一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法与流程

本发明涉及一种细胞体外培养方法，特别涉及一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法。

背景技术：

中华鳖，又名水鱼、甲鱼、团鱼，是常见的养殖龟种。中华鳖生活于江河、湖沼、池塘、水库等水流平缓、鱼虾繁生的淡水水域，也常出没于大山溪中。在安静、清洁、阳光充足的水岸边活动较频繁，有时上岸但不能离水源太远。能在陆地上爬行、攀登，也能在水中自由游泳。喜晒太阳或乘凉风。民间谚语形容鳖的活动是“春天发水走上滩，夏日炎炎柳荫栖，秋天凉了入水底，冬季严寒钻泥潭”。夏季有晒甲习惯，寒冷的冬季会冬眠，翌年开始苏醒寻食。喜食鱼虾、昆虫等，也食水草、谷类等植物性食物，并特别嗜食臭鱼、烂虾等腐食，耐饥饿，但贪食且残忍，如食饵缺乏还会互相残食。性怯懦怕声响，白天潜伏水中或淤泥中，夜间出水觅食。

中华鳖是国内主要的淡水名优特色养殖品种，国内第一个淡水鱼类细胞系ZC-7901由张念慈杨广智(1981)发表在水产学报上。以后有不少淡水鱼类细胞系的建立。而中华鳖细胞体外培养也有报道。其中吴康，薛明强等(2000)发表在中国水产科学，中华鳖胚胎细胞体外培养的研究；李晓莉，曾令兵等(2010)发表在水生态学杂志上的中华鳖5种组织细胞的离体培养实验；付建平，聂品等建立中华鳖主动脉平滑肌细胞系STA(soft-shelled turtle artery)，于2013年发表在Fish Pathology上。上述方法存在操作复杂，条件较苛刻，培养成功率较低的不足。中华鳖肺巨噬细胞的培养方法也未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法，操作简单，培养方便，培养成功率高，特别是冲洗离体肺组织，使得肺组织原代细胞分离培养容易方便，为中华鳖病毒研究提供有效的细胞介质。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法，包括以下步骤：

一、中华鳖完整肺巨噬细胞的分离：

(1)取100-500g重的中华鳖，体表消毒，采用断颈法处死，解剖取出完整肺部组织；

(2)肺部组织置于预冷的加双抗的PBS液中，去除多余的其它组织，洗涤3次，然后放入预冷的HBSS平衡盐溶液中；

(3)采用含有3％胎牛血清的M199液体培养基为洗涤液注入肺部，冲洗两次，合并两次所得的冲洗液；

(4)冲洗液过100μm滤网，一次离心，去上清，沉淀加红细胞裂解液裂解红细胞5-8min，100μm滤网过滤，二次离心，二次离心所得细胞沉淀待用；

二、肺巨噬细胞的原代培养：

二次离心所得细胞沉淀用细胞培养液重悬，按1×10⁶～5×10⁶个/ml细胞分装至细胞培养瓶培养，28～30℃，5％CO₂条件下培养。

作为优选，步骤(1)中，体表消毒采用0.1％高锰酸钾浸泡20-30min。

作为优选，步骤(2)中，加双抗的PBS液pH为7.4，双抗为500μg/ml青霉素，500μg/ml链霉素。

作为优选，步骤(3)中，冲洗操作为将洗涤液注入肺部，保持洗涤液在肺内并晃动1-3分钟，从气管处倒出洗涤液得到冲洗液。

作为优选，步骤(4)中，一次离心参数为800r/min离心5min，二次离心参数为800r/min离心5min。

作为优选，所述细胞培养液为含有20-30％胎牛血清、100μg/mL青霉素及100μg/mL链霉素的M199液体培养基。

作为优选，细胞培养瓶使用前，先用1％明胶铺板，置于37℃孵育2～4h，再去除明胶。这样操作有利于肺巨噬细胞的贴壁生长。

作为优选，28～30℃，5％CO₂条件下培养3～4h后，更换细胞培养液以去除未贴壁的红细胞和死细胞，继续培养12～16h，更换细胞培养液进一步除去残留红细胞，继续培养。

本发明的有益效果是：本发明建立了中华鳖肺巨噬细胞的原代细胞培养方法，其特点是操作简单，培养方便，无需特定的细胞分离液。用直接冲洗法即可有效获得贴壁生长的肺巨噬细胞，能在本发明中描述的培养条件下维持正常形态12-20d，可满足后续较多的生物学实验，实用性非常高。可推广应用于其他爬行类水生动物肺巨噬细胞的原代培养。

附图说明

图1是中华鳖离体肺组织。

图2是贴壁生长的肺巨噬细胞。

图3是肺巨噬细胞的ACP染色鉴定。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法，包括以下步骤：

一、中华鳖完整肺巨噬细胞的分离：

(1)取100-500g重的中华鳖，采用0.1％高锰酸钾浸泡20-30min进行体表消毒，采用断颈法处死，并尽量挤出血后，解剖取出完整肺部组织(带部分气管，见图1)；

(2)肺部组织置于预冷的加双抗的PBS液(pH 7.4，双抗为500μg/ml青霉素，500μg/ml链霉素)中，去除脂肪和结缔组织等多余的其它组织，洗涤3次，然后放入预冷的HBSS平衡盐溶液(市售)中；

(3)用无菌镊子提起与肺部相连的气管，将含有3％胎牛血清的M199液体培养基为洗涤液注入肺部，此时肺部膨胀，用另一把镊子提起肺底部，两端轻轻晃动约1-3min，从气管处倒出洗涤液完成一次冲洗，重复冲洗1次，合并两次所得的冲洗液；

(4)冲洗液100μm滤网过滤，一次离心(800r/min离心5min)，去上清，沉淀加红细胞裂解液(市售)裂解红细胞5-8min，100μm滤网过滤，二次离心(800r/min离心5min)，二次离心所得细胞沉淀待用；

二、肺巨噬细胞的原代培养：

二次离心所得细胞沉淀用细胞培养液(含有20-30％胎牛血清、100μg/mL青霉素及100μg/mL链霉素的M199液体培养基)重悬，按1×10⁶～5×10⁶个/ml细胞分装至细胞培养瓶培养，28～30℃，5％CO₂条件下培养3～4h后，更换细胞培养液以去除未贴壁的红细胞和死细胞，继续培养12～16h，更换细胞培养液进一步除去残留红细胞，余下大部分为肺巨噬细胞，纯度可达75-90％，继续培养。细胞培养瓶使用前，先用1％明胶铺板(即明胶覆盖细胞培养瓶)，置于37℃孵育2～4h，再去除明胶。

细胞形态观察及鉴定：在100×和400×相差显微镜下观察细胞，其中巨噬细胞呈大多易于聚集成团生长，表面粗糙；有少量红细胞呈椭圆形，表面较为光滑(图2)。巨噬细胞因酸性磷酸酶活性较高，经ACP染色试剂盒染色后，细胞呈红色(图3)。分离培养后的细胞大多可被ACP染色试剂染成红色，表明分离培养的细胞多为肺巨噬细胞。可用于后续实验。

目前中华鳖肺巨噬细胞细胞可在体外培养12-20天，细胞仍维持良好状态。本发明可获得纯度达75-90％肺巨噬细胞，可用于中华鳖病毒感染等实验研究。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。