的疏水性为0.064，疏水性力矩为0.070，净电荷为7.，极性残基10个，非极性残基7个。大多抗菌肽在生理ph7.0条件下带净正电荷，正电荷数2-9，但是多数2-5个。一般在一定的范围内，净电荷数的增加伴随着抑菌活性的增强。合成多肽h3的净电荷已经达到7个，这可能会成为其抑菌活性强的原因。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

sequencelisting

<110>集美大学

<120>一种凡纳滨对虾组蛋白抗菌肽及其应用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.3

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<212>prt

<213>人工序列

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