一种检测JAG2基因SNP位点rs741859基因型的试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及基因工程领域，具体涉及JAG2基因SNP位点rs741859基因型的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：JAG2基因是NOTCH信号通路的配体之一，它的主要作用是参与了次级腭的形成和发育过程，被认为是唇腭裂的候选基因之一。JAG2基因rs741859(c*1053G>A)位点位于该基因的5’端附近，在研究中该位点AG、GG基因型表现出与非综合征性唇腭裂有显著性相关性。作为常见的出生缺陷和颅面发育缺陷，唇腭裂是一种复杂的异质性疾病，国际上将其分为综合征性(syndromiccleftliporpalate，SCLP)和非综合征性唇腭裂(non-syndromiccleftliporpalate，NSCLP)。全球唇腭裂的发生率为3-22/10000，而我国的发生率约为1.82/1000。NSCLP的发病原因有很多，其中遗传和环境的影响占据了主要作用。研究发现许多信号通路参与了唇腭的发育，不同染色体区间在唇腭裂发病中具有一定作用。目前已知的NSCLP易感区有Iq32，2p，2q，3q27-28，4q，6p23-p25，8q24，9q21，12p11，14q21-24,16q24和19q13，可能的易感基因有IRF6、SATB2、TP63、FQXE1、PVRL1、MSX1、GABRB3，CRISPLD2，MAFB和ABCA4等。高分辨率熔解曲线(highresolutionmelting,HRM)的分析原理是在常规聚合酶链式反应(PCR)过程中饱和荧光染枓与双链DNA结合，当通过加热升温使DNA双链解离时，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，由于突变、SNP位点双链碱基间不匹配会使双链DNA在此位点首先解开，通过实时监测升温过程中的荧光强度，从荧光强度与时间轴曲线上便可判断是否存在突变或SNP，而且不同位点、杂合子与否、GC含量、扩增子长度等都会影响熔解曲线的峰形。所以，HRM分析能够有效区分不同突变位点、SNP位点和拥有不同GC含量的扩增片段。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种检测JAG2基因SNP位点rs741859基因型的试剂盒。本发明的第二个目的是为了提供一种上述试剂盒的制备方法。实现本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：一种检测JAG2基因SNP位点rs741859基因型的试剂盒，包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为包含JAG2rs741859(c*1053G>A)位点的野生型DNA序列和包含JAG2rs741859(c*1053G>A)位点的纯合突变型DNA序列；所述引物用于扩增标准品和待检测样品。优选地，所述野生型DNA序列为序列W；所述纯合突变型DNA序列为序列M。优选地，所述标准品为连接有序列W的质粒和连接有序列M的质粒。优选地，所述引物为JAG2-F和JAG2-R。优选地，所述含有荧光染料的qPCR扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司所产的含EvaGreen的Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒。本发明还提供所述的检测JAG2基因SNP位点rs741859基因型的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1)引物设计与合成根据JAG2rs741859基因序列，应用Primerexpress3软件、PrimerPremier5软件以及Oligo7软件，设计一组引物；2)制备标准品A、合成含有JAG2rs741859(c*1053G>A)位点的野生型DNA序列和纯合突变型DNA序列；B、将野生型DNA序列和纯合突变型DNA序列分别与质粒连接；将连接后的质粒导入细菌中；培养细菌并且获得阳性克隆；C、扩大培养步骤B所获得的阳性克隆，提取质粒得到标准品；3)选购或配制含有荧光染料的qPCR扩增试剂。优选地，步骤B中所述的质粒为pMD18-T质粒。优选地，所述野生型DNA序列为序列W；所述纯合突变型DNA序列为序列M。优选地，步骤B中将序列W或序列M分别与pMD18-T质粒连接，所采用的连接体系为：SolutionI为来自TaKaRa公司，编号D6020A的产品。连接的反应时间为10-16小时，反应温度为16℃。优选地，步骤C的具体操作为将阳性克隆接种于含有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm培养14-16h；再从菌体中提取质粒获得标准品。