cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法与流程

本发明属于分子基因学领域，具体涉及一种cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法。

背景技术：

cfDNA，即循环肿瘤DNA，是体内循环肿瘤细胞(CTC)和死亡的肿瘤细胞在细胞代谢时留在血浆中的残留物。cfDNA高通量测序技术是液态活检的一种，它只需像化验肝肾功能那样采集静脉血，即可对全身的肿瘤基因信息进行精确测定，基于肿瘤基因信息，就可以指导抗肿瘤药物选用、疗效评估、预后判断，甚至早期发现和早期诊断。然而，精确测序cfDNA存在两个巨大技术障碍：首先是血浆中的cfDNA含量极低，且多为小片段分子特点，导致提取较为困难，丢失量大，检测灵敏度较低，因此限制了其在临床上的应用。其次是由于cfDNA为高度片段化，目前市场上cfDNA建库的方法，如在双链DNA末端补平加A后再加接头进行扩增，会导致一些cfDNA无法补平加接头，造成了cfDNA的损耗，使一些基因突变位点无法被检测到，进一步限制了检测灵敏度。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高灵敏性、低成本的cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于cfDNA建库的接头，所述接头包括单链接头A和双链接头B；

所述单链接头A的序列为SEQ ID NO.1，且3′端用生物素修饰，用于连接和标识变性后的单链cfDNA；

所述双链接头B包括接头B1和接头B2，所述接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，用于连接双链cfDNA。

一种用于cfDNA建库的引物组，所述引物组包括SEQ ID NO.4-6所示的序列，所述序列为SEQ ID NO.4的引物用于单链cfDNA的单向扩增；所述序列为SEQ ID NO.5-6的引物用于扩增文库分子以进行文库检测。

一种cfDNA建库试剂盒，所述试剂盒包括所述的接头和引物组。

一种cfDNA建库的方法，包括如下步骤：

(1)对cfDNA进行去磷酸化与变性，得单链cfDNA；

(2)连接单链cfDNA与3′端被修饰的单链接头A，得3′端被修饰的单链连接产物；

(3)单向扩增第一次连接产物，得双链cfDNA；

(4)连接双链cfDNA与双链接头B，得双链连接产物；

(5)除去双链连接产物中3′端被修饰的一条链；

(6)文库质检。

上述技术方案产生的有益效果在于：

本发明首先将得到的ctDNA变性使其由双链变成单链，然后通过单链连接酶连接接头，使得几乎所有的ctDNA都能被捕获，避免了ctDNA的损耗，从而提高了检测灵敏度。本发明提供的建库方法操作简单，测序结果稳定，测序成本低。

附图说明

图1是本发明的建库方法示意图；

图2-3是本发明的测序结果图。

具体实施方式

为进一步说明本发明公开的技术方案，以下通过2个实施例来说明：

实施例1：

本发明提供了一种cfDNA建库试剂盒产品，在试剂盒中包括有：

用于连接和标识变性后的单链cfDNA的单链接头A，所述单链接头A的3′端用生物素修饰；

用于连接单链cfDNA和单链接头A的单链连接酶和用于单链连接酶的缓冲液；

用于连接双链cfDNA的双链接头B，所述双链接头B包括接头B1和接头B2；

用于连接双链cfDNA的双链接头B的T4DNA连接酶和用于T4DNA连接酶的缓冲液；

用于单向扩增单链cfDNA的引物CL9和用于扩增文库分子以进行文库检测的引物IS7和IS8：

其中，所述双连接头B由如下方法制得：

对如下体系进行PCR，95℃反应10S，然后以0.1℃/s降温到14℃，得到双链接头B。反应体系如下：

所述试剂盒还包括如下试剂：

缓冲A液(50ml):

缓冲B液(50ml):

严谨性洗脱缓冲液(50ml):

49.5ml 灭菌蒸馏水

250ul 20％(wt/vol)SDS

250ul 20×SSC buffer；

终止液(100ul):

98ul 0.5M EDTA(PH8.0)

2ul Tween20；

TE缓冲液(50ml):

49.4ml 灭菌蒸馏水

500ul 1M Tris-Hcl(PH8.0)

100ul 0.5M EDTA(PH8.0)；

TET缓冲液(50ml):

