一种发酵诺尼果种子精油的提取方法与流程

本发明属于植物提取物制备方法技术领域，具体涉及一种发酵诺尼果种子中提取精油的方法。

背景技术：

诺尼为茜草科巴戟天属，诺尼(Noni)又称海巴戟天、印度桑葚，是一种生长于热带地区的多年生常绿阔叶一种灌木或小乔木,高3-10米，有大量的椭圆形的叶子(长5-17厘米，宽10-40厘米)。在我国海南省和台湾省部分地区有种植。它的根、树皮、茎、叶、果实已作为传统民间医药用于治疗多种疾病，如糖尿病、高血压和癌症等。新鲜诺尼果实中含有80％的水分，主要的干物质是可溶性固体、膳食纤维和蛋白质。在成熟果实中，已确定的挥发性化合物为有机酸、醇类、酯类、酮类和内酯类，诺尼果中还含有胡萝卜素、维生素C、氨基酸和赛诺宁原等活性物质。诺尼果属于常绿热带果树，一年之中均可采收到成熟的果实。花冠青白色诺尼果(长3-10厘米，宽3-6厘米，呈椭圆形)肉质肥厚外观具有浮雕感。一般采摘的果实为白色。诺尼果的表面被含有红褐色芽的种子所覆盖。成熟的果实散发出一股强烈的丁酸腐臭味。果实成熟后，形状为卵形,果肉多汁，略暗黄或者白色，呈凝胶状，其中有许多红褐色硬三角坑，每个硬三角坑内含有四个种子。起初未成熟的果实是绿色的，成熟后变黄，过于成熟时变软呈半透明状并散发出令人不愉快的丁酸气味。

近年来，诺尼果成为国内外保健食品行业一种具有保护血管、抗氧化、护肝，抗过敏、抗细菌、抗病毒、抗霉菌、抗癌、增强免疫力等功效。2004年，我国学者在西沙永兴岛发现了中国诺尼果种质资源。2005年，海南诺尼产业园开发有限公司启动诺尼的人工培育和系列产品研发计划，目前已在海南建成3000多亩西沙诺尼示范种植基地，自主研发的西沙诺尼系列产品，包括西沙诺尼酵素、西沙诺尼茶、西沙诺尼香皂等已全面进入市场。诺尼果实在制作发酵饮料与未发酵饮料的过程中会产生大量的废弃物，目前，诺尼的产品大多是以诺尼果发酵后的液体供给市场，但诺尼果发酵后的果渣包括种子尚未得到充分利用。目前针对发酵诺尼果种子提取精油的研究还较少，未见相关的专利及文献报道。

技术实现要素：

为解决上述技术问题所采用的技术方案是：提供一种提取发酵诺尼果种子精油的制备方法。具体的技术方案如下：

(1)预处理：将发酵过的诺尼果种子烘干，粉碎，过筛，留用；

(2)浸泡：称取预处理过的发酵诺尼果种子粉，与95％的乙醇溶液混合，固液比1:8～12，常温浸泡4～10h；

(3)抽滤：将浸泡液通过布氏漏斗抽滤得到上清液；

(4)高速离心：将上清液用高速离心机进行离心，得到不含杂质的上层清液；

(5)旋转蒸发：将上层清液通过旋转蒸发仪蒸发溶剂，得到提取物；

(6)高速离心：将去除溶剂的提取物再次高速离心，转速5000～10000r/min，时间3～10min，得到油状物质；

(7)冷藏：将得到的油状物质放入冰箱静置冷藏，温度0～8℃，冷藏时间为1～10h，获得发酵诺尼果种子精油分层，上下两层油状物质，上层为浅褐色，下层颜色为深褐色。

对于上述技术方案中，所述的发酵诺尼果种子的发酵方法为：采摘白色诺尼鲜果，清洗，投入发酵罐，厌氧发酵温度控制20～40℃，发酵时间100～150d；PH值6.8-7.2；利用诺尼果自身的内生菌，菌株CICC10883可可豆醋杆菌既能完成发酵，取发酵产物中的固形物，备用。其中，所用的细菌CICC 10883的鉴定与生物学特性在文献中已有研究：《1株西沙诺尼果原浆细菌CICC 10883的鉴定与生物学特性》，《中国食品学报》2016年第8期，曹艳花等。

