一种用于检测黄龙病的环介导等温扩增引物组及试剂盒的制作方法

本发明属于柑橘黄龙病病原物检测技术领域，具体涉及一种用于检测黄龙病的环介导等温扩增引物组及试剂盒。

背景技术：

柑橘黄龙病是世界柑橘生产上的毁灭性病害。柑橘黄龙病病原物为革兰氏阴性杆菌，能够侵染包括柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物并产生毁灭性后果，危害极大。被黄龙病病菌感染的植株无有效治愈方法，只能砍伐以防止疫情继续扩散，给养殖户带来巨大的损失。

目前针对黄龙病的诊断方法及其优缺点如下：

1、田间诊断—简易，但易混淆，不太容易与其他病害区分；

2、电镜检测—需要昂贵的仪器和实验室，容易漏检；

3、免疫学检测—需要实验室和仪器，周期长；

4、分子检测—准确快速，但前处理复杂，需要昂贵设备，对技术人员要求较高。

目前还没有一种能够快速、准确地检测黄龙病的方法。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种能够快速、准确地检测黄龙病的环介导等温扩增引物组及试剂盒。

本发明所采用的技术方案为：一种用于检测黄龙病的环介导等温扩增引物组，包括引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6，所述引物P1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物P2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物P3的序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物P4的序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物P5的序列如SEQ ID NO：5所示，所述引物P6的序列如SEQ ID NO：6所示。

其中，SEQ ID NO：1的序列为：TCATGCCATCAGATGTGC；

SEQ ID NO：2的序列为：GTAACGTCAATTGCTGCG；

SEQ ID NO：3的序列为：CCGTAGGAGTCTGGACCGTGCTGGTCTGAGAGGATGA；

SEQ ID NO：4的序列为：CCATGCCGCGTGTATGAAGATATTAACCACAACACCTTCCTC；

SEQ ID NO：5的序列为：TCAGTTCCAGTGTGGCTG；

SEQ ID NO：6的序列为：GGCCTTCGGGTTGTAAAGTA。

本申请的发明人，根据黄龙病病菌特有的靶序列，设计出一对内引物(引物P1和引物P2)、一对外引物(引物P3和引物P4)和一对环引物(引物P5和引物P6)，能够特异性识别靶序列上的8个独立区域，利用特异性聚合酶启动循环链置换反应，在基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物，用于后续的定性和定量分析。

本发明还提供了一种含有所述环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述试剂盒还包括反应液，所述反应液包括反应浓缩液和逆转录酶；所述反应浓缩液包括DNA聚合酶，酶缓冲液，dNTP，MgSO₄，甘氨酸三甲胺内盐和荧光染料。

所述试剂盒能够快速、准确的检测出柑橘是否被黄龙病病原物感染。

使用所述试剂盒检测黄龙病病原物的方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：取疑似感染黄龙病的柑橘叶片，破碎后提取核酸并稀释，作为样品；

(2)引物处理：将引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6等体积混合，得到引物试剂，在混合前，所述引物P1和引物P2的浓度为40nM，引物P3和引物P4的浓度为5nM、引物P5和引物P6的浓度为20nM；

(3)环介导等温扩增反应：将样品、引物试剂和反应液混合均匀后，放入等温扩增荧光检测系统，在65℃下，进行环介导等温扩增反应30分钟；

(4)溶解曲线分析：在环介导等温扩增反应过程中，对cDNA的浓度进行分析，得到扩增曲线和溶解曲线；

(5)结果判断：根据所获得扩增曲线和溶解曲线判定，若扩增曲线为明显的S型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显S型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显S型曲线，但溶解曲线峰型不单一，则判定为非特异性扩增。

需要说明的是，核酸的等温扩增法属于核酸体外扩增诸多方法中的一类，在核酸扩增过程中温度恒定不变，即不需要环境温度的反复变化即可完成DNA的复制和扩增，其技术的核心在于其独特的引物结构和扩增方式以及具有特殊活性的DNA聚合酶的使用，本申请中使用的是等温扩增荧光法。

