一种低成本的AML1‑ETO融合基因快速检测探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种低成本的AML1-ETO融合基因快速检测探针及其制备方法和应用。

背景技术：

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一种常见的造血系统的恶性肿瘤，目前在我国恶性肿瘤的总体死亡率中，急性髓系白血病位居前列。AML中最常见的染色体易位为t(8；21)(q22；q22)，在所有AML中t(8；21)易位的发生率可达10-15％，在FAB M2型AML中其发生率可达40％～50％，在M2b型AML发生率可高达80％，少见于M0、Ml和M4型白血病中。t(8；21)易位涉及急性粒细胞白血病基因(AML1基因，也称为RUNX1基因)和ETO基因(也称为RUNX1T1基因)，并形成AML1/ET0融合基因。在临床上，AML1/ET0融合对急性白血病的预后、化疗及病人的生存时间等判断提供依据。目前最常见的检测方法是核型分析，但由于白血病细胞特性的影响，染色体分裂相少且难以得到长度适中的染色体中期分裂相，使得难以判断是否存在断裂易位。这种情况下，FISH检测具有敏感，特异，高效和重复性好的特点。因此，FISH可用于急性髓系白血病t(8；21)(q22；q22)(AML1/ETO)诊断。

荧光原位杂交是一种在20世纪80年代放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子遗传技术，以荧光素标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。目前FISH常用的检测探针主要是通过对特定人类基因组BAC克隆进行缺口平移法或随机引物法标记，再经COT-1DNA封闭后用于原位杂交实验，但此方法包含大量的重复序列即使经过COT-1DNA封闭但杂交结果仍具有较高的背景，并且此种方法标记的探针通常需要12-16h(过夜)来完成杂交实验，费时费力，并且此种方法需要大量(通常是探针浓度的50～100倍)昂贵的COT-1DNA来进行重复序列封阻，这大大的增加了探针的制备成本。此外近年来一种不含重复序列的快速荧光原位杂交探针的制备方法也被建立起来(1h完成杂交实验)，但此种方法需要设计大量引物或者构建大量载体来实现探针的制备，并且探针的制备过程仍采用缺口平移或随机引物等传统方法，导致批次间的不稳定；此外此种制备方法仍然需要依赖于人类基因组序列或者BAC克隆序列，原料来源具有一定局限性，并且整个制备过程繁琐，制备成本和不可控因素大大增加。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种低成本的AML1-ETO融合基因快速检测探针及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种低成本的AML1-ETO融合基因快速检测探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)从UCSC Genome Browser下载AML1和ETO基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中AML1探针覆盖区域为：chr21:34787801-35049334，ETO探针覆盖区域为：chr8:91954967-92103365；

(2)将步骤(1)获得的AML1基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的AML1探针序列；

(3)将步骤(1)获得的ETO基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的ETO探针序列；

(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的AML1探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到AML1探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签系列的ETO探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到ETO探针库；

(5)分别合成5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物和5’端带有橘红色荧光基团的M13通用引物，使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对AML1探针库进行扩增标记反应，使用5’端带有橘红的荧光基团的M13通用引物对ETO探针库进行扩增标记反应；

(6)步骤(5)所得AML1探针库的扩增标记产物经纯化、稀释后得到荧光标记的AML1探针库，步骤(5)所得ETO探针库的扩增标记产物经纯化、稀释后得到荧光标记的ETO探针库，所述荧光标记的AML1探针库和荧光标记的ETO探针库构成了AML1-ETO融合基因快速检测探针。

上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp。

上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述标签序列的碱基序列如下所示：

5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG(M13上游序列)

3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG(M13下游序列)。

上述方案中，步骤(5)中所述通用引物序列为：

M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT；

M13-R CAGGAAACAGCTATGACC。

上述方案中，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：

上述方案中，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行35个循环；72℃10min。

包含上述制备方法制备所得AML1-ETO融合基因快速检测探针的试剂盒。

上述试剂盒在制备检测AML1/ETO融合基因试产品中的应用，具体的应用方式包括如下步骤：

(1)样本处理：将外周血细胞滴片样本放入盛有2×SSC的容器中，微波炉高火加热处理3min直至液体沸腾，然后再中低火继续加热处理10min，处理完成后立即将玻片置于-20℃预冷的梯度酒精中脱水晾干，备用；

(2)AML1-ETO融合基因快速检测探针杂交混合物的制备：将荧光标记的AML1探针库、荧光标记的ETO探针库和杂交缓冲液按照1:1:9的体积比混合；

(3)探针样本共変性：每例样本使用10μL步骤(2)混合所得AML1-ETO融合基因快速检测探针杂交混合物，使用22×22mm盖玻片盖片，使用橡皮胶封片，封片后将玻片置于杂交仪中90℃变性1min，37℃杂交15～30min；

(4)杂交后洗涤：待杂交完成后揭去盖玻片，将玻片置于60℃预热的洗液中洗涤去除未结合探针；

(5)复染及镜检：将晾干的玻片滴加10μL抗淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察杂交结果。

上述方案中，步骤(2)中所述杂交缓冲液的组分为：10wt％去离子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1μg/mLRNaseA、0.6M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液。

上述方案中，步骤(3)中所述洗液含0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween-20。

本发明的有益效果如下：

(1)相比于传统的BAC克隆FISH，本发明所述制备方法完全不依赖BAC克隆，且不含有重复序列，不需要昂贵的COT-1DNA进行封闭，大大降低了杂交背景和制备成本。

