一种用于猪孤雌激活胚的体外培养液及培养方法与流程

本发明涉及动物胚胎体外培养领域，具体的涉及一种用于猪孤雌激活胚的体外培养液及培养方法。
背景技术：
：动物胚胎的体外培养是胚胎生物技术中的重要环节。在体外培养条件下，早期胚胎往往不能完成从受精卵到囊胚的发育全过程，而停顿在某个特定发育时期，这一现象被称为胚胎体外发育阻断(invitroblockofembryonicdevelopment)，因而严重影响早期胚胎体外发育质量，如猪体外囊胚发育率一般仅为20％左右，内细胞团数量在30个左右，导致后代的出生率下降，极大地阻碍了猪在农业、生物工程和医学中的研究应用。动物胚胎的体外培养与三方面的因素有关，即胚胎种类、培养条件和培养液的成分，其中培养液成分的改进是体外培养技术的基础和关键环节所在，直接影响到体外培养效果和体外生产胚胎的质量。孤雌激活胚胎是将卵母细胞激活后，使其能完成成熟分裂，并由此向有丝分裂过渡，开始新的个体发生。对哺乳动物孤雌激活的研究，将加深对胚胎发生、核移植等许多重大理论问题的认识。孤雌激活的成功，对野生动物保护、转基因动物制作以及生物发育机制的深入研究等也具有重要的理论和现实意义。目前，现有的用于猪孤雌激活胚的体外培养液及培养方法不能保证卵母细胞的激活稳定，不能较好地为细胞代谢提供所需能量，且不足以获得较高的胚胎培养质量和效果。技术实现要素：1.要解决的技术问题本发明要解决的技术问题在于提供一种促进胚胎体外发育的用于猪孤雌激活胚的体外培养液及培养方法。2.技术方案为解决上述问题，本发明采取如下技术方案：一种用于培养猪孤雌激活胚胎的体外培养液，所述体外培养液的原料包括mPZM-3胚胎培养液及五水乳酸钙和丙酮酸钠，且所述体外培养液中五水乳酸钙的浓度为0.606g/L，丙酮酸钠的浓度为0.022g/L；所述体外培养液所用溶剂为富氢水，且其中H2的含量为1.2～1.6ppm。进一步地，所述mPZM-3胚胎培养液的原料包括mPZM-3基础培养液、L-谷氨酰胺、亚牛磺酸、L-半胱氨酸、青霉素、硫酸链霉素以及牛血清白蛋白，且它们的配比为1L：0.146g：0.546g：0.069g：100000IU：70000IU：3g。更进一步地，所述mPZM-3基础培养液包括如下浓度的溶质：氯化钠6.312g/L，碳酸氢钠2.119g/L，氯化钾0.746g/L，磷酸二氢钾0.048g/L，硫酸镁0.048g/L；还包括2％的必需氨基酸和1％的非必需氨基酸。对于猪孤雌激活胚胎，所述体外培养液中富氢水的H2浓度以1.4ppm效果较好。本发明还提供了上述体外培养液用于培养猪孤雌激活胚胎的方法，包括如下步骤：(1)将猪孤雌激活胚胎在含5μmol/L细胞松弛素B的体外培养液中洗三次，移入含5μmol/L细胞松弛素B的体外培养液中培养3～5h；(2)将上述处理后的胚胎用不含细胞松弛素B的培养液洗三次，移入不含细胞松弛素B的体外培养液中，同时覆盖500μL矿物油，培养168h，至所述胚胎发育成囊胚。优选地，上述步骤(1)中所述猪孤雌激活胚胎在含5μmol/L细胞松弛素B的体外培养液中培养处理的时间为4h。具体地，上述步骤(2)中所述猪孤雌激活胚胎的培养密度为每500μL体外培养液培养40～60枚胚胎，培养条件为38.5℃，5％CO2，饱和湿度。3.有益效果(1)丙酮酸是细胞代谢中必须的能量物质，是糖代谢产生的底物，在培养基中起到替代碳源的作用，参与细胞营养代谢。在细胞培养中作用类似的还有葡萄糖、乳酸钠等，但是其作用机理对于不同动物存在差异。尤其是葡萄糖对早期胚胎培养的作用，已证实葡萄糖对小鼠、仓鼠的受精卵有显著的抑制作用，是胚胎克服发育阻断的障碍，猪也有类似的现象。故而本发明采用丙酮酸作为细胞培养的能量物质。(2)钙离子对维持细胞膜的稳定性、通透性以及细胞之间的连接有重要的作用，对桑椹胚的紧缩及囊胚的形成和扩展起至关重要的作用；另外，钙离子浓度的升高是卵母细胞激活的重要诱导信号。而五水乳酸钙具有很高的溶解度，能提供高浓度的钙离子。