基于RPA技术检测菜豆荚斑驳病毒的方法、RPA引物及试剂盒与流程

本发明涉及生物检测领域，特别涉及检测菜豆荚斑驳病毒的RPA方法、引物及试剂盒。
背景技术：
：菜豆荚斑驳病毒是危害大豆等豆科植物的重要病毒，在我国目前并无此病毒的分布，其主要发生于美国、加拿大、巴西、秘鲁、厄瓜多尔等大豆产区，自然寄主有大豆、豇豆、菜豆，实验寄主有20属25种植物，可以通过汁液接种传播、甲虫传播和种子远距离传播。根据病毒侵染时间的不同，该病毒能够造成3％至52％的产量损失并降低大豆品质，如与大豆花叶病毒混合侵染，可造成高达85％的大豆产量损失，一旦传入我国并定殖下来，将很难根除，会对我国农业生产造成重大损失。因此，该病毒已被列入我国新修订的植物检疫性有害生物名单中，由于目前尚无有效的病毒防治方法，因此加强出入境检验检疫工作是防止这种病毒传入的最有效的途径之一。我国每年从国外进口大量的大豆，为防止该危险性病毒的传入，必须加强开发该病毒的快速检测技术。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏、准确、简便和快速的基于RPA技术的检测菜豆荚斑驳病毒的方法，本发明还提供了用于该方法的特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广的RPA引物和含有该RPA引物的试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：本发明第一方面提供了一种引物对，其中一条引物包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本发明第二方面提供了所述的引物对在检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒，或制备检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的产品中的应用；在一优选例中，所述检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒包括：检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒，以及检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒；在一优选例中，所述制备检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的产品包括：制备检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒的产品，以及制备检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒的产品。本发明第三方面提供了一种试剂盒，包括所述的引物对。在一优选例中，还包括RPA恒温扩增试剂；在一优选例中，所述RPA恒温扩增试剂包括来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits所包含的试剂。在一优选例中，还包括植物总RNA提取试剂。在一优选例中，所述植物总RNA提取试剂包括来自天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒所包含的试剂。在一优选例中，还包括反转录试剂。在一优选例中，所述反转录试剂包括来自TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCRKit所包含的试剂。本发明第四方面提供了一种试剂盒在检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒，或制备检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的产品中的应用；在一优选例中，所述检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒包括：检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒，以及检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒；在一优选例中，所述制备检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的产品包括：制备检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒的产品，以及制备检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒的产品。本发明第五方面提供了一种检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的方法，包括使用所述的引物对或所述试剂盒的步骤。在一优选例中，所述检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒包括：检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒；以及检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒。在一优选例中，所述的方法包括如下步骤：1)RPA扩增从待测植物样品或待测病毒中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA，再以cDNA为模板与所述的引物对或所述试剂盒进行RPA扩增。2)根据RPA扩增的结果判断待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒，或待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒；在一优选例中，所述RPA扩增的结果判断的标准为：若所述RPA扩增得到的RPA扩增产物含有大小为198bp的片段，则所述待测植物样品感染菜豆荚斑驳病毒，或待测病毒为或候选为菜豆荚斑驳病毒；若所述RPA扩增产物不含有大小为198bp的片段，则所述待测植物样品未感染菜豆荚斑驳病毒，或待测病毒不为或候选不为菜豆荚斑驳病毒。