本发明涉及基因工程及分子药理学技术领域，具体涉及一种能够筛选以hrh1为靶点的药物的细胞模型。
背景技术：
人的组胺受体h1(hrh1)的基因位于3号染色体p25上，编码487个氨基酸，该受体是g蛋白偶联受体a家族成员，也称视紫红质样受体，主要分布在平滑肌、血管内皮细胞、心脏和中枢神经系统中。hrh1受体是一种跨膜受体，主要偶联gaq/11蛋白，激活磷脂酶c和pip2信号通路，引起胞内钙离子释放，进而参与一系列的生理过程。该受体可以被生物胺组胺激活，诱发炎症和过敏反应。抗组胺药可以作用于该受体，进而抵抗过敏和炎症反应。除此之外，研究发现，人的hrh1基因在许多组织和器官中都有表达，而该基因主要在骨髓，全血，淋巴结，胸腺，脑，肝脏，肺等组织和器官中表达。近些年的研究也发现hrh1受体与人的癌症有着密切的关系。目前已发现血癌，脑癌，乳腺癌，结肠癌等常见癌症都与hrh1受体有着千丝万缕的联系。hrh1的表达和预后在不同类型的癌症中变化很大，甚至在来源不同数据库的同一类型的癌症中也有着很大的差异。这也暗示，在这些肿瘤中hrh1的功能可能是多维的。
hrh1受体在这些常见癌症中到底扮演何种角色，以hrh1为靶点开发出的一些药物是否具有抗肿瘤的效应，这些都需要我们所建立的高通量的药物筛选模型。目前以hrh1为靶点的药物种类繁多，因适应症不尽相同，选用抗过敏药时，大多是抗组胺药优先，但是长期、大剂量服用某一种抗过敏药，不仅会使药物失效，还会出现不良反应，甚至导致死亡。所以建立这样一种药物筛选模型，不仅为hrh1的基础研究提供一种更为便捷的途径，更为重要的是提供了一种更为高效、便捷的药物筛选方式，丰富抗炎症和过敏反应药物市场，为人们提供更多选择。
基于细胞信号通路的高通量药物筛选(highthroughputscreening,hts)是利用细胞信号系统作为应答元件，通过高灵敏度的数据采集系统和技术手段检测作为药物靶点的受体及各种蛋白所介导的细胞内信号事件，从而观测化合物是否能作用于药物靶点，进而找到具有靶点选择性的先导化合物。而分子与细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制明确等特点，已经成为目前寻找和发现新药物的主要药物筛选方法(fonnumf.arapidradiochemicalmethodforthedeterminationofcholineacetyltransferase[j].jneurochem,1975,24(2):407-409.)。将药物靶点导入工具细胞，并构建稳定的重组高表达目标药物靶点的细胞筛选模型，是实现高通量药物筛选的关键环节。药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，是寻找和发现新药物的重要条件之一。
目前，基于gpcr下游信号转导的高通量药物筛选方法学相对比较成熟，多家公司可提供高通量检测仪器及方案。药物筛选模型的发现和构建则成为制约和推动该领域发展的重要因素，尤其是基于受体分子机制的模型构建更是成为发现新型先导化合物的核心技术和难点。现有技术中还没有能够高通量筛选抗过敏和炎症反应以及抗肿瘤药物的细胞模型。
技术实现要素：
本发明的任务是提供一种细胞模型及其构建方法和在筛选以hrh1为靶点的药物中应用。
实现本发明的技术方案是：
本发明提供的细胞模型，是携带并能表达hrh1基因的哺乳动物细胞，即该细胞模型是克隆了表达编码人源hrh1基因序列的体外培养的哺乳动物细胞，所述的哺乳动物细胞是cho细胞或hek293细胞，所述hrh1基因的核苷酸序列(geneid:3269)如序列表之序列1所示。本发明提供的细胞模型名称为中国仓鼠卵巢细胞cho-hrh1，于2016年9月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c2016176，保藏地址：武汉大学。
本发明提供的细胞模型的细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)将hrh1基因与表达载体连接，构建含有hrh1基因的重组质粒；
(2)将重组质粒转染哺乳动物细胞，培养成能稳定表达hrh1基因的细胞株，该细胞株即为所构建的细胞模型。
本发明提供的上述这种细胞模型的构建方法，还包括以下对细胞株进行综合评估的步骤(3)：在上述步骤(2)所得细胞株中加入hrh1激动剂或hrh1抑制剂，测定下游信号应答反应，根据应答反应结果评估该细胞株是否作为细胞模型。所述的测定下游信号应答反应包括检测hrh1与其配体结合程度、hrh1下游g蛋白与[35s]gtpγs结合程度、环腺苷酸积累量、三磷酸肌醇积累量和细胞内钙离子流变化量中的一种或几种。其中检测hrh1与其配体结合程度以及g蛋白与[35s]gtpγs结合程度可以采用放射性结合实验。
在上述构建方法步骤(1)中，所述的表达载体为pcdna5/frt。
在上述构建方法步骤(2)中，所述的哺乳动物细胞优选为cho细胞或hek293细胞，其它哺乳动物细胞也能够实现本发明，而以cho细胞或hek293细胞构建效果最佳。例如可以使用invitrogen商品化细胞系flp-incho细胞，flp-intm细胞系经设计可快速构建稳定表达细胞系，以能够采用flp-intm表达载体表达目的蛋白。这些细胞在转录活跃区上含有一个稳定整合的重组酶识别序列(frt)位点。flp-intm表达载体的定点整合可确保高表达量。用flp-intm表达载体和flp重组酶载体pog44共转染flp-intm细胞系，使得表达载体被定点整合在每个细胞的相同染色体位点上。
