聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法与流程

本发明属于医疗检测用试剂领域，具体涉及聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法。

背景技术：

流式细胞仪是目前生命科学以及临床上进行细胞周期及凋亡检测，以及肿瘤检测预后等领域中最先进的仪器之一，可同时且高通量地进行细胞DNA信息检测，从而对细胞周期、凋亡状态以及倍体情况进行详细的分析。在进行上述检测过程中，常需要对仪器准确度进行校准。细胞核作为细胞中遗传物质的主要储存场所，具有稳定而一致的DNA含量，并可在特殊处理后，形成1，2，3，4，直至7个以上的细胞核聚集团，可在经荧光染料染色后，对流式细胞仪的线性、检测限以及放大增益进行校准，同时还可用作DNA检测中的内标品。目前已开发的细胞核质控试剂包括鸡红细胞核、小牛胸腺嘧啶细胞核、鳟鱼红细胞核等，这些细胞核试剂成本较化学合成的微球低，具有与生物样品相同的构成，可更好的应用于流式DNA检测的校准中。

然而，当前国内外尚无公开的细胞核校准试剂的开发方案，市售的流式细胞仪校准用细胞核试剂主要由BD和Biosure公司垄断，价格昂贵，到货周期长，给流式细胞仪的应用来了很多不便。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种标准方法，能够制备聚集状态可控且能够长期保存的细胞核。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法，其包括：

S1:收集有核细胞样品，洗涤，离心去上清，加入裂解液裂解；

S2:加入蔗糖溶液，在15000-40000g、4℃下离心；

S3:取上清，将所得细胞核加入到-20℃预冷的固定液1中进行交联；

S4:交联2天后，将固定液1置换为固定液2，即获得聚集状态可控且能够长期保存的细胞核；

其中，所述固定液1包括：

甲醇或乙醇；

牛血清白蛋白或胎牛血清或甘油；

水；

所述固定液2包括：

戊二醛或甲醛；

牛血清白蛋白或胎牛血清或甘油；

水。

优选的是，所述的聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法，其中，所述裂解液包括有0.1-0.5％的曲拉通X-100，0.1-2μM二硫苏糖醇及0.1-1μM苯甲基磺酰氟，0.5-2％的乙基苯基聚乙二醇，30-60mM柠檬酸钠或三羟甲基氨基甲烷，0.01-0.1％(v/v)DMSO，PH7.6。

其中所涉及的细胞可能包括鸡红细胞、小牛胸腺嘧啶细胞、斑马鱼红细胞以及鳟鱼红细胞等，这些细胞多为有核红细胞或其他来源广泛且有核的细胞，所述浓度及时间优选，应使细胞膜破碎且核膜完整，其中曲拉通是细胞通透剂，二硫苏糖醇是巯基保护剂，苯甲基磺酰氟是蛋白酶抑制剂，乙基苯基聚乙二醇是细胞裂解液，柠檬酸钠及三羟甲基氨基甲烷除缓冲作用外，更重要的是缓解裂解液对于核膜的破坏作用，DMSO是核膜流动保护剂。

优选的是，所述的聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法，其中，所述蔗糖溶液中包括有1.5-2.2M蔗糖，0.5-2％甘油，0.1-0.5％甘氨酸溶解于0.01M的PBS缓冲液中。

其中蔗糖溶液浓度及离心速度优选，应保证细胞核与细胞质膜成分的分离，并保护过程中核膜及其内DNA的完整，甘油是核膜稳定剂，甘氨酸为新引入试剂，主要是考虑其对核膜稳定性的保护作用。

优选的是，所述的聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法，其中，所述固定液1中包含70-80％甲醇或乙醇，1-10％的牛血清白蛋白或胎牛血清或甘油，其余以水补齐。

其中甲醇、乙醇用于固定细胞核中的染色质，保护其内的DNA稳定，并实现细胞核的聚集。血清、蛋白或甘油防止核膜在震荡中破碎。乙醇与保护剂的配比经优化后，实现鸡红细胞核的可控交联，满足单核30％-40％，双核15-20％，三核5-15％，四核5-10％，五核2-10％，六核1-5％，七核1-5％，因此均为必需。

优选的是，所述的聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法，其中，所述固定液2中含2％戊二醛或1％甲醛，1-10％的牛血清白蛋白或胎牛血清或甘油，其余以水补齐，其中戊二醛或甲醛主要用于维持细胞核聚集状态。

优选的是，所述的聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法，其中，所述固定液1中还包括有0.3-0.5％的糠醛，糠醛是很好的有机溶剂，其化学性质活泼，可以通过氧化、缩合等反应制取众多的衍生物，具有很强的杀菌能力。

优选的是，所述的聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法，其中，所述固定液1中还包括有0.05-0.08％的乙基麦芽酚，它是一种安全无毒、用途广、效果好、用量极少的添加剂，且具有抗菌、防腐性能，能延长储存期。

本发明的有益效果是：

1、该试剂可用作流式细胞仪以及相关仪器进行细胞DNA总量检测、周期分析以及肿瘤预后检测中的校准品与质控品。

2、逐步改变国内流式细胞仪用试剂对进口试剂的依赖，大大降低流式细胞仪的应用成本。

3、该试剂的大量生产可推动科研中细胞倍体检测及临床肿瘤预后的方便进行，提高肿瘤治疗质量。

4、本案中的细胞核制备方法仅需3步即可完成，所得试剂纯度较高，与进口产品具有相同质量，可满足仪器需要。

5、本方法所需试剂均价格较低，可有效降低试剂制备成本，可很好的作为产品开发方案。

6、本案中获得的红细胞核产品可在4℃下稳定保存1年以上，具有良好的产品开发潜质。

附图说明

图1是采用聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法所获鸡红细胞核试剂(实施方案1)在流式细胞仪上的检测效果图。

