本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种用于dna纯化的蛋白质，及其编码基因、应用和纯化方法。
背景技术：
：高度纯化的dna是开展很多分子生物学实验的先决条件。例如，限制性内切酶反应、连接酶反应、pcr反应和dna文库构建等体外反应，对溶液体系中的离子强度、污染蛋白水平、有机溶剂水平都有较高的要求。这些干扰因素不仅会严重降低体外反应的效率，也同时会导致非特异性酶切、连接产物比例的增高，因此dna的纯度是很多分子生物学实验效率和准确度的决定因素之一。目前常用的dna纯化方法有两种：乙醇沉淀法和亲和柱纯化法。乙醇沉淀法利用dna在70％乙醇溶液里溶解度较低的特点，将溶液中的dna沉淀出来，通过离心收集，获得较纯的dna。亲和柱纯化法是利用dna能被二氧化硅(sio2)、阴离子树脂等基质吸附的特性，将dna溶液通过含有这些基质的亲和柱后，离心去除杂质，然后将结合到柱上的dna洗脱下来。其中sio2亲和柱的应用尤其广泛。虽然这两种技术非常成熟，但它们一般只适用于1微克以上的dna样品。而对于几百纳克或更少的微量dna样品，纯化过程的损失率很高，往往在70％以上，无法满足后续实验的要求。这两种方法的另一个缺点是操作步骤比较繁琐，不适用于高通量实验。技术实现要素：转录因子是一类能够与基因的启动子、增强子区域结合并改变基因表达水平的蛋白质。由于不少转录因子能识别特定的dna序列并与它们结合，理论上它们也可以用来作为一种“介质”将含有特定序列的dna从溶液里吸附出来。然而用转录因子作为dna纯化“介质”至少有两个问题：一个问题是它们与dna的结合力较弱，绝大多数转录因子-dna复合体的分离常数(kd值)都在10-8-10-6m，因此用它们进行dna纯化，效率很低。例如，多家实验室的尝试表明运用大肠杆菌中的lac抑制因子(lacrepressor)，能纯化细菌裂解所释放的质粒dna，但回收效率在30％以下。另一个问题是多数转录因子从dna结合位点解离的机制并不是非常清楚，在体外反应里，一般只能在变性条件下实现高效解离；亲和纯化dna一般要求dna与结合介质或基质的结合是可逆的，例如sio2与dna的结合力与盐浓度密切相关，因此用sio2亲和柱进行dna纯化时可以在高盐溶液里吸附dna，然后用低盐溶液将吸附的dna洗脱下来，但对于大多数转录因子结合dna后如何实现高效解离是个难点。在本发明中，我们提供了一种全新的蛋白质来进行dna纯化，解决了以上两个问题。有鉴于此，本发明提供一种用于纯化dna的蛋白质、及其编码基因、应用和纯化方法，该编码基因编码的蛋白质可有效地用于纯化dna，尤其是含有teto序列的dna，并且可用于纯化微克以下含量级别的dna，尤其是100纳克以下含量级别的dna。为解决以上技术问题，本发明提供的第一方面的方案是一种编码用于dna纯化的蛋白质的基因，所述dna含有teto序列，所述基因具有：(i)序列表中seqidno.1所述的核苷酸序列；或(ii)在(i)所述序列的3’端融合了蛋白标签编码序列的核苷酸序列。优选的，(ii)所述的蛋白标签编码序列是编码snap、clip、halo或生物素化标签中的任一序列。优选的，(ii)所述的核苷酸序列是序列表中seqidno.2至seqidno.5任一所述的核苷酸序列。本发明还提供第二方面的技术方案，即包含前述基因的表达载体。本发明还提供第三方面的技术方案，即一种用于dna纯化的蛋白质，所述dna含有teto序列，所述蛋白质具有：(iii)序列表中seqidno.6所述的氨基酸序列；或(iv)在(iii)所述序列的c端融合了蛋白标签序列的氨基酸序列。优选的，(iv)所述的蛋白标签序列是snap、clip、halo或生物素化标签中的任一序列。优选的，(iv)所述的氨基酸序列是序列表中seqidno.7至seqidno.10任一所述的氨基酸序列。本发明还提供第四方面的技术方案，即制备前述具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质的方法，包括有如下步骤：将seqidno.1所示的核苷酸序列和蛋白标签编码序列克隆到蛋白表达载体上，然后将该蛋白表达载体转化到蛋白表达菌株里，经诱导细菌表达、纯化、获得具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质。本发明还提供第五方面的技术方案，即前述任一所述的基因在编码用于dna纯化的蛋白质的应用，所述dna含有teto序列。本发明还提供第六方面的技术方案，即前述任一所述的蛋白质在dna纯化上的应用，所述dna含有teto序列。优选的，所述蛋白质用于纯化微克以下含量级别或100纳克以下含量级别的dna。本发明还提供第七方面的技术方案，即一种dna的纯化方法，所述dna含有teto序列，所述纯化方法包括，a)将前述任一具有(iv)所述的氨基酸序列的蛋白质与dna结合获得结合物，将所述结合物吸附到固态介质上，从而将dna从目标物中分离出来；b)用四环素或四环素类似物处理结合物，获得从结合物中分离出来的dna，从而获得纯化后的dna。优选的，所述四环素类似物是脱水四环素atc。