本发明属于DNA分子标记技术领域，具体涉及一种利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法。
背景技术：
微卫星（microsatellites）或称简单重复序列（simple sequence repeats, SSR）是指由1-6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列，几乎存在于迄今研究过的所有生物当中，并且分布密度很大。因微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来广泛应用的DNA标记，常应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。
在自然环境中，紫背浮萍基本以无性生殖进行繁殖，当环境条件适宜时2天即可克隆出一代，种群遗传多样性水平较低。
现有技术提供多种卫星标记的检测方法，例如，中国发明授权专利文献 一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法 授权公告号 CN 103305611 B该发明涉及一种锈斑蟳微卫星标记的快速检测方法，包括 ： （1）锈斑蟳基因组 DNA 的提取 ； （2）根据 GeneBank 数据库中锈斑蟳的功能基因序列，获得含有微卫星重复的基因序列 ； （3）微卫星标记引物的设计 ； （4）锈斑蟳不同个体的基因组 DNA的 PCR 扩增 ； （5）PCR 产物的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。该发明的检测方法具有快速、准确、灵敏等优点，能够直观地检测出锈斑蟳不同个体的基因型，从而快速获得锈斑蟳在功能基因微卫星位点遗传变异的多态性图谱，该微卫星标记可应用于锈斑蟳遗传变异与种群遗传多样性分析等领域，但微卫星标记检测速度还有提升空间。
技术实现要素：
本发明针对上述技术问题提供一种紫背浮萍Sp10微卫星DNA标记的检测方法，可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。
本发明针对上述技术问题所采取的方案为：利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，检测方法如下：
1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；
2）紫背浮萍基因组DNA提取：a在水浴锅中预热CTAB提取液；b研磨样品并转入离心管中，加入提取液，保温，颠倒混匀；c离心，取上清液；d加入酚/氯仿，混匀，离心，取上清液；e加入氯仿，混匀，离心，取上清液；f重复d、e 1~2次；g加入异丙醇混匀，沉淀，离心，弃上清液；h将沉淀物用乙醇漂洗，离心，弃上清液；i重复h；j检测，低温保存，备用；
3）设计特异性引物：
微卫星点Sp10特异性引物：F: CCATCTGTCGTCCTTTTTCCC
R: CGCCCCATCACTTATTTCGTA；
4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；
5）对PRC产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp10核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。
可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。
步骤1中采集紫背浮萍样品，驯养3~5天，通过人工驯养的方式使野生状态下的紫背浮萍以无性繁殖的方式进行繁殖，获得较多的样品。
步骤2 DNA提取法为改良的CTAB法，通过对CTAB法进行改良，获得的DNA质量优异，提取过程中无明显的DNA降解。
步骤2中b在液氮中研磨样品后转入离心管中，加入提取液，60~68℃保温30~60min，每隔10min轻轻颠倒混匀，使样品充分溶解在提取液中，通过颠倒混匀提高提取效果。
步骤2中h将沉淀物用65~75%乙醇漂洗，离心，弃上清液，通过乙醇漂洗使核酸充分的分离出来。
步骤2中j提取产物取2~3μl用1.0~2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于‐10~-30℃保存备用，采用的凝胶电泳方法简单、快速、灵敏的特点。
步骤2中a在60~70℃水浴锅中预热CTAB提取液，CTAB提取液由以下成分及重量份组成：CTAB 3~5份、1M Tris-HCl 18~22份、NaCl 14~18份、0.5M EDTA 6~10份、三甲基硅基0.02~0.08份、2-巯基乙醇0.2~1份、氨基乙酸0.03~0.06份、氯仿90~98份、异戊醇3~5份。通过预热抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解，获得优异的提取效果，DNA质量优异，且提取速度较快。
步骤5中先将PCR产物进行琼脂糖初筛，选择有扩增的引物PCR产物加上样缓冲液，92~95℃变性8~12min后于5~7%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，采用的凝胶电泳方法简单、快速、灵敏的特点。
步骤5中的上样缓冲液由以下成分及重量份组成：二甲酚橙0.05~0.18份、柠檬黄0.1~0.25份、溴酚蓝0.01~0.05份、二甲苯青FF 0.05~0.18份、硬脂酸甘油酯0.02~0.06份、丙三醇35~37份、六氰合铁酸钾0.01~0.02份、乙二胺四乙酸二钠2.8~3.2份、甲酸酐0.04~0.08份、十二烷基硫酸钠3~5份。可增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内，使样品呈色，操作方便。
有益效果：本发明具有速度快、准确性和灵敏度高的优点，可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。
