本发明涉及生物工程技术领域，尤指一种高温裂解酶组合物。
背景技术：
噬菌体被普遍认为是一类寄生在细菌中的病毒，也是生物界数量最为丰富的生命形式和庞大的基因资源库，依据其对宿主细胞生长的影响分为温和型及裂解型噬菌体，裂解型噬菌体能通过单一性地侵染宿主而实现自身的增值和宿主菌的裂解死亡，裂解酶为噬菌体感染宿主后期表达释放的一类细胞壁水解酶，通过水解细胞壁肽聚糖而使细菌裂解，并释放出子代噬菌体。
噬菌体裂解酶的底物特异性和酶活性各异，根据其作用于细胞壁肽聚糖共价键位点不同，噬菌体裂解酶可大致分为葡糖苷酶、酰胺酶、内肽酶和转糖基酶。一般来说噬菌体裂解酶在结构上含有2个结构域：n端催化和c端特异性底物结合区。部分裂解酶含三个区域，即增加了中央区域的酰胺酶或糖苷酶、转糖苷酶结构域，但许多来源与革兰氏阴性细菌噬菌体的裂解酶仅含n端的崔化区，分子量较小，氨基酸数目在300个一下，裂解酶基因不论从种类和功能上都非常丰富，这也是噬菌体与细菌细胞壁结构多样协同进化的体现，云南腾冲热海具有丰富的高温菌资源，国家基金：30660009,30960022，项目组从腾冲热海科考热泉区45-90℃、ph6.8-8.5的高温热泉中，获得了一批肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科、复层噬菌体科和丝状噬菌体科的高温噬菌体。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种高温裂解酶组合物，采用tsppgh和mmppgh组合，利用两种裂解酶具有的热稳定性，对高温下对栖热菌活菌体具有高效的裂解作用，而且在37℃，对大肠杆菌、芽孢杆菌活菌体也有杀灭效果。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
将上述分离的一株栖热菌tsp4和一株亚栖热菌噬菌体mmp17（两者宿主均为革兰氏阴性细菌）噬菌体的基因表明，它们分别编码的裂解酶tsppgh和mmppgh均属于m23家族蛋白酶，且均含有lysm结构域，两者的蛋白序列相似性仅为21%；
tsppgh和mmppgh的分子量分别为18.7kda和23.7kda；
tsppgh和mmppgh基因克隆入表达载体pet-28a质粒转化到大肠杆菌bl21菌株，iptg诱导表达，经镍柱亲和层析纯化，透析获得纯酶；
裂解酶tsppgh可以从菌体外对tc16活菌体进行快速杀灭，杀灭效果100%，tsppgh和mmppgh在37℃下对革兰氏阳性菌和阴性菌均有杀灭作用；
tsppgh最适合的反应温度为50-75℃，在37℃时对大肠杆菌、芽孢杆菌活菌体具有杀灭效果；
tsppgh和mmppgh按1%质量分数加入饲料预混料中，作为杀菌剂使用。
本发明的有益效果集中体现在，tsppgh和mmppgh的组合物对革兰氏阳性、革兰氏阴性、高温菌、常温菌以及耐药菌活体菌具有较强的杀灭效果，作为饲料添加剂加入到饲料中可有效的防止饲料被细菌感染。
附图说明
图1为mmppgh的peptidasem23肽酶超家族保守结构域；
图2为栖热噬菌体tsp4裂解酶基因tsppgh的结构域分布；
图3为裂解酶tsppgh对菌体thermustc16裂解的光学显微镜观察；
图4为裂解酶对弹性蛋白酶的降解效果。
具体实施方式
下面结合附图进一步阐述本发明。
由图1、图2可以了解到tsppgh和mmppgh具有peptidasem23肽酶相似的结构，tsppgh和mmppgh的分子量分别为18.7kda和23.7kda。
由图3所示，以宿主菌tc16活菌株（革兰氏阴性菌高温菌）制作双上层，将酶液（蛋白含量为0.200mg/ml）点至平板上，静置20min后密封平板与70℃倒置培养过液，可见裂解酶能形成明显的抑制菌圈，在5ml菌株培养液中加入50ul裂解酶tsppgh（等量bsa为对照），于70℃，100rpm振荡培养，随着时间的推移，裂解酶可以导致菌体破裂，释放出细胞里的原生质，使菌体相互粘连，30分钟内，粘连的菌体被完全降解，可见裂解酶tsppgh可以从菌体外对tc16活菌体进行快速的杀灭，杀灭效果达到100%，在70℃，30分钟，2ug/ml的浓度，裂解酶能对thermustc16菌株致死率达100%，最小抑制浓度为0.82ug/ml，对大肠杆菌最小抑制浓度为1.5ug/ml。
由图4所示，将用肉肌腱制备的弹性蛋白初品用mmppgh放入含浓度为50ug/ml的eppendorf管中，于65℃反应12小时，可见弹性蛋白被完全降解，图中1号管是加入灭活酶对照，2号为反应3小时，3号为反应6小时，4号为反应12小时，a为对照的显微镜，b为反应3小时显微观察。
一株栖热菌tsp4和一株亚栖热菌噬菌体mmp17（两者宿主均为革兰氏阴性细菌）噬菌体的基因表明，它们分别编码的裂解酶tsppgh和mmppgh均属于m23家族蛋白酶，且均含有lysm结构域，两者的蛋白序列相似性仅为21%；
tsppgh和mmppgh基因克隆入表达载体pet-28a质粒转化到大肠杆菌bl21菌株，iptg诱导表达，经镍柱亲和层析纯化，透析获得纯酶；
裂解酶tsppgh可以从菌体外对tc16活菌体进行快速杀灭，杀灭效果100%，tsppgh和mmppgh在37℃下对革兰氏阳性菌和阴性菌均有杀灭作用；
tsppgh和mmppgh按1%质量分数加入饲料预混料中，作为杀菌剂使用。