快速筛查P53基因外显子5‑8突变的体外检测方法及应用与流程

本发明涉及基因检测方法。尤其是涉及一种快速筛查P53基因外显子5-8突变的体外检测方法及其应用。
背景技术：
：近年来，我国恶性肿瘤的发生率和病死率呈明显上升趋势，已跃居我国居民死亡病因的首位。然而，对于恶性肿瘤的早期发现、早期诊断以及防治，尚无突破性研究，部分患者就诊时已处于中晚期，疗效较差。因此，提高恶性肿瘤的早期诊断水平，是改善恶性肿瘤诊治疗效的有效出路。目前临床上，多采用血清学检测的方法监测血清或其他体液中的肿瘤标志物，动态地对肿瘤的存在、发生发展及预后做出判断。然而，任何一种科学指标都不是绝对的。肿瘤标志物的器官特异性和肿瘤特异性较差,既存在于肿瘤中也存在于正常人群和非肿瘤患者血液和体液中,每个人对于肿瘤标志物都有各自的基础水平,不能单凭超过参考范围而进行诊断。有时要借助相关辅助检查,对检测结果进行仔细分析后,才能提高对肿瘤的存在、发展及预后的实用价值。同时，肿瘤标志物浓度会受到体内代谢的很多因素影响，所以准确性也会受到影响。以肿瘤标记物甲胎蛋白(AFP)为例，除绝大多数肝癌病人的血清呈阳性外，还有31％～52％的急性肝炎、15％～58％的慢性肝炎以及11％～47％的肝硬化病人的AFP也会有大幅上升，因此不必一看到“阳性”就“色变”。当然，与此同时，甲胎蛋白阴性自感不适的患者也不能掉以轻心，还要依靠大夫联合多项检查直至细胞学、病理学检查等做进一步查实和鉴别。基因是具有遗传效应的DNA片段，支持着生命的基本构造和性能。基因虽然十分稳定，能在细胞分裂时精确地复制自己，但这种稳定性是相对的。在一定的条件下基因也可以从原来的存在形式突然改变成另一种新的存在形式，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因。无论是碱基置换突变还是移码突变，都能使多肽链中的氨基酸组成或顺序发生改变，进而影响蛋白质或酶的生物功能，使机体的表型出现异常。因此，对基因的突变进行检测，能够在疾病发生的早期阶段被检测出，有利于实现疾病的早发现，早诊断，早治疗。HRM(高分辨率熔解曲线分析)是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。美中不足的是在进行未知突变筛查、扫描时，只能检测到有无突变，无法确定突变在DNA片段中位置。触底PCR(Touchdown(TD)PCR)是一种特殊技术，只需要做一次正式实验，就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的，绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。技术实现要素：本发明的技术目的是提供一种快速筛查P53基因外显子5-8突变的体外检测方法，其不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变的分析。操作简便快速，使用成本低，结果准确，能够实现真正的闭管操作。同时针对人群快速筛查，具有高通量、速度快、可试剂盒化、检测成本低等特点。一种快速筛查P53基因外显子5-8突变的体外检测方法，包括以下步骤：(1)提取外周血样品基因组DNA；(2)设计合成用于扩增P53基因外显子5-8的特异性引物共4对；(3)使用上述引物对样品基因组DNA进行高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR，95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用分析软件对采集后的曲线进行分析；(4)HRM曲线分析：如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生P53基因突变。例如附图1、图2、图3中箭头所示，相对于阴性对照出现一个单独的峰，为阳性结果，可以表明存在P53基因突变。所述步骤(2)中的特异性引物，是针对P53基因外显子5-8特别设计的引物，经过反复试验筛选和验证，最终筛选得到，具有特异性强、扩增效率高等优点，优选的核苷酸序列分别是：所述步骤(3)中PCR的反应体系优选的是：总体积为15μL的反应体系包含：mastermix10μL；MgCl22.4μL；GCenhancer0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其余为RNasefreeH2O。反应时，向所述反应体系中加入样品基因组DNA、阴性对照、空白对照进行触底PCR反应，其中阴性对照是P53野生型序列，空白对照是无DNA模板。