具体实施例
以下结合实施例作进一步详细描述：
实施例1：
利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，检测方法如下：
1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；
2）紫背浮萍基因组DNA提取：a在水浴锅中预热CTAB提取液；b研磨样品并转入离心管中，加入提取液，保温，颠倒混匀；c离心，取上清液；d加入酚/氯仿，混匀，离心，取上清液；e加入氯仿，混匀，离心，取上清液；f重复d、e 1~2次；g加入异丙醇混匀，沉淀，离心，弃上清液；h将沉淀物用乙醇漂洗，离心，弃上清液；i重复h；j检测，低温保存，备用；
3）设计特异性引物：
微卫星点Sp10特异性引物：F: CCATCTGTCGTCCTTTTTCCC
R: CGCCCCATCACTTATTTCGTA；
4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；
5）对PRC产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp10核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。
可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。
步骤1中采集紫背浮萍样品，驯养3~5天，通过人工驯养的方式使野生状态下的紫背浮萍以无性繁殖的方式进行繁殖，获得较多的样品。
步骤2 DNA提取法为改良的CTAB法，通过对CTAB法进行改良，获得的DNA质量优异，提取过程中无明显的DNA降解。
步骤2中b在液氮中研磨样品后转入离心管中，加入提取液，60~68℃保温30~60min，每隔10min轻轻颠倒混匀，使样品充分溶解在提取液中，通过颠倒混匀提高提取效果。
步骤2中h将沉淀物用65~75%乙醇漂洗，离心，弃上清液，通过乙醇漂洗使核酸充分的分离出来。
步骤2中j提取产物取2~3μl用1.0~2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于‐10~-30℃保存备用，采用的凝胶电泳方法简单、快速、灵敏的特点。
步骤2中a在60~70℃水浴锅中预热CTAB提取液，CTAB提取液由以下成分及重量份组成：CTAB 3~5份、1M Tris-HCl 18~22份、NaCl 14~18份、0.5M EDTA 6~10份、三甲基硅基0.02~0.08份、2-巯基乙醇0.2~1份、氨基乙酸0.03~0.06份、氯仿90~98份、异戊醇3~5份。通过预热抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解，获得优异的提取效果，DNA质量优异，且提取速度较快。
步骤5中先将PCR产物进行琼脂糖初筛，选择有扩增的引物PCR产物加上样缓冲液，92~95℃变性8~12min后于5~7%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，采用的凝胶电泳方法简单、快速、灵敏的特点。
步骤5中的上样缓冲液由以下成分及重量份组成：二甲酚橙0.05~0.18份、柠檬黄0.1~0.25份、溴酚蓝0.01~0.05份、二甲苯青FF 0.05~0.18份、硬脂酸甘油酯0.02~0.06份、丙三醇35~37份、六氰合铁酸钾0.01~0.02份、乙二胺四乙酸二钠2.8~3.2份、甲酸酐0.04~0.08份、十二烷基硫酸钠3~5份。硬脂酸甘油酯、六氰合铁酸钾和甲酸酐可增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内，使样品呈色，操作方便。
实施例2：
利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法，检测方法如下：
1）材料预处理：采集紫背浮萍样品，驯养，封装，干燥，待用；
2）紫背浮萍基因组DNA提取：a在水浴锅中预热CTAB提取液；b研磨样品并转入离心管中，加入提取液，保温，颠倒混匀；c离心，取上清液；d加入酚/氯仿，混匀，离心，取上清液；e加入氯仿，混匀，离心，取上清液；f重复d、e 优选的1次；g加入异丙醇混匀，沉淀，离心，弃上清液；h将沉淀物用乙醇漂洗，离心，弃上清液；i重复h；j检测，低温保存，备用；
3）设计特异性引物：
微卫星点Sp10特异性引物：F: CCATCTGTCGTCCTTTTTCCC
R: CGCCCCATCACTTATTTCGTA；
4）利用上述引物对紫背浮萍不同地理群内个体的基因组DNA进行PCR扩增；
5）对PRC产物初筛，加上样缓冲液，变性后于变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，从而获得紫背浮萍在Sp10核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。
可快捷的获得紫背浮萍Sp10遗传标记基因座呈现高度遗传变异的多态性图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出紫背浮萍在此位点的每个个体的基因型。
步骤1中采集紫背浮萍样品，驯养优选的4天，通过人工驯养的方式使野生状态下的紫背浮萍以无性繁殖的方式进行繁殖，获得较多的样品。
步骤2 DNA提取法为改良的CTAB法，通过对CTAB法进行改良，获得的DNA质量优异，提取过程中无明显的DNA降解。
步骤2中b在液氮中研磨样品后转入离心管中，加入提取液，在优选的65℃中保温优选45min，每隔10min轻轻颠倒混匀，使样品充分溶解在提取液中，通过颠倒混匀提高提取效果。
步骤2中h将沉淀物用优选70%乙醇漂洗，离心，弃上清液，通过乙醇漂洗使核酸充分的分离出来。
