一种人羊膜间充质干细胞的专用培养基的制作方法

本发明涉及一种人羊膜间充质干细胞的专用培养基，属于生物技术领域。

背景技术：

人羊膜干细胞具有高度自我更新、增殖、可植入性和多系分化能力，异基因个体移植后无免疫排斥和致瘤性风险。而且，人羊膜干细胞来源于产妇分娩后废弃的胎盘，应用到临床不会带来医学伦理争议。羊膜干细胞具有明显的集落形成能力、增殖能力、胚胎干性、免疫调节能力及无异基因移植排斥反应与致瘤性等优良生物学特性，可用来进行诸多疾病的细胞治疗、组织器官损伤的修复与重建，是再生医学领域理想的种子细胞资源，具有广阔的临床应用前景。

近些年来，大量的研究表明，羊膜干细胞，既具有向同一胚层不同类型细胞分化的多向分化潜能，又有跨系跨胚层分化的能力，展示出良好的可塑性。如，起源中胚层的细胞既能向成骨、软骨、脂肪等中胚层细胞分化，亦可向胰腺细胞、肝细胞等内胚层细胞、神经细胞等外胚层细胞分化。

人羊膜干细胞不仅具有显著的自我更新能力及跨系跨胚层多系分化潜能，且相对胚胎干细胞和其它成体干细胞，其资源丰富，易获得，无伦理争议，免疫原性低，无致瘤风险，还具分泌免疫抑制因子、神经营养因子等多种生物活性因子的强大旁分泌或自分泌功能。这些特性赋予了它在组织工程、细胞治疗、基因治疗等相关再生医学领域不可估量的临床应用价值。

现有技术中，干细胞的培养体系主要应用含动物血清(如FBS)的培养基，BMSCs和脐带血间充质干细胞的培养也多采用FBS。人羊膜间充质干细胞的培养体系通常为LG-DMEM培养基中加入10％的FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸2-巯基乙醇和1mmol/L丙酮酸钠。但FBS等动物血清的应用，在干细胞移植后，输入异种蛋白对患者存在潜在的威胁，可产生抗FBS抗体及其他尚未知晓的不良反应，而且可能造成人与其他物种间病毒感染的传播。

技术实现要素：

本发明要解决技术问题是提供一种不含动物血清的人羊膜间充质干细胞的专用培养基。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

人羊膜间充质干细胞专用培养基，由α-MEM培养基、人血浆和人血白蛋白组成，其中人血浆的体积百分比浓度是10％，人血白蛋白的浓度为1％(g/100ml)。

α-MEM培养基为干细胞培养的基础培养基，其成分和配制方法为本领域公知常识。自行配制或购买商业化的α-MEM培养基均可用于本发明。

所述人血浆为人AB型血浆。

所述人羊膜间充质干细胞专用培养基的pH值为7.2-7.4。

本发明所述人羊膜间充质干细胞专用培养基可以用于培养人羊膜单个核细胞和/或人羊膜间充质干细胞。

本发明还提供了一种培养人羊膜间充质干细胞的方法，将离体的人羊膜单个核细胞按个细胞/cm²接种于培养瓶中，培养于37℃，培养箱，培养液为本发明的人羊膜间充质干细胞专用培养基；24小时后换液，弃非贴壁细胞，以后每2～3天换液；待人羊膜间充质干细胞生长到70～80％融合，用胰酶消化(1～2分钟)，按0.8×10⁴～1.0×10⁴个细胞/cm²传代；每2～3天用该人羊膜间充质干细胞专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在5×10⁵～10×10⁵个细胞/mL；每次传代培养的条件均为37℃，传代得到人羊膜间充质干细胞。

本发明还提供了一种采用本发明人羊膜间充质干细胞专用培养基培养得到的人羊膜间充质干细胞，表达如下三种间充质干细胞细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90和人白细胞分化抗原不表达如下二种细胞膜分子：人白细胞分化抗原和人白细胞抗原HLA-DR。

本发明的优点是：本发明的专用培养基成分简单，制备方便，不含动物血清，既能促进人羊膜间充质干细胞增殖，细胞纯度高，可满足细胞治疗的临床条件，安全可靠，可用于干细胞体外扩增。本发明培养基选择性强，可从人羊膜单个核细胞中特异性富集人羊膜间充质干细胞。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做详细说明，并非对本发明的限定，凡依照本申请公开文件所进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1A为人羊膜间充质干细胞刚贴壁时的情况

