一种从胸水中提取cfDNA的方法、试剂盒以及构建的cfDNA文库与流程

技术领域

本发明涉及一种从胸水中提取cfDNA的方法、试剂盒以及构建的cfDNA文库，属于基因检测技术领域。

背景技术：

随着发病率和死亡率的不断增加，癌症已经成为中国人群死亡的首要原因和主要的公共健康问题。根据国家癌症中心统计，2015年中国约有429万例癌症新发病例，281万例癌症患者死亡，肺癌成为最常见的癌症，也是癌症死亡的首要原因。伴随着各种治疗手段的不断兴起，如早期的放疗，近代的化疗到现在的靶向治疗及免疫治疗，癌症的治疗正逐渐向精准化治疗模式发展，特别是靶向治疗和免疫治疗，由此对于特异性靶向人群的筛选显得尤为重要，而作为靶向药物疗法中不可或缺的临床辅助手段，癌症的基因检测直接关系到药物对于患者的治疗效率。

高通量测序技术又称为下一代测序技术，由于其高通量，灵敏度高等特性，在癌症基因检测中得到广泛应用。作为高通量测序最为重要的一环，文库样本的制备显得尤为重要，目前用的比较普遍的检测样本有患者的肿瘤组织样本，穿刺样本等，但是这些无疑都是属于侵入性的。而随着技术的进步，血浆样本也被逐渐应用到高通量测序中，血浆游离DNA（cell free DNA，cf-DNA），是血浆中游离存在的DNA，cfDNA来源于机体细胞损伤，有的来自于正常细胞，有的来自于异常细胞（如肿瘤细胞）。对于健康人，其血液中的cfDNA主要来源是体细胞正常的新陈代谢，因此应该维持在一个较低的水平。然而，当有异常细胞（肿瘤细胞）形成或者有很严重的系统性器官损伤时，大量死亡的细胞（不管是凋亡或是坏死）会产生大量的cfDNA。并且其无创特性受到广泛推崇，高通量测序结合血浆ctDNA液态活检可以实现对肿瘤患者的动态检测。但是血浆样本突变的检出，受多种因素的影响，肿瘤所处的状态如患者目前疾病稳定还是进展会影响肿瘤特有突变的检出，诸如此类癌症分期，癌症转移的部位等都可能影响到血浆中ctDNA的检出，因此迫切的需要一种液态活检样本的补充。

胸水主要在晚期肺癌中最为常见，其它肿瘤如乳腺癌、淋巴瘤等都可能转移到胸腹腔而引起癌性胸水，在肺癌中恶性胸水的发生率高达60%，发病原因主要是胸膜转移结节侵犯和阻塞毛细血管和淋巴管所致。

技术实现要素：

通过大量试验探索，本发明意外地发现了一种能够从胸水中提取得到较高纯度的cfDNA的方法和专用试剂盒，利用该技术可以优化现有技术中从血浆中提取cfDNA检出率不足的问题；并且通过对样本进行处理之后，能够有效地实现DNA文库的构建，这种方法提取得到的cfDNA可以通过高通量测序，能够有效检出患者携带的突变，并且发现采用这种方法得到的cfDNA构建文库测序之后，在一些样本中其突变的检出率要高于血液/血浆样本中的cfDNA，从而更能有效提示患者预后，用药等信息。

本发明的第一个方面：

提供了一种从胸水中提取cfDNA的方法，包括如下步骤：

第1步，对胸水样本进行离心分离；

第2步，在第1步得到的上清中加入Carrier RNA、蛋白酶K、裂解液，进行孵育处理，再加入DNA析出液；

第3步，将第2步得到的样品采用柱吸附的方式对cfDNA进行吸附，再经过解吸之后，获取到cfDNA。

在一个实施例中，所述的裂解液中包含有50～150 mmol Tris-HCl、20～30 mmol EDTA、400～600 mmol NaCl、0.5～1.5% SDS。

