本发明涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于鉴定黑麂的特异性PCR引物及使用所述特异性PCR引物鉴定黑麂的方法，以及它们在鉴定黑麂中的应用。
背景技术：
黑麂(Muntiacus crinifrons)是一种特产于我国的鹿科动物，也被称为乌金麂、蓬头麂，分类地位上属哺乳纲(Mammalia)、偶蹄目(Artiodactyla)、鹿科(Cervidae)。黑麂是中国的特产动物，没有亚种分化，分布范围十分狭小，分布于中国安徽南部、浙江西部、江西东部和福建北部的山地地区。栖息于海拔为1000m左右的山地常绿阔叶林及常绿、落叶阔叶混交林和灌木丛。因野生数量极其稀少，黑麂被列入国家I级重点保护动物和世界自然保护联盟(IUCN)濒危物种红色名录(易危级)。国际上，濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)更将其列入了附录I物种保护名录，其国际间的交换和贸易受到严格控制。
在野生动物的保护及管理工作中，基于分类学的准确物种鉴定是首要的前提。物种鉴定的结果往往是森林公安、工商、边检等行政执法部门开展野生动物资源保护与管理工作的基础。传统的形态学分类方法一直是灵长类动物鉴定的常用方法，但形态学分类方法固有的一些缺陷也给物种鉴定工作带来了困难，比如表型可塑性和遗传可变性、生物性别和发育阶段限制等。尤其是近年来在黑麂物种的实际鉴定工作中发现，出于对其皮张及肉的价值攫取，往往送检的黑麂样品都是毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便等，均非完整个体且样品量较小，从形态学上几乎已无法识别。这反映出在现实工作中，单纯基于形态学特征的物种鉴定方法已难以满足黑麂保护工作的实际需求。
随着聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术在法医学鉴定中的不断应用，以DNA序列分析为代表的分子生物学技术在濒危野生动物物种鉴定中也得到了广泛的应用。
因此，提供一种无需DNA的测序、序列比对等繁琐步骤，同时对样品来源无限制，且可仅通过一次PCR扩增即可快速有效地实现对黑麂物种的精确测定的特异性PCR引物是本发明亟需解决的问题。
技术实现要素：
针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术中通过形态学特征对黑麂物种进行测定的局限性，或是以常规方法对粪便中DNA进行测定来确定物种的方法的耗时耗力且花费较大的问题，提供一种简便快捷且经济的用于鉴定黑麂的特异性PCR引物和鉴定黑麂的方法，以及它们在鉴定黑麂中的应用。
为了实现上述目的，本发明提供一种用于鉴定黑麂(Muntiacuscrinifrons)的特异性PCR引物，所述特异性PCR引物包括如SEQ ID No：1所示的引物1，以及如SEQ ID No：2所示的引物2。所述特异性引物可以对目标样品进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳的分离结果即有无产生目的扩增产物，来鉴定待检物种。
本发明还提供一种利用特异性PCR鉴定黑麂(Muntiacus crinifrons)的方法，所述方法包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)采用特异性PCR引物对步骤(1)中提取的总DNA进行PCR扩增；(3)取步骤(2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述特异性PCR引物为权利要求1中所述的特异性PCR引物；其中，在步骤(3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中出现1条条带，则判断所述待测样品为来自黑麂的样品，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中不出现1条条带，则判断所述待测样品不是来自黑麂的样品。
在本发明中，出现的1条条带中所含有的DNA片段的长度为370bp。
在本发明中，为了达到更好的PCR扩增效果，使得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更好地确定实验结果，以30μL的PCR扩增体系为基准，引物的浓度优选为0.25-0.5pmol/L，DNA模板的用量优选为45-55ng。其中，用于PCR扩增的DNA聚合酶以及缓冲液可以为本领域常规DNA聚合酶和缓冲液，其用量具体的可以参照产品说明书中的详细说明。本发明在此不再详细赘述。
所述PCR扩增过程中的退火过程可以为本领域所常规使用的退火方式及退火参数，在本发明中，为了得到更好的扩增效果，所述PCR扩增过程的退火温度为55-65℃，退火时间为25-40s。另外，对于PCR扩增中的变性条件、延伸条件以及循环数等参数的设置均为本领域常规的设置，本发明在此不再详细赘述。
本发明还提供了一种根据上述特异性PCR引物或上述鉴定方法在鉴定黑麂(Muntiacus crinifrons)中的应用。
本发明通过设计特异性PCR引物，利用特异性PCR扩增的方法，对待测样品通过一次常规的PCR扩增即可通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示判定出该物种是否为黑麂，且所用的DNA模板可从动物的毛皮、肌肉组织、内脏或粪便中提取，大大降低了取样的难度，且该方法可简便快捷地鉴定黑麂，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定黑麂的目的。
本发明的优点将在下文的具体实施方式部分进行进一步的详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1-9和对比例1-13的扩增产物的糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
需要阐明的是，所述引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成且引物使用浓度为10pmol/L，所述裂解液可以为本领域常规使用的DNA裂解液，例如，在本发明中，每升所述裂解液中含有50mmol的Tris-HCl(pH8.0)、25mmol的乙二胺四乙酸(pH8.0)、100mmol的氯化钠和1％重量份的十二烷基硫酸钠，本发明中使用的dNTPMix为北京全式金生物技术有限公司的市售品，蛋白酶K为美国Merck公司的市售品，所述DNA纯化试剂盒为北京天根生化公司的市售品，其余所使用的化学试剂均为常规市售分析纯试剂。
图1中，泳道1来自黄麂的肌肉样品、泳道2来自黑麂的肌肉样品、泳道3来自黑麂的粪便样品、泳道4来自毛冠鹿的肌肉样品、泳道5来自黑麂的肌肉样品、泳道6来自鬣羚的肌肉样品、泳道7来自黑麂的肌肉样品、泳道8来自野猪的肌肉样品、泳道9来自獐的肌肉样品、泳道10来自黑麂的粪便样品、泳道11来自猕猴的肌肉样品、泳道12来自林麝的肌肉样品、泳道13来自黑麂的肌肉样品、泳道14来自白鹇的肌肉样品、泳道15来自黑麂的肌肉样品、泳道16来自白颈长尾雉的肌肉样品、泳道17来自黑麂的肌肉样品、泳道18来自安吉小鲵的肌肉样品、泳道19来自绞花林蛇的肌肉样品、泳道20来自黑麂的肌肉样品、泳道21来自梅花鹿的肌肉样品、泳道C来自双蒸水样品、泳道M为分子量标记。
实施例1
将0.5g表1中编号为1(表1中)的待测样品置于离心管中并在离心管中将待测样品用消毒剪刀剪碎，然后向离心管中依次加入500μL的裂解液，30μL的10％十二烷基硫酸钠和3μL的20mg/ml的蛋白酶K，充分混匀后56℃水浴消化12h至管内液体澄清。向上述消化后的混合物中加入Tris-平衡酚500μL，并轻微振荡5min后置于11000r/min的离心机上离心10min，取离心后的上清液。重复上述离心步骤两次。向重复离心后最终得到的上清液中加入冰冻无水乙醇1000μL并于-20℃下放置1h后置于12000r/min的离心机上离心13min后，弃上清液，并向得到的沉淀中加入70％的乙醇800μL，并轻微振荡0.5min后置于13000r/min的离心机上冰冻离心13min，弃上清液。重复上述离心步骤两次。将得到的沉淀置于无菌操作台上自然晾干2.5h后向其中加入TE溶液300μL，轻微振荡并用手指轻弹离心管后于4℃下放置3h后，得到总DNA。