在一优选例中，步骤1)中从待测植物样品中提取总RNA是采用天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒进行的；步骤1)中将总RNA反转录成cDNA是采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCRKit进行的。在一优选例中，所述RPA扩增的反应体系如下：含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管再水化缓冲液29.5μLSEQIDNO：1和SEQIDNO：2各2μL，引物的终浓度均为0.4μmol/LcDNA50ng醋酸镁溶液2.5μL，浓度为280mmol/L去离子水12.5μL在一优选例中，所述RPA扩增的反应条件如下：所述RPA扩增的温度为37℃，时间为40min。本发明提到的待测植物样品，可为植物的根﹑茎﹑叶等部分的成长的植物体；而待测病毒则是一种纯病毒或至少二种以上的病毒的混合。本发明的有益效果包括：(1)本发明针对菜豆荚斑驳病毒设计特异性RPA引物，建立了菜豆荚斑驳病毒RPA检测方法，可对菜豆荚斑驳病毒进行定性检测。(2)本发明针对菜豆荚斑驳病毒仅用一对引物即可完成扩增，省去了LAMP等其它恒温扩增方法需要的多对引物的复杂设计过程；本发明的引物扩增只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；反应时间仅需40min，检测时间短；不像LAMP产物的弥散带，RPA扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带，其结果易于判断。(3)本发明的RPA扩增引物特异性好、灵敏度高且适用范围广。(4)本发明建立的菜豆荚斑驳病毒RPA检测方法，灵敏、准确、简便和快速，对进出境相关植物及产品检验检疫具有指导意义。附图说明图1是采用本发明的RPA引物对多种病毒进行特异性检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有八条泳道：其中M为markerDL2000，1为菜豆荚斑驳病毒的RPA扩增产物，2为南方菜豆花叶病毒的RPA扩增产物，3为大豆花叶病毒的RPA扩增产物，4为南芥菜花叶病毒的RPA扩增产物，5为烟草环斑病毒的RPA扩增产物，6为阴性对照。图2是采用本发明的RPA引物对菜豆荚斑驳病毒进行灵敏度检测的琼脂糖凝胶电泳图，共有七条泳道：其中M为markerDL2000，1-5分别为菜豆荚斑驳病毒cDNA的100、10-1、10-2、10-3和10-4稀释度的RPA扩增产物，6为阴性对照。具体实施方式：除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1本实施例提供了一种RPA引物及其应用。RPA引物的筛选方法为：针对菜豆荚斑驳病毒基因组(Genbank登录号M62738.1)的保守序列，设计检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的RPA引物，设计了多条RPA引物后进行了大量的筛选实验，综合其特异性、灵敏度和所使用的各引物与RPA扩增试剂盒的适配性，最终筛选出特异性好、灵敏度高且适用范围广的一对RPA引物。此RPA引物具体序列如下：上游引物：5′-TATTTGTATGCTATGGTGCATGATAGTTCAGTGTC-3′(SEQIDNO：1)；下游引物：5′-TGTTCTCACTGTTGCCATTTGATTCCAAAC-3′(SEQIDNO：2)。上述RPA引物由上海生工生物技术有限公司合成。利用上述RPA引物针对菜豆荚斑驳病毒的基因组进行RPA扩增，得到的RPA扩增产物大小为198bp。上述RPA引物可应用到菜豆荚斑驳病毒的检测或辅助检测上，例如检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒，或检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒；还可以用来制备检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的产品，例如制备检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒的产品，或制备检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒的产品。实施例2本实施例提供了一种试剂盒及其应用，所述试剂盒包括：(1)植物总RNA提取试剂；(2)反转录试剂；(3)上游引物和下游引物(来自实施例1)；(4)含冻干酶粉管；(5)再水化缓冲液；(6)醋酸镁溶液。所述植物总RNA提取试剂为来自天根生物科技有限公司植物总RNA提取试剂盒(货号:DP432)的试剂；所述反转录试剂为来自TaKaRa公司PrimeScriptRT-PCRKit(货号:RR014A)的试剂。上述含冻干酶粉管、再水化缓冲液(RehydrationBuffer)和醋酸镁溶液(280mmol/L)均来源于RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits(TwistDX公司，货号:TABAS03KIT)。实验证明，上述植物总RNA提取试剂、反转录试剂与RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits、上游引物和下游引物的联合使用，效果更加优越，具体表现在特异性强，灵敏度与普通PCR相当，而且不需要昂贵的热循环仪器，恒温反应即可，反应时间仅需40min，结果容易判断。