一种骨骼或牙齿DNA磁珠提取方法和试剂与流程

本发明涉及一种骨骼和牙齿dna磁珠提取方法和试剂，特别是针对陈旧检材，属于生物技术领域。

背景技术：

在法医学dna基因分析领域，在很多情况如：空难、恐怖袭击及多年陈旧检材的dna分析过程中，骨头和牙齿通常是最好的但又是仅有的dna分析资源。然而目前为止dna的有效提取仍旧是法医分析中的dna分型中面临的巨大难题，因为陈旧骨骼/牙齿检材长期暴露于外界环境中，如高温、潮湿、暴晒、土壤微生物等恶劣条件对dna的产生严重破坏，导致dna含量减少且降解程度严重，dna分子可能被降解成很小的片段(甚至50bp以下)，此外陈旧牙齿和骨骼检材中还存在大量pcr反应抑制剂和外源性污染，而且检材的大范围钙化也会阻碍dna的释放。另外由于检材用途的特殊性，提取方法需要快速高效且可以有效防止污染。

目前我们所采用的陈旧骨骼/牙齿检材的dna提取方法大致可分为酚/氯仿、异丙醇/氯仿等有机方法及硅胶提取等方式。这些方法中均存在着缺点，如有机提取法无法有效去除检材样本中的亲水成分和pcr抑制剂而且该方式对操作人员的健康造成伤害。而硅胶颗粒用于dna提取其本身也是一种抑制剂。目前对于陈旧骨头和牙齿的dna提取方法一直在发展但是仍没有高效而又统一的标准流程。目前亟需要一种快速高效并且操作简单可以尽可能减少污染的方法，以便于后续一代、二代的dna测序和准确分型，有效运用于法医的身份鉴定。

技术实现要素：

本发明公开了一种骨骼和牙齿dna磁珠提取方法和试剂，特别是针对陈旧检材的dna提取。该方法能高效、快速地获得高质量的骨骼/牙齿检材dna，可以满足pcr扩增、定量和定性分析、测序等分子生物学实验及法医科学dna分型及应用要求。

为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：

1.步骤一：骨骼或牙齿dna磁珠提取方法试剂配制

预处理脱钙液a：0.2-0.8m乙二胺四乙酸(edta)；

消化液b：0.3-0.6％(w/v)n-月桂酰肌氨酸钠盐(nls)，0.2-0.5m乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)，0.40-0.70mg/ml蛋白酶k，0.02-0.05m，二硫苏糖醇(dtt)；

磁珠悬浮液：15-30％(w/v)纳米磁珠；

结合液c：35-50％(v/v)异丙醇，2.0-4.0m盐酸胍，0.5-1.5mg磁珠；

洗涤液w1：5-10mm氯化钙，70-90％(v/v)乙醇，洗涤液w2：70-90％(v/v)乙醇；

洗脱液t：0.5×te(tris-edta)，ph＝7.0-9.0。

2.步骤二：对骨骼或牙齿检材进行脱钙预处理

取骨骼或牙齿检材粉末1.0g置于15ml离心管中，加入脱钙预处理液a，在30-45℃条件下于旋转混合仪中避光处理1.0-2.0小时，脱钙预处理液a：0.2-0.8m乙二胺四乙酸(edta)。由于骨骼和牙齿检材存在大范围钙化情况，会阻碍提取试剂的进入和检材细胞中dna的释放，因此需通过脱钙的方式破坏钙化结构，使提取试剂更好的进入细胞，破坏细胞结构有助于细胞内dna的释放提高提取效果。

3.步骤三：对检材进行消化裂解处理

将脱钙预处理的样品3000-4000g左右离心3min去上清，向其中加入消化液b，快速振荡60s使其混匀，然后在旋转混合仪中45-65℃条件下避光处理1.0-2.0小时。消化液b：0.3-0.6％(w/v)n-月桂酰肌氨酸钠盐(nls)，0.2-0.5m乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)，0.40-0.70mg/ml蛋白酶k，0.02-0.05m二硫苏糖醇(dtt)。n-月桂酰肌氨酸钠盐是阴离子表明活性剂且具有渗透、乳化、增溶等作用，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)类似于乙二胺四乙酸(edta)起到螯合剂的作用，但与edta不同它不会对后续的分子测序产生抑制作用。蛋白酶k降解蛋白使dna裸露，dtt起到抗氧化作用。该组合方式可以有效的裂解细胞去除蛋白等杂物，充分释放dna。