在一个实施例中，所述的DNA析出液中包含有0.1～0.2 mol/L NaCl、0.02～0.05 M 磷酸盐溶液。

在一个实施例中，柱吸附中采用的是硅胶膜吸附柱。

在一个实施例中，在进行解吸之前，依次采用盐洗涤溶液和醇洗涤溶液对吸附柱进行冲洗。

所述的盐洗涤溶液中包括有：10～20 mM 三羟甲基氨基甲烷、1～5 M 盐酸胍、10～30 mM EDTA-2Na、0.1～1% HCl。

所述的醇洗涤溶液是由75～80vol.%的乙醇和异丙醇1:1配制。

所述的Carrier RNA的加入量是是每毫升胸水样本中加入5～50μl，蛋白酶K的加入量是每毫升胸水样本中加入50～500μl，裂解液的加入量是每毫升胸水样本中加入0.5～5ml，DNA析出液的加入量是每毫升胸水样本中加入0.5～5ml；盐洗涤溶液的用量是每毫升胸水样本对应30～100μl；醇洗涤溶液的用量是每毫升胸水样本对应150～300μl。

解吸所采用的解吸液是无酶水。

本发明的第二个方面：

提供了一种从胸水中提取cfDNA的试剂盒，包括有：裂解液、DNA析出液、蛋白酶K、Carrier RNA、吸附柱、盐洗涤溶液、醇洗涤溶液、解吸液。

裂解液、DNA析出液、蛋白酶K、Carrier RNA、盐洗涤溶液、醇洗涤溶液的体积比范围是：500～5000：500～5000：50～500：5～50：30～100：150～300。

所述的解吸液是无酶水。

本发明的第三个方面：

提供了由从胸水中提取得到的cfDNA构建得到cfDNA文库。

本发明的第四个方面：

提供了上述cfDNA文库在基因测序中的应用。

在一个实施例中，所述的基因测序是采用NGS（下一代测序）方法。

本发明的第五个方面：

提供了一种cfDNA文库的构建方法，包括如下步骤：

第1步，对提取得到的cfDNA进行大小片段分离；

第2步，对小片断cfDNA依次进行末端修复、3'末端加上碱基A、两端加上接头、纯化，得到cfDNA文库。

在一个实施例中，所述的第1步中的大小片段分离是采用磁珠法分离。

本发明的第六个方面：

本发明还提供一种cfDNA文库构建试剂盒及其在基因测序中的应用，该试剂盒中包含了上述提取cfDNA的试剂盒。

有益效果

本发明首次成功地从胸水中提取到了cfDNA，经验证可作为高通量测序文库构建的样本来源，并且可以成为血浆cfDNA 的一种有效补充；此外，该方法中通过对胸水样本中cfDNA大小片段分离后，使得胸水样本中的cfNDA纯度更高，使其更适合于DNA文库的构建，更利于后期突变的检出，可以解决常规仅通过血浆提取cfDNA建库的样本单一性和检出率问题。

附图说明

图1是胸水上清cfDNA经过大小片段未分离的质控图；

图2是胸水上清cfDNA经过大小片段经过分离后的质控图；

图3是实施例2中经过磁珠分离得到的cfDNA构建文库的质控图；

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本文使用的词语“包括”、“包含”、“具有”或其任何其他变体意欲 涵盖非排它性的包括。例如，包括列出要素的工艺、方法、物品或设 备不必受限于那些要素，而是可以包括其他没有明确列出或属于这种 工艺、方法、物品或设备固有的要素。除非上下文明确规定，否则单数形式“一个/种”和“所述(该)”包括 复数个讨论对象，本发明中所述的百分比在无特别说明的情况下是指质量百分比。

以下实施例中所述的“胸水样本”在无特别说明的情况下，是指初始取得胸水样本，提取过程中用试剂的用量是以初始胸水样本体积为标准稳定。

经过了大量试验摸索，本发明意外地发现了一种从胸水中获得cfDNA的方法，这种方法可以较好地从胸水中获得适合于文库构建的cfDNA，这种提取方法主要是通过离心、蛋白酶K处理、柱吸附的方法获得了胸水中的cfDNA。

1.cfDNA的提取

1.1离心分离：

在离心步骤中，主要目的是使胸水中的细胞、大分子蛋白、血液有形成分等分离，获得上清，本发明发现了上清液中含有cfDNA，这些cfDNA经过提取后适合于文库构建，能够比血液样本获得的cfDNA具有更高的突变检出率。这里的离心步骤，可以于1000～20000 rpm离心5～30 min，上清于4℃保存。