上述试剂盒可应用于检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒上，例如检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒，或检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒；还可以用来制备检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的产品，例如制备检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒的产品，或制备检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒的产品。实施例3本实施例提供了一种检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的方法，例如检测或辅助检测待测植物样品是否感染菜豆荚斑驳病毒，或检测或辅助检测待测病毒是否为或候选为菜豆荚斑驳病毒，该方法使用了实施例1的RPA引物和实施例2的试剂盒。上述方法包括如下步骤：1、RNA的提取及cDNA的合成采用天根生物科技有限公司的货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒，根据其说明书提取待测植物样品或待测病毒的总RNA；并采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCRKit，根据其说明书将前述提取的总RNA作为模板反转录获得cDNA，将获得的cDNA保存于-20℃备用。2、RPA扩增以cDNA为模板，采用实施例1的上游引物和下游引物(序列分别为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2)进行RPA扩增，得到RPA扩增产物，同时设置空白对照(模板为超纯水)。RPA扩增体系(50μL)的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL、去离子水12.5μL、上游和下游引物(实施例1的上游引物和下游引物)各2μL(引物的终浓度均为0.4μmol/L)，模板cDNA50ng，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。3、RPA扩增产物的电泳检测RPA反应结束后，向上述RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并对RPA扩增产物进行测序。所述RPA扩增的结果判断的标准为：若所述RPA扩增得到的产物含有大小为198bp的片段，则所述待测植物样品感染菜豆荚斑驳病毒，或待测病毒为或候选为菜豆荚斑驳病毒；若所述RPA扩增产物不含有大小为198bp的片段，则所述待测植物样品未感染菜豆荚斑驳病毒，或待测病毒不为或候选不为菜豆荚斑驳病毒。实施例4本实施例对实施例3建立的检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的方法进行了有效性验证。步骤一：RNA的提取及cDNA的合成采用天根生物科技有限公司的货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒，根据其说明书提取感染菜豆荚斑驳病毒的大豆叶片(保存于中国检验检疫科学研究院)的RNA；并采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCRKit，根据其说明书将前述提取的RNA作为模板反转录获得cDNA，将获得的cDNA保存于-20℃备用。步骤二：RPA扩增以步骤一获得的cDNA为模板，采用实施例1的上游引物和下游引物进行RPA扩增，同时设置空白对照(模板为超纯水)。RPA扩增体系(50μL)的配制方法如下：向含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp反应管中加入再水化缓冲液(RehydrationBuffer)29.5μL，去离子水12.5μL，上游和下游引物(实施例1的上游引物和下游引物)各2μL(引物的终浓度均为0.4μmol/L)，模板cDNA50ng，最后再加入醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)。RPA扩增反应条件：将上述RPA扩增体系充分混匀，置于37℃的金属浴上反应40min，得到RPA扩增产物。步骤三：RPA扩增产物的电泳检测RPA反应结束后，向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取上清液5μL于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果，并对RPA扩增产物进行测序。结果显示菜豆荚斑驳病毒的RPA扩增产物含有1条大小为198bp的条带，而阴性对照无条带，说明本发明的基于RPA引物及RPA试剂盒建立的检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的方法可以有效检测菜豆荚斑驳病毒。实施例5本实施例对实施例1的RPA引物进行了特异性验证，所用的供试材料如下：菜豆荚斑驳病毒、南方菜豆花叶病毒、大豆花叶病毒、南芥菜花叶病毒和烟草环斑病毒共5种病毒感染的大豆叶片，5种病毒如表1所示，编号依次为1、2、3、4、5。上述供试材料均保存于中国检验检疫科学研究院，并设阴性对照。表1供试病毒序号病毒名称英文名缩写1菜豆荚斑驳病毒BeanpodmottlevirusBPMV2南方菜豆花叶病毒SouthernbeanmosaicvirusSBMV3大豆花叶病毒SoybeanmosaicvirusSMV4南芥菜花叶病毒ArabismosaicvirusArMV5烟草环斑病毒毒TobaccoringspotvirusTRSV采用天根生物科技有限公司的货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒，根据其说明书分别提取上述5种病毒感染的大豆叶片的RNA；并采用TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCRKit，根据其说明书将前述提取的RNA作为模板反转录获得cDNA。