本发明的检测方法，还有一个明显的技术特征是，所述步骤(1)中外周血样品采用干血片收集。只需要0.5mL的外周血即可，对于待检者来说，具有可长途运输、保存时间长、采血简单等优点，是基因检测技术中一项重大的改进。同时步骤(1)中样品基因组DNA的提取可采用商品化试剂盒提取。操作简单易行，也方便高通量检测时使用。本发明的检测方法可用于快速筛查P53基因外显子5-8突变。利用HRM联合触底PCR的方法，能够实现在同一实验条件下，对干血片中提取得到的待检人群的DNA中P53基因多个外显子的突变进行检测。实验显示，通过对200例实验人群血液中P53基因5-8外显子进行检测，能够成功检测到3例受检者血液DNA中P53基因存在突变，之后运用一代测序法对PCR产物进行检测并与人类基因组序列进行比对后证实，这3例样本确实存在DNA序列上的改变。证明了本发明方法的正确性。本发明的检测方法可以应用在任意一种快速筛查P53基因突变检测试剂盒中。优选包含用于扩增P53基因外显子5-8的特异性引物共4对，其核苷酸序列分别如上表所示。检测试剂盒还含有PCR试剂、阴性对照、空白对照，其中阴性对照是P53野生型序列，空白对照是无DNA模板。本发明的试剂盒具有如下优点：(1)全部引物能在同一温度下进行稳定的PCR反应，获取特异性的P53基因片段；(2)检测灵敏度高，特异性强；(3)小反应体系(15μL)，标本和试剂用量少；(4)采用检测样本为外周血干血片，采集容易，保存时间长，运输容易；(5)反应简便迅速，2小时即可获得实验结果，便于大样本高通量处理；(6)试剂价格低廉，成本低。附图说明图1为实施例2中第68号样本的HRM溶解曲线图；图2为实施例2中第105号样本的HRM溶解曲线图；图3为实施例2中第160号样本的HRM溶解曲线图；图4为实施例2中第68号样本的测序结果图；图5为实施例2中第105号样本的测序结果图；图6为实施例2中第160号样本的测序结果图；图7为实施例2中阴性样本的HRM溶解曲线图。具体实施方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1一种快速筛查P53基因外显子5-8突变的体外检测方法，包括以下步骤：(1)干血片DNA的提取总DNA提取按照磁珠法干血斑基因组DNA提取试剂盒(天根)说明书进行，如下：1、取一块新的96孔深孔板，然后在每孔加入三片3*3mm的干血斑样品。在96深孔板中加入200μL的缓冲液GA。2、加入20μL蛋白酶K溶液，涡旋震荡10秒混匀后，放入预热至56度的恒温振荡器中，900rpm恒温震荡裂解30分钟。3、在上一步样品裂解期间，向新的96孔深孔板中加入10μL磁珠悬浮液G，200μL缓冲液GB和200μL无水乙醇，抽打混匀或震荡混匀10秒。4、样品裂解后，将步骤3中深孔板短暂离心，冰箱裂解液完全移至步骤4中的深孔板，然后将其放入恒温振荡器，室温900rpm震荡3分钟。5、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。6、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。7、将深孔板从磁力架上取下，加入500μL缓冲液GD，抽打混匀或震荡混匀。8、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，待磁珠完全吸附时小心去除液体。9、将深孔板从磁力架上取下，加入500μL漂洗液PW，抽打混匀或振荡混匀3分钟。10、将深孔板放置于磁力架上静置1分钟，带磁珠完全吸附时小心去除液体，使磁珠继续被吸附。11、缓慢加入750μL漂洗液PWIII，尽量不要冲起磁珠，静置20秒后用移液器小心去除液体，取下深孔板。12、加入50-100μL洗脱缓冲液TB或去离子水，抽打混匀或振荡混匀，置于56度，孵育5-10分钟。13、将深孔板放置于磁力架上静置2分钟，待磁珠完全吸附时小心将DNA溶液转移至收集板，并于适当条件保存。(2)高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR高分辨率熔解曲线分析的P53基因外显子5-8的特异性引物共计4对，序列如下表所示：P53外显子5正向引物TTACTCTTCAAGCTGTCCTC如SEQIDNo.1所示P53外显子5反向引物CTTATGGTCATTATTACTTT如SEQIDNo.2所示P53外显子6正向引物TACTGGAAGTTATTCGATCT如SEQIDNo.3所示P53外显子6反向引物TGTTTACCACTAGATCTCTG如SEQIDNo.4所示P53外显子7正向引物GTACTAATTCCTAGGTGGGC如SEQIDNo.5所示P53外显子7反向引物CTTGTCGATCCTGACCTGTA如SEQIDNo.6所示P53外显子8正向引物TGTATCCTGAGTATTGGTCT如SEQIDNo.7所示P53外显子8反向引物ATCTGCTTGCGGCTCTCGCT如SEQIDNo.8所示配制总体积为15μL的PCR反应体系；体系包含：mastermix10μL；MgCl22.4μL；GCenhancer0.5μL；引物F1μL；引物R1μL，其余为RNasefreeH2O。