本发明提供的细胞模型可用于筛选以hrh1为靶点的药物，所述的以hrh1为靶点的药物可以是hrh1激动剂或hrh1抑制剂等。所述的以hrh1为靶点的药物包括抗过敏药物、抗炎症反应药物和抗肿瘤药物。本发明细胞模型所稳定表达的gpcr-hrh1受体与过敏反应和炎症反应以及癌症息息相关，不仅可以建立起一个基础研究的模型，为研究hrh1受体提供了一种更为方便快捷的途径，同时还能够能够灵敏、特效地筛选以hrh1为靶点的药物，所述抗过敏和炎症反应以及抗肿瘤药物可以是hrh1激动剂、hrh1抑制剂、hrh1正向变构剂、hrh1反向变构剂或hrh1沉默变构剂。
上述细胞模型的构建方法，更优选地：步骤(1)还包括对构建的重组质粒进行测序鉴定；步骤(2)所述的重组质粒转染哺乳动物细胞是将重组质粒与表达重组酶的质粒pog44共导入哺乳动物细胞中，再利用潮霉素(hygromycinb)进行筛选，获得带有潮霉素抗性的单克隆细胞，继续培养后利用westernblot、测细胞中的camp或ca2+流等方法检测能够表达hrh1的阳性克隆，培养成能稳定表达hrh1基因的细胞株。
本发明公开了一种细胞模型及其构建方法和在筛选抗过敏和炎症药物以及抗肿瘤药物中的应用，属于基因工程及分子药理学技术领域。本发明的细胞模型是携带并能表达hrh1基因的哺乳动物细胞。该细胞模型的构建方法是将hrh1基因与表达载体连接构建成重组质粒后导入哺乳动物细胞，经过筛选培养获得能稳定表达hrh1基因的细胞株。该细胞模型可用于筛选抗过敏和炎症药物以及抗肿瘤药物，通过将待筛选物质加入到细胞模型培养基中，测定应答元件的产量或被激活程度来判断该物质是否被筛出。本发明的细胞模型能够高通量、低成本且准确地筛选抗过敏和炎症药物以及抗肿瘤药物，筛选方法步骤简单可控，成本低廉，通量高，具有很好的稳定性和可靠性。本发明提供的细胞模型通过检测细胞信号分子所产生的应答信号直接监测hrh1的活性，能够高通量、低成本、准确地筛选以hrh1为靶点的药物，根据受体hrh1所参与的生理过程，这些药物很有可能具有抗过敏、炎症以及抗肿瘤效应，具有特别现实的意义。本发明细胞模型的制备方法简单可控，成本低廉，准确性高，可实现高通量的筛选，具有很好的稳定性和可靠性。
附图说明
图1为本发明细胞模型的工作原理图。
图2为对阳性克隆的westernblot鉴定结果图，其中，cho表示cho空细胞，cho-hrh1c4、c5、c8、c10分别表示不同编号的cho-hrh1细胞克隆，hrh1基因构建在载体pcdna5/frt上，并携带有ha标签，所以检测时用ha-hrp抗体作为一抗孵育，用相对应的发光底物进行显影。
图3为histamine对cho-hrh1细胞内钙流影响实验结果。a为不同浓度histamine对细胞内钙流的影响，b为不同浓度histamine对细胞活力的影响，纵坐标为光度吸收值(在波长为560nm处的吸光值)，横坐标为histamine的浓度。
图4为cho空细胞以及cho-hrh1细胞系中histamine、x对细胞内钙流的影响。a为不同浓度激动剂histamine对cho空细胞(chomock)和cho-hrh1细胞系(cho-hrh1-clone5)胞内钙流的影响，b为不同浓度拮抗剂对cho-hrh1细胞系(cho-hrh1-clone5)胞内钙流的影响。
图5为细胞不同传代数对应答元件检测的影响，a为第7代，b为第23代，纵坐标为cho-hrh1细胞内钙释放量，横坐标为histamine浓度。
图6为基于该细胞模型的药物筛选方法的评估结果，纵坐标为细胞内钙释放量，横坐标为样品数。histamine+表示加入histamine药物处理的实验组，histamine-表示未加药物处理的对照组。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例中用到的材料和试剂如下：
flp-incho细胞(一种中国仓鼠卵巢细胞，以下实施例中简称cho细胞)、表达载体pcdna5/frt和转染试剂lipofectin2000为invitrogen公司的商业化产品；f12培养基和胎牛血清购自gibco公司；其它试剂均为进口和国产分析纯试剂；histamine购自sigma公司，terfenadine购自tocris公司。
实施例1细胞模型的构建
以中国仓鼠卵巢细胞(cho)为受体细胞，进行细胞模型的建立。将cho细胞培养在含10％胎牛血清的f12培养基培养，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
(1)重组质粒构建
使用人源hrh1cdna(geneid:3269)序列进行扩增，得到目的基因，将扩增的hrh1基因和pcdna5/frt表达载体由连接酶催化连接，转化大肠杆菌；扩增，提取质粒dna，抽提测序以鉴定阳性克隆，鉴定正确的阳性克隆即为重组质粒，命名为pcdna5/frt-ha-hrh1。
(2)重组质粒转染cho细胞