4.步骤四：结合从检材中释放的dna

上一步消化处理的样本冷却至室温后，4000-6000g离心4min，将上清转移到新的15ml离心管内，加入结合液b；漩涡振荡15-30秒；加入适量醋酸调节ph至4.0-9.0，加入15ul已悬浮磁珠液体，在室温条件下避光反应0.5-2.0小时；从旋转混合仪中取出离心管，将离心管放在磁力架上，静置1-2分钟进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠。结合液c：35-50％(v/v)异丙醇，2-4m盐酸胍。高浓度胍盐可以使蛋白降解，核酸酶失活有助于加速dna与磁珠的结合。

5.步骤五：洗涤结合在磁珠上的dna

首先盐洗涤，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液w1900ul，漩涡振荡30-60秒；静置1-2分钟后将离心管放在磁力架上，静置1-2分钟进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，同上述步骤使用800ul洗涤液w1再洗涤一次，保留磁珠；然后进行醇洗涤，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液w21.0ml，漩涡振荡30-60秒；静置1-2分钟后将离心管放在磁力架上，静置1-2分钟后进行磁珠分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠，敞开管口45-60℃eppendorf震荡孵育器内放置5分钟以便乙醇挥发。洗涤液w1：5-10mm氯化钙，70-90％(v/v)乙醇；洗涤液w2：70-90％(v/v)乙醇。盐洗和醇洗可以分别去除盐类及有机物杂质，45-60℃挥发可以去除乙醇，有利于后续进一步的分子定量测序分析等。

6.步骤六：将结合在磁珠上的dna洗脱

向完成第二步洗涤、去除上清、留有磁珠的离心管中加入25-50ul洗脱液t，将离心管50-65℃低速1000-1200rpm漩涡振荡5分钟，计时结束后，取出离心管，将离心管放在磁力架上，静置1-2分钟进行磁性分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的骨骼/牙齿检材dna。洗脱液t：0.5xte(tris-edta)，ph＝7.0-9.0。漩涡震荡、加热的物理强化作用易于dna的洗脱，te(tris-edta)缓冲液为弱碱性，对dna的碱基有保护性，易于提取dna的保存。

以上基于一种骨骼或牙齿检材磁珠dna提取方法，包括检材的脱钙预处理、消化液裂解细胞释放dna、磁珠与dna结合、磁珠上dna洗涤、dna洗脱。

7.作为优选的，本发明在脱钙预处理过程中，为保证漩涡振荡混匀的效果，所提取的骨骼/牙齿检材粉末(以克为单位)与脱钙液(以毫升为单位)的比例满足1:5-1:15，所使用的样本起始量不得超过1.0g，一般使用15ml离心管即所使用离心管最大装液量的2/3；若大量提取时，使用50ml离心管。

8.作为优选的，本发明在脱钙预处理过程中，脱钙预处理条件为：骨骼/牙齿检材于混悬仪上30-45℃避光处理1.0-2.0小时。

9.作为优选的，本发明在消化过程中，消化液b的用量(以毫升为单位)是样本起始量(以克为单位)的4-6倍，每1.0g样本中蛋白酶k的使用量为250-400ul(20mg/ml)，双硫苏糖醇的使用量为400-500ul(1m)。

10.作为优选的，本发明在消化过程中，消化的条件为：于混悬仪上45-65℃条件下避光处理1.0-2.0小时。

11.作为优选的，本发明在结合过程中，结合液c的用量与消化离心后的上清液的比例为1:0.8-1:1.5。

12.作为优选的，本发明在结合过程中，结合的条件为：于混悬仪上室温避光处理0.5-2.0小时。

13.作为优选的，本发明在结合过程中，需加入适量70-80％hac调节ph至4.0-9.0。

14.作为优选的,本发明在洗涤过程中，洗涤液w1的用量为800ul-1000ul，洗涤液w2的用量为800ul-1000ul，后于eppendorf震荡孵育器，500-800rpm，敞开管口45-60℃处理5min挥干乙醇。