本发明通过采用具有特定氨基酸序列的蛋白质来达到对dna吸附、分离以及纯化的目的。通过本申请中具有(i)所述核苷酸序列的基因编码得到的，或通过其它方式得到的具有(iii)所述氨基酸序列的蛋白质，其与含有teto序列的dna的结合力明显高于常见转录因子，分离常数值得以降低(现有的转录因子与dna结合的分离常数值通常在10-8-10-6m，结合力较弱)，从而获得对dna进行纯化的前提条件。通过本申请具有(ii)所述核苷酸序列的基因编码得到，或通过其它方式得到具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质后，其可以在结合了含有teto序列的dna后获得结合物，将该结合物吸附到固态介质上，即可实现将dna从目标物中分离出来，然后再利用四环素或四环素类似物对其进行处理，即可获得从结合物中分离出来的dna，从而实现dna纯化的目的。上述方式解决了现有dna纯化方法操作复杂、回收效率偏低的问题。本申请具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质可有效的分离、纯化dna，尤其是含有teto序列的dna，无论是dna片段还是环状dna连接产物；并且前述蛋白质可用于纯化微克以下含量级别的dna，尤其是100纳克以下含量级别的dna。附图说明图1是本申请具有(iv)所述的氨基酸序列的结构示意图；图2是本申请实施方式一—三种纯化方法与空白对照的实验测定结果图；图3是本申请实施方式二—三种纯化方法与空白对照的实验测定结果图；图4是本申请实施方式三—三种纯化方法与空白对照的实验测定结果图；图5是本申请实施方式四—三种纯化方法与空白对照的实验测定结果图。具体实施方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。本发明提供的第一方面的方案是一种编码用于dna纯化的蛋白质的基因，所述dna含有teto序列，其特征在于：所述基因具有：(i)序列表中seqidno.1所述的核苷酸序列；或(ii)在(i)所述序列的3’端融合了蛋白标签编码序列的核苷酸序列。本发明还提供一种用于dna纯化的蛋白质，所述dna含有teto序列，所述蛋白质具有：(iii)序列表中seqidno.6所述的氨基酸序列；或(iv)在(iii)所述序列的c端融合了蛋白标签序列的氨基酸序列。本发明通过采用具有特定氨基酸序列的蛋白质来达到dna吸附、分离以及纯化的目的。通过本申请具有(i)所述核苷酸序列的基因编码得到的，或通过其它方式得到的具有(iii)所述氨基酸序列的蛋白质，其与含有teto序列的dna的结合力明显高于常见转录因子，分离常数值得以降低(现有的转录因子与dna结合的分离常数值通常在10-8-10-6m，结合力较弱)，从而获得对dna进行纯化的前提条件。通过本申请具有(ii)所述核苷酸序列的基因编码得到，或通过其它方式得到具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质后，其可以在结合了含有teto序列的dna后获得结合物，将该结合物吸附到固态介质上，即可实现将dna从目标物中分离出来，然后再利用四环素或四环素类似物对其进行处理，即可获得从结合物中分离出来的dna，从而实现对dna进行纯化的目的。上述方式解决了现有dna纯化方法操作复杂、回收效率偏低的问题。本申请具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质可有效的分离、纯化dna，尤其是含有teto序列的dna，无论是dna片段还是环状的dna连接产物；并且前述蛋白质可用于纯化微克以下含量级别的dna，尤其是100纳克以下含量级别的dna。四环素是一种能通过结合细菌核糖体来抑制它们蛋白合成的抗生素。在进化过程中，细菌发展出一种将四环素转运到菌外的耐药机制。该耐药通路由四环素转运蛋白(teta)、抑制蛋白(tetr)和调控序列(teto)组成。其中teta是四环素转运蛋白，而tetr与teto的功能是协同调节teta的转录表达。当细菌中没有四环素或四环素浓度很低时，tetr通过结合teta启动子上的teto序列抑制teta的表达；而当菌内四环素浓度较高时，四环素能与tetr结合，改变它的构像，使它脱离teto，导致teta的转录表达，产生teta转运蛋白并排出四环素。除了四环素以外，多种四环素类似物也能与tetr结合，并降低它与teto的结合能力，其中脱水四环素(atc)的效率比四环素高100多倍，在20ng/ml的低浓度下就能引起tetr与teto的完全解离。本申请人发现，虽然利用前述tetr与teto的关系可以将tetr这种蛋白质作为dna纯化介质，但tetr与teto结合力不是很高,其kd值在10-8m左右，所以用于dna纯化，回收效率很低。发现得知：由于tetr在结合teto时必须形成二聚体，所以其结合力偏低的一个原因是其必须先形成二聚体，但当两个拷贝的tetr融合并通过合适的连接肽连接形成二连体，该二连体与teto结合时就比较容易形成分子内二聚体，从而大幅度提高两者的结合效率，降低其结合物的分离常数值。所述二连体即本申请具有(iii)所述氨基酸序列的蛋白质。