在使用中为了更加进一步增加试剂盒的便易性，在试剂盒中还可以添加如下成分：10×buffer，Fast AP，PEG-4000，Isothermal amplification buffer(10×)，dNTP mix(25mM each)，Buffer Tango(10×)，dNTP(25Mm each)，Tween 20(1％)，Library，Mix。

实施例2：

一种cfDNA建库的方法，包括如下步骤：

(1)对cfDNA进行去磷酸化与变性，得单链cfDNA；

(a1)：根据QIAGEN公司提供的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)试剂盒的使用说明书，使用该试剂盒对血浆中游离的cfDNA进行提取；

(b1)：向PCR管中加入如下成分：

使用PCR仪，先37℃反应10min，然后95℃反应2min；

取出PCR管，迅速将其放入到冰水混合物中，冰浴至少1min，取出后离心，室温保存。

(2)连接单链cfDNA与3′端被修饰的单链接头A，得3′端被修饰的单链连接产物

(a2)：向PCR管中加入如下成分：

使用PCR仪，60℃反应1h，加入2μl终止液，终止反应；

取出PCR管，震荡离心，-20℃保存。

(b2)：另取一1.5ml离心管，在涡流保持磁珠悬浮的条件下，向其中转移12μl磁珠，用磁力架固定磁珠，移去上清液，用500μl的磁珠缓冲液分两次冲洗磁珠；

(c2)：取出步骤(a2)中的PCR管，使用PCR仪，95℃反应1min，之后取出，冰浴至少1min，取出离心；将PCR管中的连接产物转移至上述离心管中，室温旋转20min，离心；用磁力架固定磁珠，移去上清液，磁珠依次用200μl的缓冲A液和缓冲B液冲洗。

(3)单向扩增第一次连接产物，得双链cfDNA

(a3)：用磁力架固定磁珠，移去上清液，向离心管中加入如下成分(此过程通过涡流保持磁珠悬浮)：

将上述体系置于65℃的恒温金属浴中热处理2min；再取出冰浴1min；然后加入1μl Bst 2.0 polymerase，混匀；放入37℃的恒温金属浴中热处理27min；取出离心；

(b3)：用磁力架固定磁珠，移去上清液；先用200μl的缓冲A液冲洗磁珠，然后将磁珠重悬在100μl的严谨性洗脱缓冲液中，再将该体系在恒温金属浴上45℃热处理3min；用磁力架固定磁珠，移去上清液，最后再用200μl的缓冲B液冲洗磁珠。

(4)连接双链cfDNA与双链接头B，得双链连接产物

(a4)：用磁力架固定磁珠，移去上清液，向离心管中加入如下成分：

震荡混匀；然后加入1μl T4 DNA polymerase，混匀，将上述体系置于25℃的恒温金属浴中热处理15min；再加入0.5M EDTA 10μl，混匀；

(b4)：同步骤(b3)；

(c4)：用磁力架固定磁珠，移去上清液，向离心管中加入如下成分：

震荡混匀；然后加入2μl T4 DNA ligase，混匀，室温反应1h；

(d4)：同步骤(b3)。

(5)除去双链连接产物中3′端被修饰的一条链；

(a5)：用磁力架固定磁珠，移去上清液，在涡流保持磁珠悬浮的条件下，向离心管中加入25μl TET buffer，然后将该体系转移到0.2ml的PCR管中，离心；使用PCR仪，95℃反应1min，之后取出，迅速将其放到一个96孔的磁力架上；

(b5)将上清液转移至新的0.2ml的PCR管中，得文库分子；

(6)文库质检：

(a6)以文库分子为模板，进行PCR扩增：

扩增体系，具体如下：

合计25μl；

PCR反应程序：

(b6)通过illumina测序仪对PCR产物进行测序，结果如图2-3所示。由图2-3可看出，能从中找到单链接头A和双连接头B2，证明了本发明的可行性。

序列表

<110>安徽安科生物工程(集团)股份有限公司

<120>cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

AGATCGGAAG 10

<210> 2

<211> 11

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

CGACGCTCTTC 11

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

GGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG*T*G*T*A 29

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT 34

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

ACACTCTTTCCCTACACGAC 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

GTGACTGGAGTTCAGACGTGT 21