步骤2中j提取产物取2μl用优选的2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于优选的‐20℃保存备用，采用的凝胶电泳方法简单、快速、灵敏的特点。
步骤2中a在优选的65℃水浴锅中预热CTAB提取液，CTAB提取液由以下成分及优选重量份组成：CTAB 4份、1M Tris-HCl 20份、NaCl 16份、0.5M EDTA 8份、三甲基硅基0.06份、2-巯基乙醇0.7份、氨基乙酸0.04份、氯仿92份、异戊醇4份。通过预热抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解，获得优异的提取效果，DNA质量优异，且提取速度较快。
步骤5中先将PCR产物进行琼脂糖初筛，选择有扩增的引物PCR产物加上样缓冲液，优选94℃变性10min后于优选的6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，采用的凝胶电泳方法简单、快速、灵敏的特点。
步骤5中的上样缓冲液由以下成分及优选的重量份组成：二甲酚橙0.1份、柠檬黄0.2份、溴酚蓝0.03份、二甲苯青FF 0.12份、硬脂酸甘油酯0.04份、丙三醇36份、六氰合铁酸钾0.016份、乙二胺四乙酸二钠2.9份、甲酸酐0.06份、十二烷基硫酸钠4份。可增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内，使样品呈色，操作方便。
实施例3：
1)植物材料采集：使用普通鱼网兜从河流、池塘、水沟、水稻田等自然水域中采集紫背浮萍样品，样品之间最小间隔为20m。采集的新鲜紫背浮萍先在实验室内使用自来水驯养3~5天后，选取20~40片叶片相连的紫背浮萍植株（包括根）作为基因组DNA提取样品，即一个克隆（clone）。每一份样品单独使用纸质样品袋封装，利用硅胶进行干燥制备干样。
2)紫背浮萍基因组DNA提取：采取改良的CTAB法进行DNA提取，每个样本采取0.5g叶片进行DNA提取。
a）在65℃水浴锅中预热CTAB 提取液；
b）在液氮中迅速研磨样品，将粉末状材料转入2mL 离心管中，加入预热的CTAB提取液（每克样品加入3-5ml的提取液），65℃保温30-60min，每隔10min轻轻颠倒混匀；
c）12000rpm条件下离心5 min，取上清转入新离心管；
d）加入等体积酚/氯仿（1∶1），充分混匀，11000rpm 离心10 min，取上清转入新离心管；
e）加入等体积氯仿，充分混匀，11000rpm离心10 min，取上清转入新离心管；
f）重复步骤d、e；
g）加入2/3 体积的异丙醇混匀，室温放置，沉淀15 min；
h）11000rpm 条件下离心6 min，弃上清；
i）将沉淀用70%的乙醇漂洗一次，室温条件下11000rpm 离心2 min，弃上清，重复洗一次；
j）提取产物取2-3μl用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于‐20℃保存备用
3)微卫星引物设计：根据GenBank发布的紫背浮萍全基因组序列，使用Primer premier 5.0软件对含有2-6个碱基重复重复单元且重复数超过5个的DNA序列进行微卫星（simple repeat sequence，SSR）引物设计，设计参数如下：引物GC含量不超过40-60%，且正反向引物相差不到10%；退火温度不小于45℃，且正反向引物相差不超过5℃；正反向引物不能发生错配，且3'避免互补重叠。；引物3'不选择A，且不选择超过3个的G或者C；引物长度为18-27bp；预期的PCR产物长度为100-299bp。
设计得微卫星点Sp10特异性引物：F: CCATCTGTCGTCCTTTTTCCC
R: CGCCCCATCACTTATTTCGTA；
4)微卫星PCR扩增:PCR反应体系：
SSR（共20ul）：ddH2O 14.8ul，dNTP 0.4ul，10xPCR Buffer 2 ul， 正向引物 0.3ul（20uM），反向引物0.3ul（20uM），DNA模板2ul，Taq 0.2ul。
PCR反应采用如下循环参数：
SSR PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30s，54℃复性35s，72℃延伸40s，共 35个循环；最终72℃延伸3min。
先将PCR产物进行琼脂糖初筛，选择有扩增的引物PCR产物加上上样缓冲液，94℃变性10min后于6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分析，银染后观察。
5)数据分析:PCR扩增产物的电泳位置在凝胶的某个相同迁移率位置上有DNA条带记为1，无DNA条带记为0，然后转化成AA、BB的格式录入到EXCEL中，使用TFPGA v1.3、 FSTAT v2.9.3（Goudet,2002）和Popgene v1.32等软件计算以下参数：多态位点百分率P（percent of polymorphic loci）；有效等位基因数Ne（effective number ofalleles per loci）；期望杂合度HE（expected heterozygosity），观察杂合度HO（observed heterozygosity）；PIC（polymorphism information content）值即多个位点的多态信息含量；近交系数FIS（inbreeding coefficient）。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大学
<120> 利用特异性引物对紫背浮萍Sp10微卫星标记检测的方法
<130> zjou-hk-002
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccatctgtcg tcctttttcc c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
cgccccatca cttatttcgt a 21