本发明所述序列W为：TATATTTGATTGAATAATGCCACCATTCCGGCCTCCCTTGTTCTTTCGGTGCTGTCCCTTTTGTATTGAGAGTGAGGTTGGGGGAGAGCCACGCCGGCAGAGAGGCTTGGGGCAGTGGGGCGCGTGCTGGGTATTGGCCCACGTGGCTGTGGTGGCTGTAGAGGGCGAGACGGTTCTGTTGAGTCGGGGCCTGCCAGGGCCTCGAATGCGTTGGCATGCCAAGGTGGTGG；其中标有下划线的碱基为基因突变位点；本发明所述序列M为：TATATTTGATTGAATAATGCCACCATTCCGGCCTCCCTTGTTCTTTCGGTGCTGTCCCTTTTGTATTGAGAGTGAGGTTGGGGGAGAGCCACGCCGGCAGAGAGGCTTGGGGCAGTGGGGCACGTGCTGGGTATTGGCCCACGTGGCTGTGGTGGCTGTAGAGGGCGAGACGGTTCTGTTGAGTCGGGGCCTGCCAGGGCCTCGAATGCGTTGGCATGCCAAGGTGGTGG；其中标有下划线的碱基为基因突变位点。本发明所述的JAG2-F和JAG2-R的序列具体为：JAG2-F：5'-CAGAGAGGCTTGGGGCAGT-3'JAG2-R：5'-AACAGAACCGTCTCGCCCTC-3'相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明制备了一种试剂盒，使HRM方法用于鉴定JAG2基因SNP位点rs741859基因型，该试剂盒具有灵敏度高、成本低、操作简单、鉴定速度快的优点。本发明还提供该试剂盒的制备方法，通过控制制备过程的参数使本发明的试剂盒灵敏度更高。附图说明图1、本发明试剂盒的灵敏度测试结果图图2、本发明对基因型的检测结果图图3、Sanger测序结果图具体实施方式下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：实施例1：一种检测JAG2基因SNP位点rs741859基因型的试剂盒，包括：标准品、引物、含有荧光染料的qPCR扩增试剂；所述标准品为连接有序列W的pMD18-T质粒和连接有序列M的pMD18-T质粒。所述引物为JAG2-F和JAG2-R。所述含有荧光染料的qPCR扩增试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司所产的含EvaGreen的Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒。实施例2重组野生型和纯合突变型质粒pMD18-T-rs741859的构建和转化1、合成序列W和序列M。2、连接反应：将上述合成的序列W和序列M分别与pMD18-T进行连接，采用如下连接体系进行配制：配制完成后置于16℃进行过夜连接反应，获的连接有序列W的质粒和连接有序列M的质粒。3、pMD18-T-rs741859质粒的转化以及PCR鉴定(1)从-80℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其解冻。(2)取连接产物(连接有序列W的质粒和连接有序列M的质粒)10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟。(3)42℃水浴热激90秒，热激后立即置冰上冷却2min。(4)于1.5mlEP管中加入预冷的1ml的不含抗性的LB液体培养基吹打混匀后，37℃120转轻摇培养90min。(5)将上述培养液短暂离心吸去900ul后取剩余的100ul涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜。(6)从平板上挑取单克隆菌落于500μLAmp抗性LB液体培养基的1.5mlEP管中，37℃220rpm振荡培养5-6小时。(7)取1μL作为模板进行菌液PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇获的阳性克隆。(8)用引物JAG2-F和JAG2-R扩增上述稀释菌液，PCR产物采用2％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物鉴定阳性转化子。引物序列为HRM分析所用引物，序列如下：JAG2-F：5'-CAGAGAGGCTTGGGGCAGT-3'JAG2-R：5'-AACAGAACCGTCTCGCCCTC-3'PCR体系如下：PCRbuffer为来自北京百泰克生物技术有限公司的PowerTaqDNA聚合酶，货号PR1001。扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、60℃30s、72℃30sec，35个循环；72℃10min。4、重组阴性和阳性质粒提取：采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。