图2是采用聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法所获鸡红细胞核(实施方案1)的200倍显微镜图。

图3是采用聚集状态可控且能够长期保存的细胞核的制备方法所获的小牛胸腺嘧啶细胞核试剂(实施方案2)在流式细胞仪上的检测效果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

以下列出聚集状态可控且能够长期保存的细胞核制备方法的六个实施方案和两个对比方案，其包括有：

实施方案1

(1)收集3*10⁷的鸡红细胞经PBS洗涤，1500rpm离心去上清，加入10mL裂解液，所述裂解液包含0.1％的曲拉通X-100，1μM二硫苏糖醇及0.5μM苯甲基磺酰氟，1％的乙基苯基聚乙二醇，40Mm柠檬酸钠，0.05％DMSO，PH7.6。

(2)裂解10min后，鸡红细胞溶液缓慢加入30mL浓蔗糖溶液上层，30，000g，4℃下，离心50min。所述蔗糖溶液中包含2M蔗糖，1％甘油，0.2％甘氨酸溶解于0.01M的PBS缓冲液中。

(3)取上清，所获得的鸡红细胞核加入-20℃预冷的固定液，所述固定溶液中包含40％甲醇，30％的乙醇，1％的戊二醛、1％甲醛，1％牛血清白蛋白、1％的甘油，其余以水补齐。经固定后细胞呈现不同程度的多聚集体结构(1,2,3-7个以上的细胞核聚集团，图1)。

所述所有过程应保持在4℃下进行。所得鸡红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成7峰，比例符合需求，单峰CV值分别在2.3％-2.8％之间(图2)，可用于后续校准试验。

实施方案2

本案将实施方案1中的细胞更换为小牛胸腺嘧啶细胞，其余保持不变，所得小牛胸腺嘧啶细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成7峰，比例符合需求，单峰CV值分别在1.8％-3.0％之间(图3)，同样可满足后续校准试验的需要。

实施方案3

本案将实施方案1中的细胞更换为斑马鱼红细胞，其余保持不变，所得斑马鱼红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成8峰，比例符合需求，单峰CV值分别在2.1％-2.9％之间，同样可满足后续校准试验的需要。

实施方案4

本案将实施方案1中的细胞更换为鳟鱼红细胞，其余保持不变，所得鳟鱼红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成7峰，比例符合需求，单峰CV值分别在2.5％-2.9％之间，同样可满足后续校准试验的需要。

实施方案5

本案将实施方案1中的固定液1中加入0.3-0.5％的糠醛，其余保持不变，所得鸡红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成8峰，比例符合需求，单峰CV值分别在1.5％-1.7％之间，同样可满足后续校准试验的需要。

实施方案6

本案将实施方案5中的固定液1中又加入0.05-0.08％的乙基麦芽酚，其余保持不变，所得鸡红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成9峰，比例符合需求，单峰CV值分别在1.3％-1.4％之间，同样可满足后续校准试验的需要。

对比方案1

本案向实施方案1的固定液1中加入0.05-0.08％的乙基麦芽酚，未添加糠醛，其余保持不变，所得鸡红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成5峰，比例不符合需求，单峰CV值分别在3.3％-3.6％之间，不满足后续校准试验的需要。

对比方案2

本案向实施方案1中的固定液1中加入0.2％的糠醛和0.05-0.08％的乙基麦芽酚，其余保持不变，所得鸡红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成7峰，比例不符合需求，单峰CV值分别在2.4％-2.9％之间，不满足后续校准试验的需要。

对比方案3

本案向实施方案1中的固定液1中加入0.6％的糠醛和0.05-0.08％的乙基麦芽酚，其余保持不变，所得鸡红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成7峰，比例不符合需求，单峰CV值分别在2.5％-2.8％之间，不满足后续校准试验的需要。

对比方案4

本案向实施方案1中的固定液1中加入0.3-0.5％的糠醛和0.04％的乙基麦芽酚，其余保持不变，所得鸡红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成8峰，比例不符合需求，单峰CV值分别在2.2％-2.5％之间，不满足后续校准试验的需要。

对比方案5

本案向实施方案1中的固定液1中加入0.3-0.5％的糠醛和0.09％的乙基麦芽酚，其余保持不变，所得鸡红细胞核经5μg/ml碘化丙啶染色，经流式细胞仪检测，成8峰，比例不符合需求，单峰CV值分别在2.6％-2.9％之间，满足后续校准试验的需要。

综上所述，将6组实施方案的试验结果制成表格，如下：

由上表可知，上述有核红细胞样品经过该细胞核制备方法，均可得到聚集状态可控且能够长期保存的细胞核，尤其在固定液1中加入糠醛和乙基麦芽酚后，所得到的细胞核更符合试验需求。

将实施方案1和5组对比方案的试验结果制成表格，如下：

综合以上两表格可看出，对比方案1在固定液1未加入糠醛的情况下加入乙基麦芽酚，无法制备到符合试验需求的细胞核，在后续对比方案中，当所加入的糠醛和乙基麦芽酚不在实施方案6所述的浓度范围时，所制得的细胞核虽符合试验需求，但远没有实施方案6的试验效果好，所以可推知，在固定液1中加入0.3-0.5％的糠醛和0.05-0.08％的乙基麦芽酚的试验效果最好，最符合试验需求。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。