鉴定不同产地道地药材锁阳的方法及其试剂盒与流程

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及用特异性的SNP标记对不同产地的道地药材锁阳的鉴定方法。

背景技术：

锁阳为锁阳科植物锁阳(Cynomorium songaricum Rupr.)的干燥肉质茎，又名不老药，乌兰高腰，地毛球，羊锁不拉等。除去花序的肉质茎供药用。肉质茎富含鞣质，可提炼栲胶，并含淀粉，可酿酒，饲料及代食品。具有补肾、益精、润燥等功效，主治阳痿遗精、腰膝酸软、肠燥便秘、月经不调、不孕不育以及气弱阴虚等。我国锁阳主产于新疆、青海、甘肃、宁夏、内蒙古等省区。由于长期的生长环境及栽培方式的不同，锁阳形成了一定的种内变异，从而表现出品质上的差异。新疆塔城地区气候温和，雨量充沛，所产锁阳品质较好。不同产地的锁阳外观性状相似，传统的形态学鉴定很难将其区分开来，尤其对于药材粉末、饮片、中成药等鉴定有很大困难。利用SNP标记的鉴定方法能够解决道地锁阳的鉴别困难问题，这种基于DNA序列的鉴定方法具有准确、高效、重复性好等优点。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种能够准确、快速鉴定不同产地锁阳的SNP标记及其引物对、试剂盒和检测方法，包括SNP检测法关键试剂、引物对、模板和检测步骤。

本发明提供的不同产地锁阳鉴定用SNP标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其中，SEQ ID No.1所示序列中只存在三个SNP：SEQ ID NO.1序列5’端起第188位塔城锁阳为T，其他产地锁阳(本文中指非塔城产地的锁阳，下同)为C；第304位塔城锁阳为A，其他产地锁阳为T；第305位塔城锁阳为C，其他产地锁阳为T。

本发明提供的SNP标记可用于鉴定不同产地锁阳。

如果SEQ ID NO.1序列5’端起第188位为T或第304位为A或第305位为C，则鉴定为塔城锁阳；

如果SEQ ID NO.1序列5’端起第188位为C或第304位为T或第305位为T，则鉴定为其他产地锁阳；

如果SEQ ID NO.1序列5’端起第188位不为T也不为C，且第304位为不为A也不为T，且第305位不为C也不为T，则鉴定样品不是锁阳。

本发明还提供一种不同产地锁阳鉴定方法，其包括如下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，扩增含有SEQ ID NO.1所示序列的片段；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得完整ITS片段，通过分析SEQ ID NO.1所示序列，确定SEQ ID NO.1序列中的5’端起第188位、第304或305位的碱基。

如果SEQ ID NO.1序列5’端起第188位为T，或第304位为A，或第305位为C，则鉴定为塔城锁阳；

如果SEQ ID NO.1序列5’端起第188位为C或第304位为T或第305位为T，则鉴定为其他产地锁阳；

如果SEQ ID NO.1序列5’端起第188位不为T也不为C，且第304位为不为A也不为T，且第305位不为C也不为T，则鉴定样品不是锁阳。

本发明用于扩增SEQ ID NO.1所示序列片段的引物为：

SY1F 5’-AAGGAAGCAGCAGCACATTGAGT-3’

SY1R 5’-AACCTGCGGAAGGATCATTGTTG-3’

上述引物也可用于不同产地锁阳鉴定。

本发明还提供含有上述引物的试剂盒。

本发明提供了上述引物或试剂盒在锁阳鉴定中的应用。

本发明所提供的SNP可以准确的将塔城锁阳与其他产地锁阳区分开，本发明所提供的方法适应性更广，所述引物特异性高，扩增效率高，能检测所有能提取出DNA的锁阳任何样品。能够实现塔城锁阳原植物、药材、种子、粉末、饮片、中成药的快速鉴定。

附图说明

图1为不同产地锁阳的种间变异图。

图2为引物SY1F-SY1R扩增胶图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1不同产地锁阳原料的鉴定方法