15.作为优选的，本发明在洗脱过程中，洗脱液t的用量为25-50μl，以保证洗脱效率，所使用的eppendorf震荡孵育器条件设置为：1000-1200rpm，50-65℃加热振荡5min。

有益效果

1.本发明加入了脱钙步骤，充分破裂已钙化的检材，使细胞充分裂解，提高提取效率。

2.本发明消化过程中，消化液的成分中包含乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)起到了螯合剂的作用，又优于乙二胺四乙酸(edta)，因其不会对下游二代测序建库产生抑制作用。

3.本发明结合过程中，结合液成分为高浓度胍盐，在室温条件下避光反应0.5-2.0小时。高浓度胍盐可以使蛋白降解，核酸酶失活加速dna与磁珠的结合，时间为0.5-2.0小时使结合效率达到最适。

4.本发明结合过程中，需加入70-80％hac醋酸进行ph调节，ph为4.0-5.5的条件下磁珠在该结合液中与dna的结合效率最适。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

以下用具体实施方式对本发明进行具体阐述，下列所有实施例中所述的操作步骤分别在2.0ml和15ml离心管中操作。如需大规模提取，按比例放大试剂与样品量及装置即可。

实施例1

一种基于磁珠法的陈旧骨骼检材dna的提取方法与btaforensicdnaextractionkits提取方法比较。其特征是，具体步骤如下：

一、基于磁珠法的陈旧骨骼检材dna的提取方法

(1)脱钙预处理

取10份陈旧骨骼检材粉末各50mg置于2ml离心管中，加入450ul脱钙预处理液a，在35℃混悬仪中处理1.0小时；

(2)消化裂解细胞

消化裂解处理，将脱钙预处理的样品10000rpm离心3min去上清，向其中加入220ul消化液b，10.0ul蛋白酶k(20mg/ml)，15.0ul二硫苏糖醇(dtt)(1.0m)10000rpm快速振荡60s混匀，在50℃旋转混合仪中避光处理1.0小时。

(3)结合dna

上一步消化处理的样本冷却至室温后，12000rpm离心4min，将上清转移到新的2ml离心管内，加入约250ul结合液b；漩涡振荡60秒充分混匀；加入约4ul醋酸调节ph至5.0，加入8ul已悬浮磁珠液体，在25℃条件下避光反应1.0小时。

(4)洗涤

首先盐洗涤，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液w1900ul，漩涡振荡60秒；静置2分钟后将离心管放在磁力架上，静置2分钟进行磁性分离，计时结束后用移液器除去上清，按照上述步骤使用800ul洗涤液w1再洗一次，保留磁珠；然后进行醇洗涤，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液w21.0ml，漩涡振荡60秒；静置2分钟后将离心管放在磁力架上，静置2分钟进行磁性分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠，敞开管口于eppendorf震荡孵育器内50℃放置500rpm漩涡振荡5分钟以便乙醇挥发。

(5)洗脱

向完成以上三步洗涤、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗脱液t，将离心管置于eppendorf震荡孵育器内56℃1200rpm漩涡振荡5分钟，计时结束后，取出离心管，将离心管放在磁力架上，静置2分钟进行磁性分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的陈旧骨骼检材dna。

二、基于btaforensicdnaextractionkits的提取方法

按照该试剂盒的说明书进行操作

(1)裂解消化

取上述：“磁珠法”中同样的10份骨骼检材粉末各50mg于2.0ml离心管中，同时加入220ulbtalysisbuffer，3ul1.0mdtt和7ul蛋白酶k，充分混匀后置于56℃震荡孵育器上1100rpm孵育2.0小时。