对于上述技术方案中，所述的烘干温度是50～60℃所述过筛是20～100目筛。

对于上述技术方案中，步骤(4)所述的离心是将上清液以5000～10000r/min离心3～10min。

对于上述技术方案中，所述的旋转蒸发，是在观察旋转蒸发仪冷凝管中没有液滴滴下时结束蒸发。

本发明的方法简单，发酵诺尼果种子精油具有极强的抗氧化性，加工过程安全环保，可作为化妆品添加剂使用。

附图说明

图1：技术路线示意图；

图2：乙醇萃取后的油状物质；其中：A为未发酵诺尼果种子经过95％乙醇萃取后得到的提取物；B为发酵诺尼果种子经过95％乙醇萃取后得到的提取物；从图2中可以看出发酵诺尼果种子经过95％乙醇萃取后的精油提取率比未发酵诺尼果种子精油提取率高。

图3：乙醇萃取发酵诺尼果种子精油的总离子流图。对于乙醇萃取发酵所得到的有效成分较少而且大多数为保留时间较长的分子量大的有机物。表明经过发酵处理后的诺尼其内部化学成分及其含量发生了很大的变化。发酵诺尼果种子精油中的酯类均为辛酸酯类；在发酵诺尼果种子精油中均发现丁香油酚的存在，发酵精油丁香油酚含量为0.89％，研究表明丁香油酚具有抗氧化性。

图4：DPPH自由基和乙醇萃取发酵诺尼果种子精油下层有效成分顺磁波谱。图4A中可以分析出DPPH在3475-3675处有3对特征峰。信号强度为140000左右。此特征峰与文献报道相符合。诺尼有效成分无明显的特征峰(磁场强度3600处的峰为空气峰)。将体积分数为4‰的有机溶剂萃取的发酵诺尼果种子精油发酵下层DPPH溶液进行顺磁检测，其结果如图4B所示。通过对顺磁波谱图进行分析，发现在3475-3675处有3对信号强度为140000特征峰已经消失，由此可以推断出DPPH自由基已经被完全被清除。表明体积分数为4‰的诺尼有效成分具有极高的抗氧化性。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明保护范畴。

实施例1

1.诺尼果种子的发酵方法为：采摘白色诺尼鲜果，清洗，投入发酵罐，厌氧发酵温度控制25℃，发酵时间150d；PH值6.8-7.2；利用诺尼果自身的内生菌，菌株CICC10883可可豆醋杆菌既能完成发酵，取发酵产物中的固形物，备用。

2.将发酵过的诺尼种子60℃烘干后，粉碎过80目筛，称取预处理过的发酵诺尼果种子粉，用无水乙醇和超纯水配制95％的乙醇溶液。按照产物和溶剂比例为1：10向20g发酵(未发酵)果仁中加入200mL 95％乙醇溶液，浸泡6h后；通过抽滤初步得到上层清液，取上层清液通过高速离心机(8000r/min，时间5min)得到不含杂质的上层清液。将上层清液通过旋转蒸发仪蒸发溶剂，观察旋转蒸发仪冷凝管中没有液滴滴下时结束蒸发；将去除溶剂的提取物再次高速离心，转速8000r/min，时间5min；将得到的油状物质放入冰箱静置冷藏，温度5℃，冷藏时间为2h，获得发酵诺尼果种子精油，该精油分上下两层油状物质，上层为浅褐色，下层颜色为深褐色，见附图1，发酵诺尼提取物平均含量为6.1mL。

有机溶剂萃取的发酵诺尼果种子提取物，按上述方法制备并检测，得到样品的总离子流图。对总离子流图见附图3及表1。乙醇萃取发酵诺尼果实得到有效成分共检测到18种物质，鉴定了其中的15种物质，占化合物总数的83.33％，所鉴定的化合物含量占提取物总含量的98.93％。主要为酯类和酸类物质，酯类物质占72.09％，酯类主要是棕榈酸乙酯(40.50％)，邻苯二甲酸二(α-乙基己)酯(18.71％)，酸类物质占6.97％，有机酸主要是辛酸(6.63％)。在有效成分中角鲨烯(12.95％)，在鉴定的化合物发现了一种苯的衍生物——角鲨烯(1.84％)其具有保肝作用，可促进肝细胞再生并保护肝细胞，从而改善肝脏功能，且具有抗肿瘤活性等。维生素E(5.92％)。甾醇类物质占1％，分别为菜油甾醇(0.45％)豆甾醇(0.55％)。

95％乙醇萃取所得到有效成分含有分子量较大的有机物，如在乙醇萃取发酵和未发酵诺尼均得到亚油酸异丙酯，角鲨烯，棕榈酸乙酯等分子量较大的有机物。所以根据GC-MS数据分析可以得出水蒸气蒸馏所得到的主要化学组成为分子量较小的可挥发有机酯类物质，本发明所述方法95％乙醇萃取所得到的主要化学组成为分子量较大的有机物，其中角鲨烯具有抗肿瘤等生物活性。