(3)本发明所用溶剂为富氢水，溶液中的氢可与细胞中的氧自由基直接反应生成无毒无害可被细胞自身利用的水，从而对体外囊胚的氧化损伤具有明显的保护作用。(4)本发明所提供的猪孤雌激活胚胎的培养方法中在体外培养液中加入了细胞松弛素B，细胞松弛素B可抑制细胞内微管和微丝的形成，使得卵母细胞内的细胞骨架松弛，增加了细胞的柔软性，有利于细胞分裂；同时细胞松弛素B破坏了纺锤体的形成，抑制了极体的形成和染色体的排出，保证了染色体倍数，与其它激活剂配合使用可提高孤雌激活的卵母细胞的囊胚发育率，增加了囊胚中的细胞数和降低囊胚细胞中的活性氧水平，从而提高囊胚的数量和质量。本发明所提供的用于培养猪孤雌激活胚胎的体外培养液及其应用方法，能保证卵母细胞的激活稳定，较好地为细胞代谢提供所需能量，且有利于提高胚胎培养质量和效果。附图说明图1为对照组和富氢组的猪孤雌激活胚胎培养至第168h的囊胚细胞核染色结果；图2为对照组和富氢组的猪孤雌激活胚胎培养至第168h的囊胚线粒体膜电位染色结果；图3为对照组和富氢组的猪孤雌激活胚胎培养至第168h的囊胚Pan-caspase原位荧光染色的结果。具体实施方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。本实施例根据本发明公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的常规实验技术；若未特别指明，以下实施例中使用的试剂和材料均可从商业途径获得。实施例一、猪卵母细胞成熟培养液的配制体外成熟培养液由TCM-199加10％(V/V)胎牛血清(Gibco，美国)、10％(V/V)猪卵泡液(实验室自制)、10IU/mL孕马血清促性腺激素(宁波市第三激素制品有限公司，中国)、10IU/mL人绒毛膜促性腺激素(宁波市第三激素制品有限公司，中国)、10IU/mL双抗(Sigma，美国)、0.1mg/mL的L-半胱氨酸(Sigma，美国)、10ng/mL表皮生长因子(Sigma，美国)混合而成。二、猪卵母细胞的获取与体外成熟从屠宰场采集猪卵巢置于37℃生理盐水(含1000IU/mL青霉素和链霉素)中，并在2h内运回实验室。用18号针头注射器抽取卵泡直径在2～8mm的卵丘卵母细胞复合体(COCs)注入15mL离心管中，沉淀30min后弃上清，在显微镜下挑选有3层以上颗粒细胞且胞质均匀的COCs，依次用台氏液和TCM-199(Gibco，美国)分别洗涤三次，放入预温平衡的体外成熟培养液中培养44h。培养条件为38.5℃，5％CO2，饱和湿度。三、孤雌激活液和胚胎培养液的配制孤雌激活液：0.3mol/L甘露醇、0.05mmol/L氯化钙和0.1mmol/L氯化镁。体外培养液：氯化钠6.312g/L、碳酸氢钠2.119g/L、氯化钾0.746g/L、磷酸二氢钾0.048g/L、硫酸镁0.048g/L、五水乳酸钙0.606g/L、丙酮酸钠0.022g/L、L-谷氨酰胺0.146g/L、亚牛磺酸0.546g/L、半胱氨酸0.069g/L、青霉素10000IU/L、链霉素70000IU/L、必需氨基酸(50×)2％、非必需氨基酸(100×)1％、牛血清白蛋白3g/L。实验组所用溶剂为富氢水，其中H2含量1.4ppm(实验组也可称为富氢组)，对照组所用溶剂为蒸馏水。四、猪MII卵母细胞的孤雌激活将培养44h后的COCs移入0.1％的透明质酸酶(Sigma，美国)中用移液枪吹打2min，在显微镜下挑出胞质均匀、形态正常且排出第一极体的卵母细胞，移入TCM-199中洗涤3次，置于37℃恒温台上备用。挑选出的卵母细胞在激活液中平衡5min，移入铺有激活液的0.2mm激活槽中与电极平行排放，进行电激活，激活参数为1.2kV/cm、30μs、一次脉冲。五、猪孤雌激活胚胎的体外培养激活后的卵母细胞在含5μmol/L细胞松弛素B(Sigma，美国)的培养液中洗三次，并在其中培养3～5h，然后用不含细胞松弛素B的培养液洗三次。提前配置好富氢组和对照组的体外培养液，分别装入两个四孔板(NUNC，丹麦)内，每孔装500μL。