(2)dna结合

样本平衡至室温后，10000xg离心后将上清移至1.5ml试管中，同时加入300ullysisbuffer加入15ulmagneticparticles充分混悬后加入300ul异丙醇混匀后于震荡孵育器上700rpm室温孵育10分钟

(3)dna的洗涤

分别使用600ulwashbuffera、300ulwashbuffera、300ulwashbufferb依次洗涤磁珠上的dna，再在空气中晾干约5分钟。

(4)dna的洗脱

加入50ulelutionbuffer于每份晾干的带有磁珠的离心管内，混匀后置于eppendorf孵育震荡器上70℃900rpm震荡10分钟。最后置于磁力架上静止5分钟，吸取液体即为提取的陈旧骨骼检材dna。

三、提取方法对陈旧骨骼检材dna提取效果检测

具体方法如下：

1)、taqman探针人基因组dna特异性结合实时荧光定量pcr检测：

使用appliedbiosystems公司的7500实时荧光定量pcr仪及appliedbiosystems公司triodnaquantificationkits对“基于磁珠法的陈旧骨骼检材dna的提取方法”和“btaforensicdnaextractionkits提取方法”两种方法所提取的dna进行定量检测，结果如表1所示。

表1陈旧骨骼检材dna的定量结果

2)、段串联重复序列(str)扩增检测：

使用appliedbiosystems公司的3500xl测序分析仪器及globalfiler^tmpcramplificationkit对“基于磁珠法的陈旧骨骼检材dna的提取方法”和“btaforensicdnaextractionkits提取方法”两种方法所提取的dna进行str结果检测，结果如表1所示。

表1陈旧骨骼检材dna的str扩增结果

从appliedbiosystems公司的7500实时荧光定量pcr仪的定量结果显示，本技术“基于磁珠法的陈旧骨骼检材dna的提取方法”从陈旧骨骼检材中可以提取到短片段的平均浓度为0.013ng/ul，数据一致性良好。其中有一个样本未检测到长片段，降解系数无限大即降解程度严重；“基于btaforensicdnaextractionkits的提取方法”从陈旧骨骼检材中可以提取到短片段的平均浓度为0.012ng/ul。其中有二个样本未检测到长片段，降解系数无限大即降解程度严重；本技术对于10份陈旧牙齿检材的提取定量结果长、短片段pcr结果及样本完整性均高于btaforensicdnaextractionkits进口成品试剂盒。

从3500xl测序仪对提取dna的str扩增产物进行测序结果也表明：本技术提取效果优于bta提取方式，因为本技术平均获得str位点数为17，而bta方法为15。

实施例2

一种基于磁珠法的陈旧牙齿检材dna的提取方法与btaforensicdnaextractionkits提取方法比较。其特征是，具体步骤如下：

一、基于磁珠法的陈旧牙齿检材dna的提取方法

(1)脱钙预处理

取10份陈旧牙齿检材粉末各50mg置于2ml离心管中，加入200ul脱钙预处理液a，在35℃混悬仪中处理1.0小时。

(2)消化裂解细胞

消化裂解处理，将脱钙预处理的样品10000rpm离心3min去上清，向其中加入220ul消化液b，10.0ul蛋白酶k(20mg/ml)，15.0ul二硫苏糖醇(dtt)(1.0m)10000rpm快速振荡60s混匀，在50℃旋转混合仪中避光处理1.0小时。

(3)结合dna

上一步消化处理的样本冷却至室温后，10000rpm离心4min，将上清转移到新的2ml离心管内，加入约240ul结合液b；漩涡振荡60秒充分混匀；加入约4ul醋酸调节ph至5.0，加入8ul已悬浮磁珠液体，在25℃条件下避光反应1.0小时。

(4)洗涤

首先盐洗涤，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液w1900ul，漩涡振荡60秒；静置1分钟后将离心管放在磁力架上，静置1分钟进行磁性分离，计时结束后用移液器除去上清，重复上述步骤再使用800ul洗涤液w1洗涤一次，保留磁珠；然后进行醇洗涤，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗涤液w21.0ml，漩涡振荡30秒；静置1分钟后将离心管放在磁力架上，静置1分钟进行磁性分离，计时结束后用移液器除去上清，保留磁珠，敞开管口置于eppendorf震荡孵育器内50℃500rpm震荡5分钟以便乙醇挥发。