1)从不同产地收集不同产地锁阳样品46份(见表1)，分别取25mg药材在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。

表1不同产地锁阳样品

2)PCR扩增

引物序列为SY1F 5’-AAGGAAGCAGCAGCACATTGAGT-3’，

SY1R 5’-AACCTGCGGAAGGATCATTGTTG-3’，

由上海美吉生物医药科技有限公司(北京)合成。

PCR扩增程序为：

上述PCR反应体系为：

PCR Buffer(10×)2.5u L，Mg²⁺2u L(25mmol/L),dNTPs混合物2u L(2.5mmol/L),引物各1u L(2.5umol/L),模板DNA 2u L(约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25u L,进行PCR扩增。

3)琼脂糖凝胶电泳

分别取3u L的PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后在凝胶成像仪上检测结果(见图2，图中编号1-10依次为TC1,TC2,HT1,HT2,AL1,AL2,ZY1,ZY2,GR1,GR2)。

4)测序

PCR产物直接送到上海美吉生物医药科技有限公司(北京)测序。测序引物同PCR引物。为确保序列可靠性，进行正方双向测序。

5)序列拼接

本实施例应用软件CodonCode Aligner 3.7.1(CodonCode Co.,Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行序列质量评估及预处理，即去掉测序结果两端地址两部分，并对剩余部分进行质量评估。以20bp的窗口分别从序列5’端向3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。由3‘端重复此操作。剪切后的正向和反向序列应大于100bp，正反向序列低质量碱基数小于1％，剪切后的序列小于原始序列长度50％，平均Q值大于等于30。对正反测序结果进行拼接，使正反向序列有大于50％重叠区。

6)序列比对

用MEGA5软件对测序并拼接后的各个样品进行比对，共获得3个SNP位点，所有的塔城锁阳SEQ ID NO.1序列5’端起第188位塔城锁阳为T，其他产地锁阳为C；第304位塔城锁阳为A，其他产地锁阳为T；第305位塔城锁阳为C，其他产地锁阳为T，测序结果见图1。

实施例2锁阳饮片的鉴定方法

基本同实施例1，所不同的是以不同产地锁阳饮片为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性的检测到到上述的3个SNP位点，所有的塔城锁阳SEQ ID NO.1序列5’端起第188位塔城锁阳为T，其他产地锁阳为C；第304位塔城锁阳为A，其他产地锁阳为T；第305位塔城锁阳为C，其他产地锁阳为T。测序结果与图1相同。

实施例3锁阳粉末的鉴定

基本同实施例1，所不同的是以不同产地锁阳粉末为样品，提取DNA，进行鉴定，结果也能特异性的检测到到上述的3个SNP位点，所有的塔城锁阳SEQ ID NO.1序列5’端起第188位塔城锁阳为T，其他产地锁阳为C；第304位塔城锁阳为A，其他产地锁阳为A；第305位塔城锁阳为C，其他产地锁阳为T。测序结果与图1相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国医学科学院药用植物研究所

<120> 鉴定不同产地道地药材锁阳的方法及其试剂盒

<130> KHP171110599.4

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 410

<212> DNA

<213> 锁阳

<400> 1

gacactcagg cagatgtgcc ctcgacctac aggccttggg cgcaacttgc gttcaaatac 60

tcgatggttc acgggattct gcaattcaca ccaagtatcg catttcgcta cgttcttcat 120

cgatgcaaga gccaagatat ccgttgtcga gagtccttga gattccaaat cgcatcacgc 180

gtgcaactgt ttcgtggcgc acgcgcgagc cacttctagt atgccttgac gctgttcgcg 240

ccggaatttg ttacacgccc aagagaacac acgcatgtct cgaaagtttt agaagcgaga 300

cacacttgga gcttcttcgg cgaaagggca agagtgaggc ccaacaggtt gcccacatct 360

caccccgctt aacgctacag gttaccccag ttgcactgct atgcaagttt 410

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaggaagcag cagcacattg agt 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacctgcgga aggatcattg ttg 23