向PCR仪的样品管中加入10μL的10×PCR buffer，10pmol/L的一对PCR引物各1μL，2μL的2mmol/L的dNTPMix，2μL的25mmol/L的Mg2+，1U的Taq酶和50ng的总DNA，并用双蒸水补齐至30μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；然后进行30个循环，该循环包括：95℃变性40s，60℃退火30s和72℃延伸35s；最后再作72℃延伸10min。在上述反应条件下进行PCR扩增。将扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示(泳道编号为2)。
实施例2
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为2(表1中)，所述每条引物的用量为0.75μL，所述总DNA的用量为45ng，所述退火温度为55℃，所述退火时间为40s，电泳结果如图1所示(泳道编号为5)。
实施例3
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为3(表1中)，所述每条引物的用量为1.5μL，所述总DNA的用量为55ng，所述退火温度为65℃，所述退火时间为25s，电泳结果如图1所示(泳道编号为7)。
实施例4
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为4(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为10)。
实施例5
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为5(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为13)。
实施例6
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为6(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为15)。
实施例7
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为7(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为17)。
实施例8
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为8(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为10)。
实施例9
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为9(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为3)。
对比例1
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为10(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为21)。
对比例2
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为11(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为1)。
对比例3
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为12(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为9)。
对比例4
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为13(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为4)。
对比例5
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为14(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为12)。
对比例6
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为15(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为6)。
对比例7
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为16(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为8)。
对比例8
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为17(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为11)。
对比例9
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为18(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为16)。
对比例10
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为19(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为14)。
对比例11
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为20(表1中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为19)。
对比例12
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，待测样品编号为21(表1 中)，电泳结果如图1所示(泳道编号为18)。
对比例13
将双蒸水作为总DNA，按照实施例1的方法进行扩增及琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1所示(泳道编号为C)。
检测例
将得到条带中含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块用干净的手术刀切下并在DNA纯化试剂盒中纯化后送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序。
表1
通过表1的样品信息和图1所示的电泳图可以看出，本发明通过设计1组特异性PCR引物，对待测样品仅通过一次常规的PCR扩增即可通过琼脂糖凝胶电泳图中的条带显示判定出该物种是否为黑麂的，且电泳结果与样品信息完全符合，证实了该鉴定方法的可靠性，同时，送至上海生工生物工程技术有限公司进行测序的DNA片段的序列与GenBank数据库中已知的黑麂物种的序列进行比对后，得到的比对结果表明该测序的DNA片段的序列与已知的黑麂物种的序列的同源性在96％以上，故而也进一步证实了该待测样品的物种为黑麂，而且在本实验中，所用的DNA模板可从动物的毛皮、肌肉组织、内脏或粪便中提取，大大降低了取样的难度，且该方法可简便快捷地鉴定黑麂，从而达到了简便易行且经济实用地鉴定黑麂的效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽师范大学
<120> 用于鉴定黑麂的特异性PCR引物和方法及其在鉴定黑麂中的应用
<130> 04423
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is synthesized.
<400> 1
atcctactcc taattctctt cc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is synthesized.
<400> 2
gagctggtaa ttggtataag 20