将配好的反应体系加入96孔板内，之后按照加样顺序，取5μL样品、阴性对照、空白对照依次加入相应孔内，在96孔板上封膜，振荡混匀，之后短暂离心。高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR反应条件：95℃预变性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50个循环；95℃1min，40℃1min，从65℃开始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲线，到95℃，之后40℃10s结束，用LightCycler480所配分析软件对采集后的曲线进行分析。如相对于阴性对照出现了单独的峰，则为阳性结果，表明发生P53基因突变。(3)直接测序法进行验证(此为可选步骤)用高分辨率熔解曲线分析联合触底PCR的方法得到阳性结果的样本，即发生P53基因突变。将发生突变的样本剩余的DNA进行基因测序，验证其有无假阳性。实施例2：临床样品检测采用实施例1的方法对200例体检人群血液中P53基因5-8外显子进行检测，能够成功检测到3例受检者血液DNA中P53基因存在突变，之后运用一代测序法对PCR产物进行检测并与人类基因组序列进行比对后证实，这3例样本确实存在DNA序列上的改变。200例体检人群血液样本，其中有3例(第68号，105号，160号)出现突变(出现了单独的峰)，第68号样本P53基因外显子7疑似出现核酸序列变化(图1)；第105号样本P53基因外显子6疑似出现核酸序列变化(图2)；第160号样本P53基因外显子5疑似出现核酸序列变化(图3)。经一代测序检测，结果显示第68号样本P53基因coden244出现GGC/GGT同义变(图4)；第105号样本P53基因12759位出现C/G变异(图5)，此变异对P53蛋白功能无影响；第160号样本P53基因coden163出现TAC/TGC(酪氨酸/半胱氨酸)变异(图6)。另图7是检测样本中的阴性样本的HRM溶解曲线图，相对于阴性对照，阴性样本的检测曲线未出现明显的差异。结果表明，本发明提供的检测方法可快速检测P53基因5-8外显子的多种突变，适用于临床早期肿瘤患者筛查。具有检测灵敏度高，特异性强，反应简便迅速，2小时即可获得实验结果，便于大样本高通量处理等特点，筛查出的阳性结果再经过基因测序法确定，可以大为减少早期肿瘤筛查的困难度和检测成本。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>北京青航基因科技有限公司<120>快速筛查P53基因外显子5-8突变的体外检测方法及应用<130>P1610248<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ttactcttcaagctgtcctc20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2cttatggtcattattacttt20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3tactggaagttattcgatct20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4tgtttaccactagatctctg20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5gtactaattcctaggtgggc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6cttgtcgatcctgacctgta20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7tgtatcctgagtattggtct20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8atctgcttgcggctctcgct20当前第1页1 2 3