(2)相比于近年来建立的不含重复序列的快速荧光原位杂交探针的制备方法，本发明所述制备方法中，探针的筛选主要依赖程序完成，并且使用的是更为稳定的PCR法扩增和标记探针，探针标记率更高更均一，仅在探针5’端进行荧光标记所以不影响探针的杂交配对反应；此外本发明不采用容易受环境或操作手法影响的缺口平移反应和随机引物反应来标记探针，所标记的探针长短一致，增加了批次间的稳定性；

(3)与现有技术相比，本发明通过优化探针设计配合特定的杂交缓冲液以及独特的检测方法，本发明可在15-30min内完成杂交实验，这比现有技术中最快需要1h来完成杂交实验所耗费的时间相比，降低了50％以上。

(4)本发明所述的探针具有极高的信噪比，并且具有很高的特异性和样本检出率。

附图说明

图1为探针制备示意图。

图2为探针与靶基因结合示意图。

图3为chunks.pl程序使用代码图。

图4为去除重复序列后AML1基因部分探针序列图。

图5为本发明AML1/ETO探针的检测结果图。

图6为本发明AML1/ETO探针与雅培探针不同杂交时间结果对比图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1 AML1-ETO融合基因快速检测探针的制备

本实施例所述AML1-ETO融合基因快速检测探针的制备过程示意图如图1所示，具体包括如下步骤：

(1)从UCSC Genome Browser下载AML1和ETO基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中AML1探针覆盖区域为：chr21:34787801-35049334，ETO探针覆盖区域为：chr8:91954967-92103365；所获取的序列保存为fasta格式，基因组中重复序列区域替换为N；

(2)将步骤(1)获得的AML1基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代码图见图3)分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp；然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到带有标签的一系列AML1探针序列(图4所示为AML1基因探针池，由于序列过多不一一展示)；标签序列的碱基序列如下：5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG(M13上游序列)，3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG(M13下游序列)；

(3)将步骤(1)获得的ETO基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl(chunks.pl程序使用代码图见图3)分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp；然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到带有标签的一系列ETO探针序列；标签序列的碱基序列同步骤(2)；

(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的AML1探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到AML1探针库，所述AML1探针库包含1253条带有标签序列的AML1探针；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签序列的ETO探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到ETO探针库，所述ETO探针库包含1741条带有标签序列的ETO探针；

(5)分别合成5’端带有绿色荧光基团和橘红色荧光基团的M13通用引物，通用引物序列为：M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT，M13-R CAGGAAACAGCTATGACC；使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对AML1探针库进行扩增标记反应；使用5’端带有橘红的荧光基团的M13通用引物对ETO探针库进行扩增标记反应；所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：

所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行35个循环；72℃10min；

(6)使用乙醇醋酸钠法分别对步骤(5)所得AML1探针库的扩增标记产物和ETO探针库的扩增标记产物进行纯化，纯化后再经稀释得到：浓度为20ng/μL的荧光标记的AML1探针库和浓度为20ng/μL的荧光标记的ETO探针库。

实施例2 AML1-ETO融合基因快速检测探针的检测方法

本实施例所述AML1-ETO融合基因快速检测探针在用于检测AML1/ETO融合基因的试剂盒中的应用，具体包括如下步骤：

(1)样本处理：将外周血细胞滴片样本放入盛有2×SSC的容器中，微波炉高火加热处理3min直至液体沸腾，然后再中低火继续加热处理10min，处理完成后立即将玻片置于-20℃预冷的梯度酒精中脱水晾干，备用；

(2)AML1-ETO融合基因快速检测探针杂交混合物的制备：将实施例1制备所得浓度为20ng/μL的荧光标记的AML1探针库、浓度为20ng/μL的荧光标记的ETO探针库和杂交缓冲液按照1:1:9的体积比混合；所述杂交缓冲液的组分为：10wt％去离子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1ugRNaseA、0.6M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液；

(3)探针样本共変性：每例样本使用10μL步骤(2)混合所得AML1-ETO融合基因快速检测探针杂交混合物，使用22×22mm盖玻片盖片，使用橡皮胶封片，封片后将玻片置于杂交仪中90℃变性1min，37℃杂交15min～30min；

(4)杂交后洗涤：待杂交完成后揭去盖玻片，将玻片置于60℃预热的洗液(含0.3M氯化钠、0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween-20)中洗涤去除未结合探针；

(5)复染及镜检：将晾干的玻片滴加10μL抗淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察杂交结果。

注意事项：步骤(3)～步骤(5)需避光操作，检测结果如图5所示。

采用实施例1制备的AML1-ETO融合基因快速检测探针及实施例2所述检测方法，设置杂交的时间梯度为10min、15min、30min、1h、16h；同时使用雅培公司AML1/ETO探针严格按照其提供的说明书进行样本处理及杂交操作，同样设置杂交10min、15min、30min、1h、16h时间梯度，作为对照。检测结果如图6所示，从图6看出：本发明所制备的AML1-ETO融合基因快速检测探针在杂交时间为15min时就有较好的杂交信号强度，杂交时间为30min及以上时均具有强烈杂交信号；雅培公司雅培公司AML1/ETO探针仅在杂交时间为16小时时出现可见清晰杂交信号，充分说明了本发明制备的探针杂交所用时间短及杂交信号强的特点，也说明了本发明制备的探针具有极高的信噪比，很高的特异性和样本检出率。同时本发明制备的探针不含重复系列，且探针长短均一，探针与靶基因结合示意图如图2所示，从图2看出，所述探针与靶基因非重复系列区域的结合特异性非常高。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。