1.2蛋白分解处理：

胸水上清中还需要加入Carrier RNA可帮助核酸去除静电效应，能很好被吸附到纯化柱上，可提高洗脱效率，从而达到尽可能大的回收样本中核酸，接下来需要经过蛋白酶分解处理，采用蛋白酶K对样品孵育处理，蛋白酶K可以分解掉上清中的蛋白质，孵育过程的温度可以控制在45℃水浴10min；处理结束后，样品中需要加入裂解液，这里采用的裂解液的成分可以是包含50～150 mmol Tris-HCl、20～30 mmol EDTA、400～600 mmol NaCl、0.5～1.5% SDS；孵育结束后，还需要再加入DNA析出液以维持样本体系，可以提供一个低盐环境，有利于游离DNA的析出，此外，通过低盐促进残留蛋白质的盐溶，并除去残留蛋白质，减少后续蛋白质的污染，所述的DNA析出液中包含有0.1～0.2 mol/L NaCl、0.02～0.05 M 磷酸盐溶液。

1.3柱吸附：

在得到蛋白酶K处理后的样品后，准备进行柱吸附操作，本发明发现通过这种柱吸附方法相对于其它的方法可以获得较多高质量的cfDNA，这里所采用的吸附柱可以采用硅胶膜柱，吸附过程结束后，采用洗涤液进行冲洗，可以有效地去除掉样品中的杂质并保留较多的cfDNA，在优选实施例中，可以采用两种洗涤缓冲液进行依次冲洗，盐洗涤溶液的组成是：10～20 mM 三羟甲基氨基甲烷、1～5 M 盐酸胍、10～30 mM EDTA-2Na、0.1～1% HCl，醇洗涤溶液的组成是：75～80vol.%的乙醇和异丙醇1:1复配。

在将杂质洗涤之后，使用解吸液对吸附的cfDNA进行洗脱，得到含有cfDNA的洗脱液，这里的洗脱液优选采用无酶水。

2. 文库构建：

获得了cfDNA后，将其构建文库后，可以表现出比血浆样本更高的突变检出率。这里的构建文库的方法，可以包括有对提取得到的cfDNA进行大小片段分离；对小片断cfDNA依次进行末端修复、3'末端加上碱基A、两端加上接头、纯化等步骤。

2.1磁珠分离

其中，对提取得到的cfDNA进行大小片段分离是关键步骤，通过对胸水样本中cfDNA大小片段分离后，使得胸水样本中的cfNDA纯度更高，避免了大片断cfDNA对于通量的占用，使其更适合于DNA文库的构建，更利于后期突变的检出，检出的丰度会更高也更为可信，可以解决常规仅通过血浆提取cfDNA建库的样本单一性和检出率问题。这里的大小片段的分离可以采用磁珠分离的方式，通过对cfDNA吸附，再将大片段洗涤后，将小片段cfDNA从磁珠上洗脱。

2.2末端修复

将cfDNA片段进行末端修复可以利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行，其中，所述Klenow片段具有5’-3’’聚合酶活性和3’-5’聚合酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。由此，能够方便准确地对cfDNA片段进行末端修复。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对经过末端修复的cfDNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。

利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cfDNA 5'突出粘末端补平以及3'突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20摄氏度，30分钟。

表1

2.3cfDNA样本3'末端加上碱基A

在经过末端修复的cfDNA片段的3’末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A的cfDNA片段。根据本发明的一个实施例，可以利用Klenow(3’-5’exo-)，即具有3’-5’外切酶活性的Klenow，在经过末端修复的cfDNA片段的3’末端添加碱基A。由此，能够方便准确地将碱基A添加到经过末端修复的cfDNA片段的3’末端。根据本发明的实施例，还可以进一步包括对具有粘性末端A的DNA片段进行纯化的步骤，由此能够方便地进行后续处理。

反应在PCR扩增仪中进行，37℃，30分钟。

表2

cDNA/DNA过柱纯化，商业化公司纯化试剂盒。

2.4cfDNA两端加上接头

表3

2.5扩增DNA模板

在本发明的一个实施例中， cfDNA片段扩增使得核酸的量能满足芯片/探针杂交捕获的需求。

聚合酶链反应（PCR），在PCR扩增仪中进行。

表4

PCR条件：置于PCR扩增仪中，98℃预变性30秒，98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环4－6次。最后在72℃延伸5分钟。