(5)洗脱

向完成以上三步洗涤、去除上清、留有磁珠的离心管中加入洗脱液t，将离心管置于eppendorf震荡孵育器内56℃1200rpm振荡5分钟，计时结束后，取出离心管，将离心管放在磁力架上，静置2分钟进行磁性分离，计时结束后用移液器吸取上清液体，此液体即为提取的陈旧牙齿检材dna。

二、基于btaforensicdnaextractionkits的提取方法

按照该试剂盒的说明书进行操作

(1)裂解消化

取上述：“磁珠法”中同样的10份牙齿检材粉末各50mg于2.0ml离心管中，同时加入220ulbtalysisbuffer，3ul1.0mdtt和7ul蛋白酶k，充分混匀后置于56℃震荡孵育器上1100rpm孵育2.0小时。

(2)dna结合

样本平衡至室温后，10000xg离心后将上清移至1.5ml试管中，同时加入300ullysisbuffer加入15ulmagneticparticles充分混悬后加入300ul异丙醇混匀后于震荡孵育器上700rpm室温孵育10分钟

(3)dna的洗涤

分别使用600ulwashbuffera、300ulwashbuffera、300ulwashbufferb依次洗涤磁珠上的dna，再在空气中晾干约5分钟。

(4)dna的洗脱

加入50ulelutionbuffer于每份晾干的带有磁珠的离心管内，混匀后置于孵育震荡器上900rpm70℃震荡10分钟。最后置于磁力架上静止约5分钟，吸取液体即为提取的陈旧牙齿检材dna。

三、提取方法对陈旧牙齿检材dna提取效果检测

具体方法如下：

1)、taqman探针人基因组dna特异性结合实时荧光定量pcr检测：

使用appliedbiosystems公司的7500实时荧光定量pcr仪及appliedbiosystems公司triodnaquantificationkits对“基于磁珠法的陈旧牙齿检材dna的提取方法”和“btaforensicdnaextractionkits提取方法”两种方法所提取的dna进行定量检测，结果如表1所示。

表1陈旧牙齿检材dna的定量结果

2)、段串联重复序列(str)扩增检测：

使用appliedbiosystems公司的3500xl测序分析仪器及globalfiler^tmpcramplificationkit对“基于磁珠法的陈旧牙齿检材dna的提取方法”和“btaforensicdnaextractionkits提取方法”两种方法所提取的dna进行str结果检测，结果如表1所示。

表1陈旧牙齿检材dna的str扩增结果

从appliedbiosystems公司的7500实时荧光定量pcr仪的定量结果显示，本技术“基于磁珠法的陈旧牙齿检材dna的提取方法”从陈旧牙齿检材中可以提取到短片段的平均浓度为0.062ng/ul，数据一致性良好。其中有一个样本未检测到长片段，降解系数无限大即降解程度严重；“基于btaforensicdnaextractionkits的提取方法”从陈旧牙齿检材中可以提取到短片段的平均浓度为0.031ng/ul。其中有三个样本未检测到长片段，降解系数无限大即降解程度严重；本技术对于10份陈旧牙齿检材的提取定量结果长、短片段pcr结果及样本完整性均高于btaforensicdnaextractionkits进口成品试剂盒。

从3500xl测序仪对提取dna的str扩增产物进行测序结果也表明本技术提取效果优于bta提取方式，因为本技术平均获得str位点数为15，而bta方法为10。

除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围。

表1.两种提取方式对20份陈旧骨骼和牙齿检材的dna的实时定量结果及globalfiler^tm的str检测结果

a:内部pcr质控.

b:降解系数＝段片段的浓度(ng/μl)/长片段的浓度.(ng/μl)

c:未能检测到

d:globalfiler^tmpcramplificationkit使用3500xl测序仪所能检测到的str位点数。