另外，本申请在制备(iii)所述氨基酸序列的蛋白质时可以采用本申请所提供的具有(i)所述核苷酸序列的基因编码得到，依次由第一tetr基因编码序列、第一连接位点、连接肽、第二连接位点、第二tetr基因编码序列连接而成；在(i)所述核苷酸序列中，其中核苷酸1-624编码第一个tetr氨基酸序列，核苷酸625-630是第一连接位点，核苷酸631-705编码两个tetr之间的连接肽，核苷酸706-711是第二连接位点，核苷酸712-1335编码第二个tetr氨基酸序列，第一连接位点是bamhi位点，第二连接位点是ecori位点。为了提高融合基因的克隆稳定性，第二tetr基因编码序列经过变码处理，与第一tetr基因编码序列有一定的序列差异，可以有效防止它们之间发生重组。(i)所述基因编码出的蛋白质具有(iii)所述氨基酸序列，其中第1-208氨基酸是第一tetr序列，第238-445氨基酸是第二tetr序列，第209-237氨基酸是两个tetr之间的连接肽序列。将本申请所述二连体编码序列与蛋白标签编码序列融合可以获得本申请具有(ii)所述核苷酸序列的基因，优选序列表中seqidno.2至seqidno.5任一所述的核苷酸序列，其与前述(i)所述核苷酸序列的差异在于在(i)序列的3’端融合了蛋白标签编码序列，所述蛋白标签可优选是snap、clip、halo或生物素化标签(biotinylationtag)。(ii)所述核苷酸序列的基因编码出的蛋白质具有本申请(iv)所述的氨基酸序列，优选序列表中seqidno.7至seqidno.10任一所述的氨基酸序列。本发明所述编码用于dna纯化的蛋白质的基因以及相应蛋白质的制备均可以通过现有常规的人工合成和基因工程方法获得，其中具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质也可以通过以下方式获得：将seqidno.1所示的核苷酸序列和蛋白标签编码序列克隆到蛋白表达载体上，然后将该蛋白表达载体转化到蛋白表达菌株里，经诱导细菌表达、纯化、获得具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质。本申请可以利用具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质进行dna结合、分离和纯化。具有(iv)所述的氨基酸序列的蛋白质的序列结构见图1，图1是本申请具有(iv)所述的氨基酸序列的结构示意图，其中tetr是大肠杆菌的四环素抑制蛋白；连接肽是一段25个氨基酸的多肽，它将两个tetr序列连接形成一个tetr-linker-tetr的二连体，下文简称tlt，其序列结构是本申请(iii)所述氨基酸序列；蛋白标签是能共价连接或紧密结合到相应固相基质上的蛋白纯化标签。蛋白标签可以是snap、clip、halo或生物素化标签(biotinylationtag，以下简称bt)，分别形成tlt-snap、tlt-clip、tlt-halo和tlt-bt等4种融合蛋白，其与dna结合获得结合物，将所述结合物吸附到固态介质上，例如共价连接到相应蛋白标签的纯化磁珠或琼脂糖珠上，从而将dna从目标物中分离出来；用四环素或四环素类似物处理结合物，获得从结合物中分离出来的dna，从而获得纯化后的dna。本申请纯化方法优选采用脱水四环素对结合物进行处理，因为脱水四环素(atc)的效率比四环素高100多倍，在20ng/ml的低浓度下就能引起tetr与teto的完全解离。用本申请具有(iv)所述氨基酸序列的蛋白质对含有teto序列的dna进行纯化，并和现有方法例如乙醇沉淀法、sio2亲和柱法纯化相比较可知，本申请所述纯化方法对于dna的纯化效果不仅可以解决结合力弱、分离条件苛刻的问题，还可以达到微克含量级别以下的纯化，甚至于100纳克含量级别以下的纯化。相同级别下，本申请所述纯化方法的纯化效率可以达到80％以上，所需时间是乙醇沉淀法的30％左右。本申请将以下述融合蛋白制备方法及dna纯化过程详细说明本申请实施方式纯化方法所能达到的纯化效果。1、编码基因的构建：第一tetr基因序列含有大肠杆菌tetr基因的原始序列，第二tetr基因序列含有经过idt公司的编码优化工具变码处理后的序列。第一tetr基因序列和第二tetr基因序列都可由人工直接合成。用含有xbai位点的引物1(序列表中seqidno.11)和含有bamhi位点的引物2(序列表中seqidno.12)进行pcr扩增第一tetr基因序列，经xbai/bamhi酶切，克隆到蛋白表达载体pet28a中的xbai和bamhi位点之间，获得pet28a-tetr1质粒；用含有ecori位点的引物3(序列表中seqidno.13)和含有hindiii位点的引物4(序列表中seqidno.14)进行pcr扩增第二tetr基因序列，经ecori/hindiii酶切，克隆到pet28a-tetr1质粒的ecori和hindiii位点之间，获得pet28a-tetr1-tetr2质粒；tetr1和tetr2之间的连接肽是将两个3’端互补的引物，引物5(序列表中seqidno.15)和引物6(序列表中seqidno.16)经混合、退火，加pcr缓冲液、dntp和taq酶，在72℃延伸成双链dna，该dna片段的一端含有bamhi位点，另一端含有ecori位点。