一种低成本的AML1‑ETO融合基因快速检测探针及其制备方法和应用与流程

技术特征：

1.一种低成本AML1-ETO融合基因快速检测探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)从UCSC Genome Browser下载AML1和ETO基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中AML1探针覆盖区域为：chr21:34787801-35049334，ETO探针覆盖区域为：chr8:91954967-92103365；

(2)将步骤(1)获得的AML1基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的AML1探针序列；

(3)将步骤(1)获得的ETO基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签系列的ETO探针序列；

(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的AML1探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到AML1探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签系列的ETO探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到ETO探针库；

(5)分别合成5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物和5’端带有橘红色荧光基团的M13通用引物，使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对AML1探针库进行扩增标记反应，使用5’端带有橘红的荧光基团的M13通用引物对ETO探针库进行扩增标记反应；

(6)将步骤(5)所得AML1探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的AML1探针库，将步骤(5)所得ETO探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的ETO探针库，所述荧光标记的AML1探针库和荧光标记的ETO探针库构成了AML1-ETO融合基因快速检测探针。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中所述标签序列的碱基序列如下所示：

5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG

3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述通用引物的序列如下所示：

M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT

M13-R CAGGAAACAGCTATGACC。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(5)所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，共进行35个循环；72℃10min。

7.一种包含权利要求1～6任一所述制备方法制备所得AML1-ETO融合基因快速检测探针的AML1/ETO融合基因试剂盒。

8.权利要求7所述试剂盒在制备用于检测AML1/ETO融合基因产品中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，具体的应用方法包括如下步骤：

(1)样本处理：将外周血细胞滴片样本放入盛有2×SSC的容器中，微波炉高火加热处理3min直至液体沸腾，然后再中低火继续加热处理10min，处理完成后立即将玻片置于-20℃预冷的梯度酒精中脱水晾干，备用；

(2)AML1-ETO融合基因快速检测探针杂交混合物的制备：将荧光标记的AML1探针库、荧光标记的ETO探针库和杂交缓冲液按照1:1:9的体积比混合；

(3)探针样本共変性：每例样本使用10μL步骤(2)混合所得AML1-ETO融合基因快速检测探针杂交混合物，使用22×22mm盖玻片盖片，使用橡皮胶封片，封片后将玻片置于杂交仪中90℃变性1min，37℃杂交15～30min；

(4)杂交后洗涤：待杂交完成后揭去盖玻片，将玻片置于60℃预热的洗液中洗涤去除未结合探针；

(5)复染及镜检：将晾干的玻片滴加10μL抗淬灭封片剂封片，然后在荧光显微镜下观察杂交结果。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，步骤(2)中所述杂交缓冲液的组分为：10wt％去离子甲酰胺、20wt％硫酸葡聚糖、1μg/mLRNaseA、0.6M氯化钠、10mM柠檬酸缓冲液。