实施例2

1.诺尼果种子的发酵方法为：采摘白色诺尼鲜果，清洗，投入发酵罐，厌氧发酵温度控制25℃，发酵时间150d；PH值6.8-7.2；利用诺尼果自身的内生菌，菌株CICC10883可可豆醋杆菌既能完成发酵，取发酵产物中的固形物，备用。

2.将发酵过的诺尼种子50℃烘干后，粉碎过90目筛，称取预处理过的发酵诺尼果种子粉，用无水乙醇和超纯水配制95％的乙醇溶液。按照产物和溶剂比例为1：9向20g发酵(未发酵)果仁中加入200mL 95％乙醇溶液，浸泡8h后；通过抽滤初步得到上层清液，取上层清液通过高速离心机(9000r/min，时间10min)得到不含杂质的上层清液。将上层清液通过旋转蒸发仪蒸发溶剂，观察旋转蒸发仪冷凝管中没有液滴滴下时结束蒸发；将去除溶剂的提取物再次高速离心，转速8500r/min，时间10min；将得到的油状物质放入冰箱静置冷藏，温度4℃，冷藏时间为3h，获得发酵诺尼果种子精油，该精油分上下两层油状物质，上层为浅褐色，下层颜色为深褐色，见附图1，发酵诺尼提取物平均含量为6.7mL。

实施例3

1.诺尼果种子的发酵方法为：采摘白色诺尼鲜果，清洗，投入发酵罐，厌氧发酵温度控制25℃，发酵时间150d；PH值6.8-7.2；利用诺尼果自身的内生菌，菌株CICC10883可可豆醋杆菌既能完成发酵，取发酵产物中的固形物，备用。

2.将发酵过的诺尼种子55℃烘干后，粉碎过100目筛，称取预处理过的发酵诺尼果种子粉，用无水乙醇和超纯水配制95％的乙醇溶液。按照产物和溶剂比例为1：11向2发酵(未发酵)果仁中加入95％乙醇溶液，浸泡4h后；通过抽滤初步得到上层清液，取上层清液通过高速离心机(10000r/min，时间8min)得到不含杂质的上层清液。将上层清液通过旋转蒸发仪蒸发溶剂，观察旋转蒸发仪冷凝管中没有液滴滴下时结束蒸发；将去除溶剂的提取物再次高速离心，转速9000r/min，时间10min；将得到的油状物质放入冰箱静置冷藏，温度6℃，冷藏时间为4h，获得发酵诺尼果种子精油，该精油分上下两层油状物质，上层为浅褐色，下层颜色为深褐色，见附图2，发酵诺尼提取物平均含量为5.6mL。

表1乙醇萃取发酵诺尼果种子获得的有效成分及各组分的相对含量

实施例4

1.诺尼果种子的发酵方法为：采摘白色诺尼鲜果，清洗，投入发酵罐，厌氧发酵温度控制25℃，发酵时间150d；PH值6.8-7.2；利用诺尼果自身的内生菌，菌株CICC10883可可豆醋杆菌既能完成发酵，取发酵产物中的固形物，备用。

2.将发酵过的诺尼种子50℃烘干后，粉碎过60目筛，称取预处理过的发酵诺尼果种子粉，用无水乙醇和超纯水配制95％的乙醇溶液。按照产物和溶剂比例为1：10向发酵诺尼果种子中加入95％乙醇溶液，浸泡7h后；通过抽滤初步得到上层清液，取上层清液通过高速离心机(8500r/min，时间5min)得到不含杂质的上层清液。将上层清液通过旋转蒸发仪蒸发溶剂，观察旋转蒸发仪冷凝管中没有液滴滴下时结束蒸发；将去除溶剂的提取物再次高速离心，转速8000r/min，时间8min；将得到的油状物质放入冰箱静置冷藏，温度5℃，冷藏时间为2h，获得发酵诺尼果种子精油，该精油分上下两层油状物质，上层为颜色较浅，下层颜色较深，见附图2，发酵诺尼提取物平均含量为6.1mL。

取上述发酵诺尼果种子上层及下层精油进行电子顺磁抗氧化性实验，发现其清除DPPH自由基能力强，表明经95％乙醇萃取的发酵诺尼果种子精油具有极强的抗氧化活性，同时下层精油的抗氧化活性比上层精油抗氧化活性更强。