上述方法得到的cfDNA文库可以应用于非治疗与诊断目的的基因测序中，特别是适用于NGS方法测序。上述的cfDNA提取试剂盒可以应用在文库构建试剂盒中，也同样适用于基因测序中。

实施例1 胸水样本中cfDNA的获得

1 胸水样本上清和沉淀的分离

取新鲜采集的胸水样本，1800rpm离心10 min，将胸水上清吸附至新的离心管中，弃去胸水沉淀，将胸水上清样本保存至4℃（-80℃）冰箱。

2 胸水上清中cfDNA的柱吸附分离

2.1 取样：取出4℃（-80℃）保存的胸水上清样本，再经过4℃ 16000rpm 10 min处理；

2.2 配置预混液：准备裂解液Buffer ACL Mix（QIAGEN），吸取2倍胸水总体积的Buffer ACL Mix，颠倒混匀；

2.3 加蛋白酶K：每毫升胸水样本中加入20μl Carrier RNA，再加入200μl蛋白酶K，充分消化；

2.4 加入ACL：按每毫升胸水样本中加入2 ml裂解液Buffer ACL Mix（QIAGEN），45℃水浴10min，孵育结束，常温冷却；

2.5 加入ACB：按每毫升胸水样本中加入2ml DNA析出液Buffer ACB（QIAGEN），颠倒混匀；

2.6 准备抽抽机：取下鲁尔塞，插上QIAamp Vac，插上连接子，装上柱子，保持盖子封闭状态；

2.7 过柱：将50ml混合液转移至样本管中，打开真空泵，匀速通过硅胶膜吸附柱 （QIAGEN）；

2.8 洗脱：向吸附柱加入300μl 盐洗涤溶液Buffer ACW1（QIAGEN），打开真空泵，缓慢匀速地通过吸附柱，继续加入1000μl醇洗涤溶液Buffer ACW2（QIAGEN）；继续向吸附柱加入450μl无水乙醇至洗脱结束，关闭真空泵；

2.9 样本离心： 盖上吸附柱盖子，置于离心管中，3000rpm离心3min； 2.10 回收QIAamp vac，插上鲁尔塞；

2.11 洗脱DNA：向吸附柱加入5-10μl无酶水， 1800rpm离心30s，将洗脱后的DNA转移到新的1.5ml吸附管中，加入30μL无酶水，静置3min，2500rpm离心5min 2.12 DNA混匀：用vortex涡旋混匀。

3 cfDNA样本定量

将混匀后的DNA样本，取1μL进行Qubit定量。

对照例1 酚-氯仿-异戊醇抽提法提取cfDNA

1.取胸水4ml，2000rpm室温离心10 min，将上清移至新的离心管中，再经12000rpm室温离心5min后，将上清移至新的离心管中。

2.将上清中加入1%SDS溶液350ml、20mg/ml蛋白酶K溶液20μl，漩涡震荡混匀，58℃水浴75 min，加入酚-氯仿-异戊醇混合液700μl，漩涡震荡混匀，4℃下12000rpm离心10min，将上清移至新的离心管中，加入异丙醇800μl，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心10min，倾弃上清，加入75%乙醇1ml，颠倒混匀，4℃下12000rpm离心10min，倾弃上清，65℃金属浴直至残余液体完全干燥，加入去离子水10μl，65℃溶解10min，-20℃保存。

对照例2 酚-氯仿-异戊醇抽提配合微量DNA助沉剂法提取cfDNA

与对照例1的区别是：在加入异丙醇800μl的同时加入微量DNA助沉剂5μl。

对照例3

与实施例1的区别是：第一缓冲液的加入体积与胸水上清样本等量加入。

对照例4

与实施例1的区别是：未加入DNA析出液。

采用上述实施例1和对照例1～4中得到的DNA样本，取1μl进行Qubit定量。

表5 DNA样本定量结果

从上表中可以看出，采用本发明的方法可以从胸水中获得高含量的cfDNA样本，优于常规方法和对照例方法，其中对照例4中的未加入DNA析出液处理，不仅可以提高了DNA含量也使DNA质量得到了提高，推测其作用包括1、析出蛋白质；2、去除残余的蛋白质，使吸光率比值A260/A280在1.8到2之间，符合要求。