在用bamhi和ecori酶切以后，该片段可被克隆到pet28a-tetr1-tetr2的bamhi和ecori位点之间，形成pet28-tetr1-linker-tetr2质粒(以下简称pet28a-tlt质粒)；其中tetr1-linker-tetr2片段具有本申请(i)所述的核苷酸序列。要获得(ii)所述核苷酸序列的编码基因的质粒，可将蛋白标签编码序列如编码snap、clip、halo或生物素化标签(biotinylationtag)中任一序列用pcr扩增后，克隆到tetr2下游的酶切位点中。2、蛋白质的制备：本申请所述蛋白质可以通过细菌蛋白表达系统进行制备。以本申请可用于纯化dna的蛋白质之一即序列表中seqidno.7所示的氨基酸序列为例，其制备过程如下：将pet28a-tlt-snap质粒转化到bl21(de3)蛋白表达菌株中。挑取单克隆接种到含50μg/ml卡那霉素的lb培养液中，当细菌浓度od600达到0.6时，加入1mm的iptg诱导细菌表达带有6xhis标签的tlt-snap。3个小时以后，将菌体离心沉淀，超声破碎，用ni离子亲和柱纯化tlt-snap。本申请中其它可用于纯化dna的蛋白质，tlt-clip融合蛋白、tlt-halo融合蛋白、tlt-bt融合蛋白，分别即序列表中seqidno.8至seqidno.10分别所示的氨基酸序列的制备方法(seqidno.8的氨基酸序列所融合的蛋白标签是clip，seqidno.9的氨基酸序列所融合的蛋白标签是halo，seqidno.10的氨基酸序列所融合的蛋白标签是生物素化标签)可参照前述蛋白质的制备方法进行制备获得。将所获得的蛋白质，序列表中seqidno.7至seqidno.10，分别进行以下对比试验。实施方式一比较用本申请蛋白质纯化、乙醇沉淀、sio2亲和柱纯化法进行dna片段纯化效率:该纯化实验所用的dna片段是两个末端分别带有一个teto序列的egfp基因片段。该dna片段通过用引物7(序列表中seqidno.17所示)和引物8(序列表中seqidno.18所示)，以pegfp-n1质粒为模板，通过pcr方法来制备。本申请蛋白质纯化：将1μg、200ng、100ng、50ngegfp-tetodna片段(序列表中seqidno.19所示)与1μg前述2制备得到的蛋白质混合，置于常温20分钟，然后在溶液中加入25μl蛋白标签结合磁珠，置于混合仪上缓速混合20分钟，用磁力沉淀珠子，清洗3次，先后两次加入12μl浓度为20ng/ml的atc溶液将蛋白质所结合的dna释放到溶液中。乙醇沉淀法纯化：在1.5ml离心管中加入1μg、200ng、100ng、50ngegfp-teto(序列表中seqidno.11所示)dna片段，用去离子水将体积调到50μl，加入6μl的3mnaoac溶液，混合，然后加入112μl的冰冻乙醇，在-70℃冷冻20分钟，然后离心15分钟沉淀dna。将沉淀用70％乙醇清洗3次，重新溶于24μl去离子水中。sio2亲和柱纯化：在1.5ml离心管中加入1μg、200ng、100ng、50ngegfp-tetodna片段(序列表中seqidno.19所示)，用去离子水将体积调到50μl，加入6m盐酸胍溶液100μl，混合后加入qiagen质粒小抽提所用的sio2亲和柱中，离心，用70％乙醇溶液清洗3次后，用24μl洗脱液将洗脱所结合的dna。对于1μg组样品，每个各取1/3上样，而其它组样品全部上样，用1％琼脂糖电泳分析、定量回收效率。针对本申请不同蛋白质，tlt-snap融合蛋白、tlt-clip融合蛋白、tlt-halo融合蛋白和tlt-bt融合蛋白，即分别是序列表中seqidno.7至seqidno.10所述的氨基酸序列，纯化dna后所得回收效率见下表1。运用本申请蛋白质即序列表中seqidno.7所示氨基酸序列的tlt-snap融合蛋白、乙醇沉淀法、sio2亲和柱纯化egfp-tetodna片段的结果见图2，其中a、用三种方法分别纯化回收1μg、200ng、100ng、50ng的egfp-tetodna片段的琼脂糖电泳结果。其中1μg组中的每个样品只取1/3上样电泳，而200ng、100ng和50ng组中的每个样品都全部上样电泳，每组中的对照样本是没有经过纯化的等量dna片段。b、用以上三种方法进行egfp-teto片段纯化的效率比较。结果表明，用tlt-snap融合蛋白进行dna纯化的回收效率比乙醇沉淀法和sio2亲和柱法高出50％以上。特别是当dna量低于200ng时，用tlt-snap融合蛋白纯化具有明显优势。表1用本申请不同蛋白质纯化100ngegfp-teto片段的回收效率融合蛋白tlt-snaptlt-cliptlt-halotlt-bt氨基酸序列seqidno.7seqidno.8seqidno.9seqidno.10回收效率88.6％85.7％91.3％82.1％实施方式二用本申请蛋白质纯化、乙醇沉淀、sio2亲和柱纯化法进行多个dna样品纯化的操作时间比较：分别用前述2制备得到的tlt-snap融合蛋白、乙醇沉淀、sio2亲和柱纯化法处理10、20、50个100ngegfp-teto片段样品，测定每种方法所需的时间，结果如图3。