等温扩增荧光法(Isothermal Amplification Fluorescent Identification Method)是核酸等温扩增和荧光技术的结合，其反应过程在恒温条件下进行，通过添加有特殊链置换活性的DNA聚合酶和针对目标基因特异性片段设计的特异性引物组使核酸扩增得以在恒温条件下来完成，同时在体系中加入荧光基团即荧光标记物，该荧光标记物能特异性结合到DNA双链氢键的小沟部分，且结合到DNA双链之后可被激发并发出特殊波长的荧光，该荧光标记物在单独存在的情况下不会被激发且只与DNA双链结合，故体系中的荧光强度即代表了体系中DNA双链的浓度，最后通过荧光信号累积实时监控整个核酸扩增过程，实现核酸扩增的实时监测，核酸复制扩增反应结束后可对产物做退火溶解曲线分析，溶解曲线可进一步坚定该核酸扩增产物是否是特异性扩增。结合技术的应用，实现了在确保实验结果准确性，该方法是一种高特异性的快速扩增法，非常适合黄龙病的田间快速检测。

因体系中加入了能特异性与DNA双链集合的荧光物质，故随着扩增的不断进行和产物的累积，能实时监测整个扩增反应的全过程并做到定性和简单的定量分析。

为进一步增加检测的准确性，方便实验人员对照使用，优选的技术方案是，所述试剂盒还包括对照物，所述对照物包括阳性对照物和阴性对照物。在检测时，同时使用阳性对照物和阴性对照物作为样本进行检测，当阳性对照物的检测结果是阳性结果，且阴性对照物的检测结果是阴性结果时，则本次测试有效，否则本次测试无效。

根据本发明的一个实施例，所述阳性对照物为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA片段，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：7所示；所述阴性对照物为反应液或双蒸水。

SEQ ID NO：7的序列为：TTCGGGCCTC ATGCCATCAG ATGTGCCCAG ATGGGATTAG CTAGTAGGTG GGGTAACGGCTCACCTAGGC GACGATCCCT AGCTGGTCTG AGAGGATGAC CAGCCACACT GGAACTGAGACACGGTCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGCACAATGG GCGCAAGCCTGATGCAGCCA TGCCGCGTGT ATGAAGAAGG CCTTCGGGTT GTAAAGTACT TTCAGCGGGGAGGAAGGTGT TGTGGTTAAT AACCGCAGCA ATTGACGTTA CCCGCAGAAG AAGCACCGGC。

为方便使用，所述引物P1和引物P2的浓度为40nM，引物P3和引物P4的浓度为5nM、引物P5和引物P6的浓度为20nM。所述环介导等温扩增引物组的体积为6ul，所述反应液的体积为15ul，所述环介导等温扩增引物组中各引物的体积均为1ul。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供了一种能够快速、准确地检测黄龙病的环介导等温扩增引物组，能够特异性识别靶序列上的8个独立区域，利用特异性聚合酶启动循环链置换反应，在基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环DNA混合物，用于后续的定性和定量分析。

2、本发明还公开了一种含有所述环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述试剂盒适合在实验室或其他地点进行快速筛查和检测，扩大了适用范围。

3、因体系中加入了能特异性与DNA双链集合的荧光物质，故随着扩增的不断进行和产物的累积，能实时监测整个扩增反应的全过程并做到定性和简单的定量分析。

附图说明

图1为使用所述试剂盒检测柑橘是否被黄龙病病原物感染的方法流程示意图；

图2是实施例4中准确性验证中的扩增曲线；

图3是实施例4中准确性验证中的溶解曲线。。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

一种用于检测黄龙病的环介导等温扩增引物组，包括引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6，所述引物P1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物P2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物P3的序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物P4的序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物P5的序列如SEQ ID NO：5所示，所述引物P6的序列如SEQ ID NO：6所示。

实施例2

一种含有实施例1所述环介导等温扩增引物组的试剂盒，所述试剂盒还包括反应液和对照组，所述反应液包括DNA聚合酶、缓冲液、dNTPS、MgSO4和甘氨酸三甲胺内盐；所述对照物包括阳性对照物和阴性对照物，所述阳性对照物为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA片段，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：7所示，所述阴性对照物为反应液或双蒸水。

一般来说，引物试剂的浓度需要使用前配置，为方便使用，所述引物P1和引物P2的浓度为40nM，引物P3和引物P4的浓度为5nM、引物P5和引物P6的浓度为20nM。所述环介导等温扩增引物组的体积为6ul，所述反应液的体积为15ul，所述环介导等温扩增引物组中各引物的体积均为1ul。