图1B为人羊膜间充质干细胞开始生长时的情况

图1C为人羊膜间充质干细胞增殖后的情况

图2A为人羊膜间充质干细胞通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD73的表达情况

图2B为人羊膜间充质干细胞通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD90的表达情况

图2C为人羊膜间充质干细胞通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原的表达情况

图2D为人羊膜间充质干细胞通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原的表达情况

图2E为人羊膜间充质干细胞通过流式细胞仪检测人白细胞抗原HLA-DR的表达情况

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

α-MEM培养基为Gibco公司的产品，其产品编号为：11900024。

人AB血浆购自北京红十字血液中心。

注射用人血白蛋白(国药准字S20030043)。

实施例1、人羊膜间充质干细胞专用培养基

人羊膜间充质干细胞专用培养基，由α-MEM培养基、人AB型血浆和人血白蛋白组成，其中人AB型血浆的体积百分比浓度是10％，人血白蛋白的浓度为1％(g/100ml)。

α-MEM培养基为美国Gibco公司的产品，商品编号为11900024。

培养基的pH值为7.2-7.4

实施例2、人羊膜间充质干细胞的分离培养

1、细胞分离

(1)羊膜取自足月剖宫产健康产妇，采集后处理。

(2)将直径为的羊膜用0.9％氯化钠溶液清洗，剪碎至约1mm×1mm×1mm，经0.1％胶原酶和％的胰酶37℃消化用α-MEM(Gibco，USA)稀释至40ml。

(3)将上述液体先后用100目及200目滤网过滤，去未消化的组织。

(4)过滤后的含细胞的液体置于离心管中，配平后放置在低温离心机内，以离心力300Xg，温度4±2℃，离心8分钟。

停机后轻轻取出离心管置于试管架上，离心管内容物分为二部分，上层为胶原酶、胰酶和α-MEM培养基，下层为组织碎块与细胞混合物。

将上层胶原酶、胰酶和α-MEM培养基吸出。

(7)将所分离的人羊膜单个核细胞用α-MEM培养基稀释后2000r/min离心10min洗二次。

2、细胞培养

将分离的人羊膜单个核细胞按个细胞/cm²接种于塑料培养瓶，培养于37℃，培养箱，培养液为人羊膜间充质干细胞专用培养基(按实施例1制备)。24小时后换液，弃非贴壁细胞，以后每2～3天换液；待人羊膜间充质干细胞生长到70～80％融合，用胰酶(Sigma，USA)消化(1～2分钟)，按0.8×10⁴～1.0×10⁴个细胞/cm²传代。每2～3天用该人羊膜间充质干细胞专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在5～10×10⁵个细胞/mL。每次传代培养的条件均为37℃，传代得到人羊膜间充质干细胞。

图1A为人羊膜间充质干细胞刚贴壁时的情况，为形态呈细小的圆形。

图1B为人羊膜间充质干细胞开始生长时的情况，48小时后，细胞开始增殖，向长梭形转变。

图1C为人羊膜间充质干细胞增殖后的情况，一周后细胞开始增殖形成大小不等的细胞集落。

实施例3：流式细胞检测

一、方法

实施例2得到的人羊膜间充质干细胞，用抗人CD73单克隆抗体(BioLegend，USA)通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD73的表达情况，用抗人CD90单克隆抗体(BioLegend，USA)通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原CD90的表达情况，用抗人单克隆抗体(BioLegend，USA)通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原的表达情况，用抗人单克隆抗体(BioLegend，USA)通过流式细胞仪检测人白细胞分化抗原的表达情况，用抗人白细胞抗原HLA-DR单克隆抗体(BioLegend，USA)通过流式细胞仪(型号FACSCaliburBD公司)检测人白细胞抗原HLA-DR的表达情况。

二、结果

结果如图2A、图2B、图2C、图2D和图2E所示，表明该人羊膜间充质干细胞表达人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90和人白细胞分化抗原不表达人白细胞分化抗原和人白细胞抗原HLA-DR。流式细胞仪检测结果表明该人羊膜间充质干细胞的纯度达到