将激活并洗涤后的卵母细胞分成两份，分别移入准备好的四孔板中，均以500μL矿物油覆盖。培养条件为38.5℃，5％CO2，饱和湿度。六、统计孤雌激活胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数。孤雌激活后的胚胎培养第44h统计卵裂率，第168h统计囊胚率。用5μg/mL的Hoechst33342染色液避光孵育10min，进行细胞核染色，之后用TCM-199洗3遍，放于载玻片上压片，在倒置荧光显微镜(IX71，OLYMPUS，日本)下观察，观察结果如图1所示，囊胚中所有细胞的细胞核经Hoechst33342染色后显示蓝色荧光，进而统计囊胚细胞数。七、检测囊胚中线粒体膜电位(ΔΨm)水平使用含10μg/mLJC-1(5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl–imidacarbocyanineiodide)(碧云天，中国)的PZM-3溶液对上述三组囊胚进行线粒体膜电位检测，染色条件为37℃，避光孵育20min，然后用TCM-199洗涤3次，用激光共聚焦显微镜(TCSSP2，Leica，德国)进行检测。在囊胚细胞最大横截面处，分别观察和记录红色和绿色荧光信号强度。结果如图2，红色(RITC)和绿色(FITC)荧光强度的比值即为ΔΨm。每组实验重复3次，每次约20个囊胚。八、囊胚中Pan-caspase活性检测caspase负责选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。即它们的活性越强，细胞凋亡越快。采用Promega(美国)公司生产的Pan-caspase原位荧光染色试剂盒进行染色。用TCM-199将FITC-VAD-FMK稀释至10μmol/L，囊胚在染色液中37℃避光孵育15min后用TCM-199洗3遍，然后在荧光显微镜下观察拍照。用TCM-199洗3遍，置于荧光显微镜下观察拍照。结果如图3，使用Image-ProPlus6.0软件对荧光照片进行量化并记录荧光强度值，结果用荧光平均相对密度表示。每组实验重复3次，每次约20个囊胚。九、结果1、卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数的统计。对照组和富氢组的卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数计算结果如表1所示。表1、富氢水对猪孤雌激活胚胎体外发育效果的影响注：同列数据肩标不同字母者表示差异显著(P＜0.05)。由表1可知，孤雌激活胚体外发育至第44h,富氢组的卵裂率显著高于对照组。孤雌激活胚体外发育至第168h，富氢组的囊胚率显著高于对照组，并且囊胚中细胞数也显著高于对照组(P＜0.05)。图1中，富氢组囊胚中的细胞数量明显高于对照组。2、囊胚的线粒体膜电位(ΔΨm)水平和Pan-caspase活性检测对照组和富氢组的ΔΨm和Pan-caspase活性统计结果如表2所示。表2、富氢水对猪孤雌激活囊胚线粒体膜电位和Pan-caspase活性的影响组别ΔΨmPan-caspase活性对照组0.91±0.07(58)b10.65±1.26(69)a富氢组1.12±0.12(56)a7.41±2.24(63)b由表2可知，富氢组囊胚的线粒体膜电位(ΔΨm)显著高于对照组。而Pan-caspase活性显著低于对照组(P＜0.05)。图2中，富氢组囊胚的黄色或桔黄色荧光强度要明显高于对照组。图3中，对照组囊胚的荧光强度明显高于富氢组。由图1、图2、图3及上述结果分析可知，富氢水对猪孤雌激活胚胎体外培养的效果具有如下影响：富氢水可提高细胞卵裂率，提高囊胚育成率，并可提升囊胚中细胞的数量；还可增强囊胚中线粒体的膜电位；且囊胚中Pan-caspase活性显著降低，有利于保持细胞的活力。本
技术领域：
中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求范围内。当前第1页1 2 3