本实施例中，反应液直接使用Optigene公司的IMM。当然本领域技术人员也能够使用其他反应液，在此就不在赘述。

所述试剂盒能够快速、准确的检测出柑橘是否被黄龙病病原物感染。

实施例3

图1为使用实施例2所述试剂盒检测柑橘是否被黄龙病病原物感染的方法流程示意图，所述方法包括以下步骤：

(1)样品处理：取疑似感染黄龙病的柑橘叶片，液氮冷冻破碎或机械破碎后，加入1ml细胞裂解液提取析出的核酸，并稀释，作为样品；

(2)引物处理：将引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6等体积混合，得到引物试剂，在混合前，所述引物P1和引物P2的浓度为40nM，引物P3和引物P4的浓度为5nM、引物P5和引物P6的浓度为20nM；

(3)环介导等温扩增反应：将样品、引物试剂和反应液混合均匀后，作为检测组；将阳性对照物、引物试剂和反应液混合均匀后，作为阳性对照组；将阴性对照物、引物试剂和反应液混合均匀后，作为阴性对照组；将检测组、阳性对照组和阴性对照组放入等温扩增荧光检测系统(英国Optigene公司Genie II型)在65℃下，进行环介导等温扩增反应60分钟；其中，扩增总体系为25ul，其中所述环介导等温扩增引物组的体积为6ul，所述反应液的体积为15ul，余量为水。

所述反应液为英国Optigene公司的IMM(Isothermal Master Mix)；所述阳性对照物为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA片段，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：7所示；所述阴性对照物为双蒸水。

(4)溶解曲线分析：在环介导等温扩增反应过程中，对cDNA的浓度进行分析，得到扩增曲线和溶解曲线；

(5)根据所获得扩增曲线和溶解曲线判定，若扩增曲线为明显的S型曲线，以及溶解曲线与标准菌株在正负005℃以内，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显S型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显S型曲线，但与标准菌株超过正负005℃，则判定为非特异性扩增。在检测时，同时使用阳性对照物和阴性对照物作为样本进行检测，当阳性对照物的检测结果是阳性结果，且阴性对照物的检测结果是阴性结果时，则本次测试有效，否则本次测试无效。

与传统方法对比，本实施例中的方法具有一下几点明显优势特点：

1、速度快：核酸提取时间仅需一两分钟，上机检测时间只需半小时；

2、特异性好：针对黄龙病菌的特异性核酸片段进行检测，在基因水平的检测比其他常规生理生化方法和田间经验判定等方法具有无法比拟的优势；

3、判定方法简单：实时荧光曲线和溶解曲线一目了然，无需复杂的专业经验和技术背景；

4、检测过程无毒无害：整个实验过程所使用的仪器和试剂均无任何毒性和传染性，不会对人体健康造成威胁。

实施例4

本实施例为实施例3中所述方法的准确性验证。

使用实施例3中的检测方法，用健康柑橘树叶和感染黄龙病的柑橘树叶，分别破碎后提取核酸并稀释，作为样品分别检测。结果显示，健康柑橘树叶的扩增曲线没有出现明显S型曲线，则判定为阴性结果，感染黄龙病的柑橘树叶的扩增曲线为明显的S型曲线，判定为阳性结果。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 张薇

<120> 一种用于检测黄龙病的环介导等温扩增引物组及试剂盒

<130> 2010

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

tcatgccatc agatgtgc 18

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<212> DNA

<213> 未知

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gtaacgtcaa ttgctgcg 18

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<211> 37

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

ccgtaggagt ctggaccgtg ctggtctgag aggatga 37

<210> 4

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<212> DNA

<213> 未知

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ccatgccgcg tgtatgaaga tattaaccac aacaccttcc tc 42

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<212> DNA

<213> 未知

<400> 5

tcagttccag tgtggctg 18

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<212> DNA

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ggccttcggg ttgtaaagta 20

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<211> 300

<212> DNA

<213> 未知

<400> 7

ttcgggcctc atgccatcag atgtgcccag atgggattag ctagtaggtg gggtaacggc 60

tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga 120

cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct 180

gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg 240

aggaaggtgt tgtggttaat aaccgcagca attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc 300