本发明涉及转基因水稻多重数字PCR定量检测方法，属于转基因水稻的定量检测领域。
背景技术：
最新数据表明，2015年全球转基因作物种植面积达到1.81亿公顷，比1996年的170万公顷增长了100倍以上(James,Clive."20th Anniversary(1996 to 2015)of the global commercialization of biotech crops and biotech crop highlights in 2015."ISAAA Brief 51(2015).)。以基因工程为核心的现代生物技术已广泛渗入到农业的各个领域，逐步改变了传统农业的研究和生产模式。转基因作物已被快速、持续地用于商业化生产。无论在发达国家还是发展中国家，转基因作物都对环境、经济、能源、卫生及社会产生了巨大影响。由于转基因技术涉及到社会公共安全、安全管理和社会伦理等重要方面，因此转基因作物不仅是各国政府、科研人员和种植农民关注的焦点，也引起了全世界各行各业的广泛关注。为此，各国家和地区纷纷建立起转基因成分的标识制度，在全球各国家和地区制定的转基因成分标识制度中，定量标识制度占据较大比重，其中以欧盟和日韩最具代表性，如欧盟的定量阈值为0.9％(EURL-GMFF.Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories(ENGL),European Commission,(2003a)Commission Regulation(EC)No.1829/2003 of September 22,2003,Concerning on genetically modified food and feed.Off.J.Eur.Commun L268:1–23；European Commission,(2003b)Commission Regulation(EC)No.1830/2003 of September 22,2003,Concerning the traceability and labelling of genetically modified organisms and the traceability of food and feed products produced from genetically modified organisms and amending Directive 2001/18/EC.Off.J.Eur.Commun L268:24–28.)；日本和韩国分别为：5％和3％(Matsuoka T(2001)GMO labeling and detection methods in Japan.APEC-JIRCAS Joint Symposium and Workshop on Agricultural Biotechnology；Ministry of Agriculture and Forestry(2000)Guidelines for Labeling of Genetically Modified Agricultural Products.MAF Notification No.31.)。中国在转基因成分标识方面主要采取定性标识制度，由于定性标识制度与定量标识制度在检测技术等方面存在不同，使中国在作物进出口方面容易受到国际标准的制约，因此需要大力发展转基因成分定量检测技术并建立相关的定量标识制度。
数字PCR(Digital PCR)的概念于1992年提出(Sykes,P.J.,et al."Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution."BioTechniques13.3(1992):444-9.)，其基本原理是通过将微量样品进行大倍的稀释和分液，直至每个扩增区域含有目标扩增分子为0、1或1个以上，再进行PCR扩增，根据扩增信号的有无，利用泊松分布(Poisson distribution)(Pinheiro,Leonardo B.,et al."Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification."Analytical chemistry 84.2(2011):1003-1011.)计算出样本的最初拷贝数或浓度。数字PCR不依赖扩增效率以及基于标准曲线的定量，而且对一些PCR抑制因子的耐受性更高。该技术在基因拷贝数分析、基因表达分析、基因分型等方面都取得了突破性的发展。在转基因检测方面，也有相应的研究报道(Demeke,Tigst,et al."Assessment of droplet digital PCR for absolute quantification of genetically engineered OXY235 canola and DP305423 soybean samples."Food Control 46(2014):470-474；Morisset,Dany,et al."Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR."PLoS One 8.5(2013):e62583.)，表明数字PCR在转基因检测方面的可行性与可靠性。然而目前这些研究多基于2重数字PCR检测，一次只能对一个转基因作物的一个转化事件进行定量分析，而目前定量标识的要求是针对单一成分而不是单一转化事件的定量，如欧盟对定量标识的定义为：食品中含有转基因生物产生的材料，其比例不得高于单一成分的食品成分的0.9％。因此，目前的数字PCR检测方法不适合对样品中单一成分的多种转化事件的同时定量检测。目前，中国研发的转基因水稻主要有KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1、G6H1这7个品系，因此开发一种同时检测这7种转基因水稻含量多重数字PCR定量检测方法，对于水稻转基因成分的定量检测将具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于检测7种转基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重数字PCR定量检测引物对和探针；
本发明所要解决的第二个技术问题是建立一种转基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重数字PCR定量检测方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了用于检测转基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重数字PCR定量检测引物对和探针，其中包括：