实施例2 DNA文库的构建

3.1 cfDNA大小片段的分离

a) 将实施例1提取到cfDNA样本加无酶水补齐至50μl，加入35μl磁珠Axygen beads，用移液枪混匀；

b) 样本置于磁力分离架上直至上清澄清，吸取上清至另一1.5ml低吸附管中；

c) 加入65μl 磁珠Axygen beads重悬移液枪混匀后置于磁力分离架上至上清澄清，遗弃上清，加入50μl 75%乙醇清洗，移液枪移去残液，晾干；

d) 加56 μL无酶水，混匀，移取51 μl澄清液至新的1.5ml离心管中；

e）取1μl用Qubit测量DNA浓度。所得50 μl ctDNA小片段直接用于cfDNA KAPA建库流程。

磁珠大小片段分离前后的cfDNA质控图如图1和图2所示，从图中可以看出，经过磁珠分离后，大小片段得到了较好的分离，小分子量的cfDNA含量明显提高。

3.2 cfDNA双链末端修复

将定容后的50μL cfDNA全部加入表6的反应体系，混匀之后放置在PCR仪上20℃反应30min,65℃反应30min。

表6cfDNA双链末端修复反应体系

3.3 Adaptor链接

a) 配置接头连接反应

表7 接头连接反应反应体系

b） 简短离心并用p200充分混匀。在PCR仪上20℃，60min。

3.4 产物纯化

a) 加入50 μL重悬Axygen beads，移液枪混匀，磁力分离架上5min直至上清澄清，遗弃上清，加50μL 75%乙醇洗2遍，去除残液；

e) 加30 μL无酶水，移液枪混匀，磁力架上5min；

g）取1μL进行Qubit定量，其余连同beads进入下面的PCR

3.5 PCR扩增富集产物

将上述步骤获得的上清液加入扩增体系，具体配方见表8，混匀之后，将反应体系放置在PCR仪上，具体反应程序见表9。

表8 扩增富集反应体系

表9PCR扩增富集反应条件

3.6 产物纯化

a) 在上述产物中加入25μL 磁珠Axygen beads重悬，移液枪混匀，磁力架上至上清澄清，遗弃上清，加入50μL 75%的乙醇清洗2遍，室温晾干5min；

b） 加31 μL 无酶水，移液枪混匀，室温孵育20min，将澄清液移至新的1.5ml低吸附EP管中。

c） 取1μL进行测Qubit定量，剩下的样本作为测序文库进入后续流程。

得到的文库的质控图如图3所示。可以看出，采用本发明提取方法得到的cfDNA构建文库具有更好的碱基质量。

突变检出率试验

为了探究胸水样本是否可以作为血浆样本的补充，随机选取了34例肺癌患者，同时检测其组织样本、血浆样本和胸水样本。

胸水样本采用实施例1和实施例2中的提取和文库构建方法；组织样本和胸水沉淀样中的DNA样本的提取采用的是常规抽提法，血浆样本中cfDNA的提取采用DNA提取试剂盒Qiaamp Circulating Nucleic Acid Kit（QIAGEN）。

检测结果如下表6所示，其中胸水上清样本特有突变检出率与组织样本类似，优于血浆样本和胸水沉淀样本；胸水上清样本与血浆样本/胸水沉淀样本的突变检出率相比均达到显著水平（血浆vs胸水上清，p=0.02；胸水上清vs胸水沉淀，p=0.02）。

表10肿瘤特有突变检出率比较

其次，将其中24位已通过传统方法检测的患者与NGS检测进行对比，比较重要驱动基因的检出情况，对于EGFR、ALK基因存在突变的检测结果如下。在敏感性方面，基于NGS方法，胸水上清的敏感性高于胸水沉淀样本和血浆样本。

表11胸水样本和血浆样本检出EGFR 19外显子缺失敏感性和特异性对比

表12胸水样本和血浆样本检出EGFR L858R敏感性和特异性对比

表13胸水样本和血浆样本检出ALK融合敏感性和特异性对比

综上可以看出，胸水上清提取cfDNA特有突变检出率与组织样本近似，敏感性优于血浆样本和胸水沉淀样本，且重要驱动基因的检测胸水上清样本同样显示出巨大的优势，因此胸水上清样本可以作为血浆样本的有效补充，在无创检测层面可能应用广泛。