实施例3标准品的获取和定量(1)取实施例2得到的冻存的含有重组质粒的阳性克隆100ul接种于15ml氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃220rpm培养14-16h；(2)获的菌体，采用北京百泰克生物科技有限公司生产的质粒制备试剂盒提取重组质粒；(3)利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可见分光光度计(ND5000)对提取的质粒测定浓度，根据A260/A280判断质粒的纯度。实施例4HRM-PCR检测JAG2rs741859方法的建立和灵敏度检测一、待测样本的制备提取30例样本的血液基因组DNA，用作JAG2基因PCR扩增的模板。血液基因组DNA的提取步骤如下：(1)取1ml全血，加入3mlTE，颠倒混匀后静置10min，8000rpm离心5分钟，弃上清液；(2)重复上述步骤2-3次至沉淀为白色；(3)加入900ul10％SDS和10ul10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；(4)将离心管冷却至室温，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心10min；(5)小心吸取上清后再加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心10min；(6)取上清，加入两倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心10min，弃上清；(7)加500ul70％的乙醇洗涤沉淀，短暂离心后弃上清，开盖干燥至乙醇完全挥发；(8)加50ul双蒸水或TE溶解DNA，-20℃保存。二、特异性引物的设计与合成本发明通过对NCBI数据库中JAG2rs741859基因序列进行检索，选取适合设计引物的片段序列为靶目标，应用Primerexpress3软件、PrimerPremier5软件以及Oligo7软件，设计了一组HRM-PCR引物。该引物序列如下：JAG2-F：5'-CAGAGAGGCTTGGGGCAGT-3'JAG2-R：5'-AACAGAACCGTCTCGCCCTC-3'三、HRM-PCR反应体系和反应条件以DNA为模板，以上述引物JAG2-F和JAG2-R为扩增引物，采用如下述体系和反应条件进行PCR扩增。PCR体系：其中引物采用JAG2-F和JAG2-R，HRM-PCR采用生工生物(上海)Green-2-GoqPCRMastermix试剂盒。HRM分析仪为百源基因ASA-9600实时荧光定量PCR仪。PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20s。HRM分析：94℃90s60℃30sec83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。四、HRM灵敏度实验将重组阳性质粒和重组阴性质粒均稀释至50ng/μl，然后二者混合以重组阳性质粒占比例依次为50％、25％、12.5％、5％、2％和1％进行梯度稀释，按照上述HRM-PCR反应体系和程序进行扩增，分析突变检出范围，即灵敏度。反应体系如下：PCR扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性10s；60℃退火/延伸20sHRM分析：94℃90s60℃30sec83-94℃收集数据，温度上升速率为0.06℃/s。结果参照图1，实验数据显示，当阳性质粒与阴性质粒体积比分别为1:1、1:3、1:7、1:19、1:49和1:99时，能检测出阳性质粒，所以本专利所用HRM检测方法的灵敏度为1％。实施例5应用本发明的检测方法检测样本JAG2rs741859基因型用步骤2中的检测条件，对30例样本进行HRM分析，与重组阳性质粒和重组阴性质粒的熔解曲线对照比较，依此确定样本中的突变类型，并根据HRM分析结果针对每种基因型随机挑选1个样本在生工生物(上海)进行Sanger测序验证。HRM分析结果参见表1和图2，数据显示30例样本中JAG2基因SNP位点rs741859野生型有17例，G>A杂合突变型有8例，G>A纯合突变型5例。Sanger测序结果参见图3：其中a为样本编号7的测序结果，b为样本编号14的测序结果，c为样本编号28的测序结果；与本发明方法检测的结果完全一致。表1应用本发明的方法对样本的分析结果样本编号基因型样本编号基因型1纯合突变型16野生型2野生型17杂合突变型3野生型18野生型4野生型19纯合突变型5杂合突变型20野生型6杂合突变型21纯合突变型7野生型22野生型8野生型23杂合突变型9杂合突变型24野生型10纯合突变型25杂合突变型11野生型26野生型12野生型27野生型13野生型28纯合突变型14杂合突变型29杂合突变型15野生型30野生型对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。当前第1页1 2 3