以cDNA为模板，进行RPA扩增和RPA扩增产物的电泳检测，RPA扩增和RPA扩增产物的电泳检测的方法同实施例4的步骤二和步骤三。结果分析：结果如图1所示，从图中可以看出：仅有菜豆荚斑驳病毒感染的大豆叶片对应的RPA扩增产物含有1条大小为198bp的目的条带，感染其它4种对照病毒的大豆叶片和阴性对照均无条带，由此证明本发明实施例1的RPA引物具有高特异性；进一步的，本发明基于RPA引物及RPA试剂盒建立的检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的方法能够准确的对菜豆荚斑驳病毒进行检测。实施例6本实施例对实施例1的RPA引物进行了灵敏度的验证，其方法如下：步骤一：cDNA的获取参照实施例5的方法对感染菜豆荚斑驳病毒的大豆叶片(保存于中国检验检疫科学研究院)提取RNA并反转录获取cDNA，并将获取的cDNA进行梯度稀释，分别得到稀释度为100、10-1、10-2、10-3和10-4的菜豆荚斑驳病毒的cDNA。步骤二：RPA扩增分别以上述步骤一得到的稀释度为100、10-1、10-2、10-3和10-4的菜豆荚斑驳病毒的cDNA为模板(模板量均取1μL)进行RPA扩增和RPA扩增产物的电泳检测，并设阴性对照。RPA扩增的方法同实施例4的步骤二。步骤三：电泳检测RPA扩增反应结束后，分别向RPA扩增产物中加入50μL苯酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心2min，取5μL上清液于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。RPA电泳结果如图2所示。从图2可以看出，本发明的RPA方法的灵敏度为10-3稀释度。对比例1实际上，在寻求到本发明的引物对之前，尝试了非常多的引物对组合，在本对比例中只摘取其中之若干进行阐述，其余不予赘述，具体为：利用实施例1的RPA引物对以及用PrimerPremier5.0软件设计并选取其中排分靠前的RPA引物组合1-6，用实施例3建立的检测或辅助检测菜豆荚斑驳病毒的方法对50份大豆样品进行了检测，同时用国家标准《GB/T28063-2011菜豆荚斑驳病毒检疫鉴定方法》中对这50份大豆样品进行了菜豆荚斑驳病毒的检测，灵敏度试验的取样和模板浓度梯度的设置均按照实施例6进行，检测结果如表2所示。表2不同引物对检测样品中菜豆荚斑驳病毒的结果引物对检出率(阳性数/样品数)(重复三次)灵敏度(按实施例6的稀释度计)引物对16/50；7/50；6/5010-2引物对27/50；5/50；6/5010-3引物对36/50；6/50；7/5010-2引物对46/50；6/50；6/5010-3引物对58/50；7/50；8/5010-2引物对65/50；5/50；5/5010-2本发明引物对7/50；7/50；7/5010-3国家标准7/50；7/50；7/5010-3结果显示：本发明引物对的检测结果与国家标准检测方法的检测结果一致，这说明本发明引物组合特异性强、灵敏度高且重复性很好，而采用引物设计软件随机选取的若干种RPA引物对则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高和重复性不好的各种缺陷。对比例2本对比例提供了不同的试剂与本发明的引物对组合在一起检测菜豆荚斑驳病毒时的检测结果对比。各种试剂与本发明的引物对组合:组合1：本发明引物对+某市售植物总RNA提取试剂盒1+某市售反转录试剂盒1+某市售RPA扩增试剂盒1组合2：本发明引物对+某市售植物总RNA提取试剂盒2+某市售反转录试剂盒2+某市售RPA扩增试剂盒2组合3：本发明引物对+某市售植物总RNA提取试剂盒3+某市售反转录试剂盒3+某市售RPA扩增试剂盒3本发明组合：本发明引物对+来自天根生物科技有限公司货号为DP432的植物总RNA提取试剂盒所包含的试剂+来自TaKaRa的货号为RR014A的PrimeScriptRT-PCRKit所包含的试剂+来自TwistDX公司的RPA扩增试剂盒TwistAmpBasickits所包含的试剂。利用上述本发明组合检测菜豆荚斑驳病毒时，其方法采用实施例3中的方法进行。灵敏度实验的取样和模板浓度稀释梯度的设置均按照实施例6进行。利用上述组合1、组合2和组合3检测菜豆荚斑驳病毒时，凡是用到市售试剂盒，均按照其说明书进行操作进行，其余条件均同本发明组合。受检样品同对比例1中的50份大豆样品。检测结果如表3所示。表3不同试剂组合检测样品中菜豆荚斑驳病毒的结果组合检出率(阳性数/样品数)(重复三次)灵敏度(按实施例6的稀释度计)组合18/50；7/50；7/5010-3组合26/50；6/50；6/5010-2组合35/50；6/50；6/5010-3本发明组合7/50；7/50；7/5010-3国家标准7/50；7/50；7/5010-3结果显示：本发明引物对和各特定试剂的组合的检测结果与国家标准检测方法的检测结果一致，这说明本发明引物对和各特定试剂的组合所组成的试剂盒具有特异性强、灵敏度高且重复性好的优势，而采用本发明引物对与其它随机选取的若干试剂的组合则或多或少的存在特异性不强、灵敏度不高和重复性不好的各种缺陷。SEQUENCELISTING<110>中国检验检疫科学研究院<120>基于RPA技术检测菜豆荚斑驳病毒的方法、RPA引物及试剂盒<130>17PA0092CN.B1<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>35<212>DNA<213>Artificial<220><223>SEQIDNO：1<400>1tatttgtatgctatggtgcatgatagttcagtgtc35<210>2<211>30<212>DNA<213>Artificial<220><223>SEQIDNO：2<400>2tgttctcactgttgccatttgattccaaac30当前第1页1 2 3