结果表明，在同时纯化10个或更多dna样本时，本申请所述蛋白质的纯化法所需的时间一般只有乙醇沉淀法的30％左右，与sio2亲和柱法相近。由于sio2亲和柱法需要离心去除携带有杂质的溶液，而本申请蛋白质纯化法可通过磁力沉淀将磁珠与溶液分离，操作较为简单，因此它更适用于高通量dna纯化。实施方式三用本申请蛋白质纯化、乙醇沉淀、sio2亲和柱纯化法进行dna连接产物纯化效率比较：将一个在xhoi、xbai位点之间加了2个teto序列的pcdna3.1(+)zeo载体用hindiii和ecori酶切，纯化后与一个含有egfp编码序列的dna片段用nebuilder试剂盒进行重组连接。分别用前述2制备得到的蛋白质、乙醇沉淀、sio2亲和柱法纯化200ng、100ng、50ngpcdna3.1(+)zeo-teto-egfp连接产物，将纯化后的dna用1％的琼脂糖胶电泳分离，比较回收效率。运用本申请所述蛋白质：tlt-snap融合蛋白、tlt-clip融合蛋白、tlt-halo融合蛋白和tlt-bt融合蛋白，即序列表中seqidno.7至seqidno.10所述氨基酸序列纯化时，所得结果如下表2。运用序列表中seqidno.7所示氨基酸序列的tlt-snap蛋白质、乙醇沉淀、sio2亲和柱法进行纯化pcdna3.1(+)zeo-teto-egfp连接产物后的结果如图4所示。其中a、用以上三种方法纯化回收200ng、100ng、50ngpcdna3.1(+)zeo-teto-egfp连接产物后的琼脂糖电泳分析结果，每组中的对照样本是没有经过纯化的等量连接产物；b、用以上三种方法纯化pcdna3.1(+)zeo-teto-egfp连接产物的相对回收效率。结果表明用tlt-snap融合蛋白纯化dna连接产物的回收效率比乙醇沉淀、sio2亲和柱法高2倍以上。对于100ng或更少量的连接产物，乙醇沉淀和sio2亲和柱法的效率低于10％，但用tlt-snap融合蛋白纯化法可获得80％以上的回收率。表2.用本申请不同蛋白质纯化100ngpcdna3.1(+)zeo-teto-egfp连接产物的回收效率融合蛋白tlt-snaptlt-cliptlt-halotlt-bt氨基酸序列seqidno.7seqidno.8seqidno.9seqidno.10纯化效率92.8％89.6％91.4％86.4％实施方式四用本申请蛋白质纯化、乙醇沉淀、sio2亲和柱纯化所回收的dna连接产物进行细菌转化效率比较：重复实施方式三，用tlt-snap融合蛋白、乙醇沉淀、sio2亲和柱纯化法回收的pcdna3.1(+)zeo-teto-egfp连接产物电转到dh5α菌株中，比较结果见图5。其中，a、200ng、100ng、50ngpcdna3.1(+)zeo-egfp-teto连接产物经纯化后，电转到dh5α菌株后所得到的菌落；b、纯化回收后的pcdna3.1(+)zeo-egfp-teto连接产物电转后所产生的菌落数目比较。结果表明用tlt-snap融合蛋白纯化法回收的dna连接产物具有优良的转化效率，说明该纯化过程中dna分子的损伤较少。实施方式一至四中所用dna中所含有的teto可以是如下表3中所示；另外，本申请所述的dna除其所含有的teto序列外，对其序列结构的其他序列部分不限。表3：可选teto序列1tccctatcagtgatagaga2cccctatcaatgatagaga3tccctatcggtgatagaga4tctctatcagtgatagagc以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>成都分子脉象生物科技有限公司<120>一种用于dna纯化的蛋白质及其编码基因、应用和纯化方法<130>mp170109cd<160>19<170>patentinversion3.5<210>1<211>1335<212>dna<213>人工合成<400>1atgatgtctcgtttagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgag60gtcggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcct120acattgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatg180ttagataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagatttttta240cgtaataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagta300catttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagccttt360ttatgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgcagtggggcat420tttactttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaa480acacctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcac540caaggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaa600caacttaaatgtgaaagtgggtctggatccagtggaggtgggggttctggtggcggaggg660tctgggggtggggggtctggaggaggaggttcggggggcggcggagaattcatgatgtct720cgactcgataagagcaaagtgattaattccgccctcgaactcctcaatgaggttgggatt780gagggcttgacaacgagaaaacttgctcaaaaacttggagtggaacagccaaccctttat840tggcacgttaaaaacaagcgagccctgcttgacgcgctcgctattgaaatgctcgacaga900caccacacacatttttgcccgttggaaggcgagtcctggcaggactttctccgaaacaac960gctaaaagtttccggtgtgctcttttgtcacatagggatggtgctaaggtacacctgggg1020acaaggcctacggaaaagcagtacgagactttggaaaaccaacttgctttcctttgccaa1080caaggtttcagtttggaaaacgcgttgtatgcgctcagtgcagtaggccactttactctc1140ggttgtgttctggaggatcaggaacaccaagtagccaaagaggaacgggagactcccacc1200actgacagtatgccaccccttctccgacaagctattgagctttttgaccaccagggggcg1260gaaccagcgtttctgtttgggctcgaattgataatttgtggattggaaaaacagctcaag1320tgcgaaagtggatca1335<210>2<211>1902<212>dna<213>人工合成<400>2atgatgtctcgtttagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgag60gtcggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcct120acattgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatg180ttagataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagatttttta240cgtaataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagta300catttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagccttt360ttatgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgcagtggggcat420tttactttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaa480acacctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcac540caaggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaa600caacttaaatgtgaaagtgggtctggatccagtggaggtgggggttctggtggcggaggg660tctgggggtggggggtctggaggaggaggttcggggggcggcggagaattcatgatgtct720cgactcgataagagcaaagtgattaattccgccctcgaactcctcaatgaggttgggatt780gagggcttgacaacgagaaaacttgctcaaaaacttggagtggaacagccaaccctttat840tggcacgttaaaaacaagcgagccctgcttgacgcgctcgctattgaaatgctcgacaga900caccacacacatttttgcccgttggaaggcgagtcctggcaggactttctccgaaacaac960gctaaaagtttccggtgtgctcttttgtcacatagggatggtgctaaggtacacctgggg1020acaaggcctacggaaaagcagtacgagactttggaaaaccaacttgctttcctttgccaa1080caaggtttcagtttggaaaacgcgttgtatgcgctcagtgcagtaggccactttactctc1140ggttgtgttctggaggatcaggaacaccaagtagccaaagaggaacgggagactcccacc1200actgacagtatgccaccccttctccgacaagctattgagctttttgaccaccagggggcg1260gaaccagcgtttctgtttgggctcgaattgataatttgtggattggaaaaacagctcaag1320tgcgaaagtggatcaaagcttggctcggcaggtagtatggacaaagactgcgaaatgaag1380cgcaccaccctggatagccctctgggcaagctggaactgtctgggtgcgaacagggcctg1440cacgagatcaagctgctgggcaaaggaacatctgccgccgacgccgtggaagtgcctgcc1500ccagccgccgtgctgggcggaccagagccactgatgcaggccaccgcctggctcaacgcc1560tactttcaccagcctgaggccatcgaggagttccctgtgccagccctgcaccacccagtg1620ttccagcaggagagctttacccgccaggtgctgtggaaactgctgaaagtggtgaagttc1680ggagaggtcatcagctaccagcagctggccgccctggccggcaatcccgccgccaccgcc1740gccgtgaaaaccgccctgagcggaaatcccgtgcccattctgatcccctgccaccgggtg1800gtgtctagctctggcgccgtggggggctacgagggcgggctcgccgtgaaagagtggctg1860ctggcccacgagggccacagactgggcaagcctgggctgggt1902<210>3<211>1902<212>dna<213>人工合成<400>3atgatgtctcgtttagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgag60gtcggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcct120acattgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatg180ttagataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagatttttta240cgtaataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagta300catttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagccttt360ttatgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgcagtggggcat420tttactttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaa480acacctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcac540caaggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaa600caacttaaatgtgaaagtgggtctggatccagtggaggtgggggttctggtggcggaggg660tctgggggtggggggtctggaggaggaggttcggggggcggcggagaattcatgatgtct720cgactcgataagagcaaagtgattaattccgccctcgaactcctcaatgaggttgggatt780gagggcttgacaacgagaaaacttgctcaaaaacttggagtggaacagccaaccctttat840tggcacgttaaaaacaagcgagccctgcttgacgcgctcgctattgaaatgctcgacaga900caccacacacatttttgcccgttggaaggcgagtcctggcaggactttctccgaaacaac960gctaaaagtttccggtgtgctcttttgtcacatagggatggtgctaaggtacacctgggg1020acaaggcctacggaaaagcagtacgagactttggaaaaccaacttgctttcctttgccaa1080caaggtttcagtttggaaaacgcgttgtatgcgctcagtgcagtaggccactttactctc1140ggttgtgttctggaggatcaggaacaccaagtagccaaagaggaacgggagactcccacc1200actgacagtatgccaccccttctccgacaag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