由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游引物和SEQ ID No.2所示下游引物组成的转基因水稻KF2转化体特异性引物对；转基因水稻KF2转化体特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；
由核苷酸序列为SEQ ID No.4所示上游引物和SEQ ID No.5所示下游引物组成的转基因水稻KF6转化体特异性引物对；转基因水稻KF6转化体特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID No.6所示；
由核苷酸序列为SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物组成的转基因水稻KF8转化体特异性引物对；转基因水稻KF8转化体特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示；
由核苷酸序列为SEQ ID No.10所示上游引物和SEQ ID No.11所示下游引物组成的转基因水稻KMD1转化体特异性引物对；转基因水稻KMD1转化体特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID No.12所示；
由核苷酸序列为SEQ ID No.13所示上游引物和SEQ ID No.14所示下游引物组成的转基因水稻M12转化体特异性引物对；转基因水稻M12转化体特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID No.15所示；
由核苷酸序列为SEQ ID No.16所示上游引物和SEQ ID No.17所示下游引物组成的转基因水稻TT51-1转化体特异性引物对；转基因水稻TT51-1转化体特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID No.18所示；以及，
由核苷酸序列为SEQ ID No.19所示上游引物和SEQ ID No.20所示下游引物组成的转基因水稻G6H1转化体特异性引物对；转基因水稻G6H1转化体特异性探针的核苷酸序列为SEQ ID No.21所示。
本发明所述的多重数字PCR定量检测引物对和探针能够应用于检测转基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1中的任意一种或多种。
本发明进一步公开了一种转基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重数字PCR定量检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检测水稻样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以本发明所述的多重数字PCR定量检测引物对和探针，以及水稻内参基因检测引物对和探针建立数字PCR体系并进行PCR扩增；(3)对扩增结果进行数据分析，计算外源基因拷贝数与内参基因拷贝数之比，获得转基因成分的定量值；即，利用QuantaSoft分析各反应孔中外源基因和内参基因的荧光信号值，通过泊松分布公式计算出各反应中外源基因与内参基因的拷贝数，外源基因拷贝数记为：Ne，内参基因拷贝数记为：Ni，通过两者的拷贝数之比得到转基因成分的定量值，即：转基因成分含量＝Ne/Ni×100％。
本发明多重数字PCR定量检测方法中，所述数字PCR体系为：反应体系的总体积为20μL，其中，2xddPCR Supermix for probe 10μL，7种转基因水稻的特异性检测引物对和探针以及水稻内参基因检测引物对和探针组成的引物与探针的混合物6μL，DNA模板4μL。其中，所述引物与探针的混合物中，水稻内参基因检测引物对的上、下游引物浓度分别为3000nmol/L，水稻内参基因探针的浓度为600nmol/L；7种转基因水稻的特异性检测引物对的各上、下游引物浓度分别为1500nmol/L；7种转基因水稻的特异性探针的浓度分别为300nmol/L。所述PCR扩增的程序包括：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火及延伸60sec，共40个循环；98℃10min，4℃保存。
本发明多重数字PCR定量检测方法，选用水稻蔗糖磷酸酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)基因作为水稻内参基因，所述水稻内参基因检测引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.22所示上游引物和SEQ ID No.23所示下游引物组成；所述水稻内参基因探针的核苷酸序列为SEQ ID No.24所示，探针的5’端标记荧光基团HEX，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。本发明7种转基因水稻的特异性探针的5’端分别标记荧光基团FAM，3’端分别标记荧光淬灭基团BHQ1。
本发明方法可以根据实际需要增减相应转基因水稻事件，灵活性强，同时操作简便，是一种转基因成分定量检测的有效方法。
本发明还公开了一种转基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重数字PCR定量检测试剂盒，包括：2xddPCR Supermix for probe、水稻内参基因检测引物对和探针、转基因水稻的多重数字PCR定量检测引物对和探针；其中，所述转基因水稻的多重数字PCR定量检测引物对和探针为本发明所述的多重数字PCR定量检测引物对和探针，所述探针的5’端分别标记荧光基团FAM，3’端分别标记荧光淬灭基团BHQ1；所述水稻内参基因检测引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.22所示上游引物和SEQ ID No.23所示下游引物组成；所述水稻内参基因探针的核苷酸序列为SEQ ID No.24所示，探针的5’端标记荧光基团HEX，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。
本发明分别利用其它转基因作物及非转基因作物验证所建立的多重数字PCR方法的特异性，结果表明所有其它转基因作物及非转基因作物的假阳性率都低于5％，表明本发明建立的多重数字PCR方法的特异性较好，满足对转基因水稻的定量检测需要。
定量限和检测限的确定结果表明，转基因水稻含量在5％-0.05％之间时，多重数字PCR定量的值与理论值之间的RSD都小于25％，满足定量检测的要求(EURL-GMFF)，同时也表明本发明建立的多重数字PCR的重复性和稳定性较好。当转基因含量为0.01％时，多重数字PCR定量的值与理论值之间的RSD为39.25％。因此，根据以上数据确定本发明方法的定量限为0.05％，检测限为0.01％，满足转基因成分实际检测的需要。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明建立了一种针对7种转基因水稻(KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1、G6H1)的多重数字PCR定量检测方法，实现对同时含有以上7种或其中几种转基因水稻的样品进行定量检测，省去了对单一转基因水稻成分的分别定量检测，同时也省去了常规PCR方法定量检测中标准曲线绘制等步骤。另外，转基因成分是通过外源基因拷贝数与内参基因拷贝数的比例计算而得到的，在本发明方法中7个外源基因与1个内参基因扩增在同一个反应体系中，从而提高了对转基因成分定量检测的稳定性。
附图说明
图1为多重数字PCR扩增结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1转基因水稻多重数字PCR定量检测方法的建立
1、材料与方法
1.1实验材料
实验所用转基因材料分别为：KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1、G6H1(转基因水稻)；GTS40-3-2(转基因大豆)；MON15985(转基因棉花)；Oxy235(转基因油菜)；MON863、MON89034(转基因玉米)。非转基因水稻、大豆、玉米、棉花、油菜DNA作为阴性质控。
1.2 DNA提取
称取200mg粉状样品按照试剂盒(DNeasy Plant Mini Kit,Qiagen,Hilden,Germany)说明提取DNA。在分光光度计260-280nm处测定所获DNA质量和纯度，并用琼脂糖凝胶电泳确定其完整性。将提取的7种转基因水稻DNA等体积混合，再用非转基因水稻基因组DNA将其稀释到以下相应的浓度：5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％。
1.3引物与探针及其配制
选用水稻蔗糖磷酸酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)基因作为水稻内参基因，其探针5’端标记荧光基团HEX，3’端标记BHQ1，7种转基因水稻的转化事件的特异性序列的探针5’端都标记荧光基团FAM，3’端标记BHQ1，将8组引物探针混合在一起，相应的引物名称序列及各引物探针在混合物中的浓度见表1。
表1多重数字PCR引物与探针信息
1.4数字PCR扩增与数据分析
数字PCR体系：10μL 2xddPCR Supermix for probe，6μL引物与探针的混合物，4μL DNA模板或ddH2O，总体积为20μL。
将样品(20μL)反应体系用实验室通用移液器加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔，在DG8 cartridge最底一排8个孔中各加入70μL微滴发生油，仪器自动完成微滴生成。将生成的微滴转移到96孔板中，封上热封膜，放置常规PCR仪中进行PCR。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火及延伸60sec，共40个循环；98℃10min，4℃保存。将完成PCR的96孔板放入微滴读取仪中，仪器自动完成每一个样本的微滴读取，要求每孔微滴生成数大于8000个才纳入统计分析，含有扩增信号的阳性微滴与未扩增的阴性微滴用荧光阈值来区分，利用QuantaSoft分析各反应孔中外源基因和内参基因的荧光信号值，通过泊松分布公式计算出各反应中外源基因与内参基因的拷贝数(见图1)，外源基因拷贝数记为：Ne，内参基因拷贝数记为：Ni，通过两者的拷贝数之比得到转基因成分的定量值，即：转基因成分含量＝Ne/Ni×100％。
2、结果与分析
2.1特异性验证
数字PCR的特异性一般用假阳性率(false positive rate)来评价，目前认为假阳性率低于5％则表明建立的数字PCR的特异性较好，满足检测的需要(Holst-Jensen,A.；Crespo,T.；Simplicio,A.；Richl,P.；Welsche,M.；Dobnik,D.；Dreo,T.Deliverable 6.1 MPP Decathlon,http://www.decathlon-project.eu/sites/default/files/Deliverable6.1_MPP_Decathlon.pdf.)。在本发明方法中，分别利用其它转基因作物及非转基因作物验证建立的多重数字PCR的特异性，验证结果见表2。结果表明，所有其它转基因作物及非转基因作物的假阳性率都低于5％，表明本发明建立的多重数字PCR方法的特异性较好，满足对转基因水稻的定量检测需要。
表2多重数字PCR假阳性率检测
2.2多重数字PCR的定量限和检测限的确定
为了确定建立的多重数字PCR的定量限和检测限，分别测定转基因含量为5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％样本的含量，分析定量结果与理论值之间的差异，每个样品重复4次，每次设置4个平行，共16个反应。
结果见表3，转基因水稻含量在5％-0.05％之间时，多重数字PCR定量的值与理论值之间的RSD都小于25％，满足定量检测的要求(EURL-GMFF)，同时也表明建立的多重数字PCR的重复性和稳定性较好。当转基因含量为0.01％时，多重数字PCR定量的值与理论值之间的RSD为39.25％。因此根据以上数据，将本发明方法的定量限定为0.05％，检测限为0.01％。
表3多重数字PCR检测限与定量限确定
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省农业科学院
<120> 转基因水稻多重数字PCR定量检测方法
<130> ZJ-2001-170102A
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