dna和脂质体(lipofectin2000)混合物的配制(60mm培养皿)
a溶液：
重组质粒pcdna5/frt-ha-hrh10.8μg
表达重组酶(flp)的质粒pog447.2μg
培养基optimem500μl
a溶液混合，室温放置5min；
b溶液：
脂质体lipofectamine200020μl
培养基optimem500μl
b溶液混合，室温放置5min；
将a液与b液混合，室温放置20min，然后将混合液加入到cho细胞中。在37℃、5％co2的二氧化碳培养箱内培养6h后，换为含血清含抗生素培养基。
(3)阳性克隆筛选
转染24h后的cho细胞按1：10的密度传代再培养24h，以含500μg/mlhygromycin(潮霉素)的f12选择性培养基进行选择性筛选培养，每3天用选择性培养基换液一次，持续2周可见阳性克隆出现。采用极端稀释法将阳性克隆挑出，接种至96孔板再用含250μg/mlhygromycin的f12选择培养液扩增传代，得到稳定转染的阳性克隆细胞模型。
(4)阳性克隆鉴定
步骤(3)获得的细胞模型用westernblot进行鉴定，以获得克隆中hrh1表达情况，cho空细胞作为对照。利用抗体，我们发现挑选的4、5、8、10号克隆都有ha表达(cho-hrh1细胞系的c4、c5、c8、c10)，而空细胞带ha标签的hrh1却没有表达(图2)。我们选择5克隆做后续实验，即本专利申请中的实施例2和实施例3的实验。5号克隆命名为中国仓鼠卵巢细胞cho-hrh1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c2016176。
实施例2本发明细胞模型用于药物筛选的特异性
hrh1受体为偶联gq的g蛋白偶联受体，受体激活可以引起磷脂酶c和pip信号通路，进而导致保内钙离子信号的变化，因而可以通过检测ca2+释放确定hrh1激活情况，本实施例中为了鉴定细胞系可以稳定表达功能性的hrh1，均采用检测ca2+释放的方法。
为检测该细胞模型用于药物筛选的特异性，确保应答元件的响应是由hrh1的活性变化所调控。选用hrh1的激动剂histamine，hrh1的特异性拮抗剂ten，分别以不同的浓度处理细胞模型并通过检测应答分子的响应确定其诱导激活率
(1)histamine对细胞内ca2+释放的量效关系
将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上1μmfluo-4am(钙荧光探针)孵育1h。然后分别加入10-15，10-14，10-13，10-12，10-11，10-10，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4m的histamine进行刺激，每组设3个重复。用flexstation3多功能酶标仪工作站测定各组诱导的ca2+释放。
试验结果参见图3a，histamine作为hrh1激动剂，对hrh1的激活效果明显。在本实验中，histamnie对细胞内ca2+的诱导释放率与histamine浓度呈剂量依赖关系。
②将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上新鲜的无血清培养液培养24h，分别加入浓度为10-10，10-9，10-8，3×10-8，10-7，10-6，3×10-6，10-5m的histamine进行处理，每组设3个重复。处理24h用mtt检测细胞活力。
试验结果参见图3b，由试验结果可见：当histamine浓度在10-10至10-5m上时，细胞活力随terfendine浓度增加无显著降低。这说明ten对histamine诱导的内ca2+释放的抑制与细胞增殖的活力无关。
(2)拮抗剂terfendine对诱导胞内钙释放的影响
将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上1μmfluo-4am孵育1h。使用10-19，10-18，10-17，10-16，10-15，10-14，10-13，10-12，10-11，10-10，10-9，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4m拮抗剂terfendine预孵育30min，加入10-4m的histamine混合液进行刺激，每组设3个重复。用flexstation3多功能酶标仪工作站测定诱导的ca2+释放。
实验结果见图4a，terfendine作为hrh1特异性拮抗剂，能够有效抑制histamine对hrh1的激活。在本实验中，10-5mterfendine对浓度为10-5m的histamine诱导的细胞系内钙释放均能抑制，使内钙释放程度接近于本底。
(3)细胞稳定性检测
随着细胞传代次数的增加，外源目的基因的表达可能丢失，因此，目的基因是否能在宿主细胞中稳定表达，即传代稳定性是检测细胞系优劣的重要指标。为此我们在cho-hrh1细胞传到第5代和第18代时进行检测。将细胞接种于96孔板中过夜，待细胞完全贴壁后，换上新鲜的无血清培养液继续培养24h，分别加入不同浓度的histammine进行刺激，每组设3个重复。用flexstation3多功能酶标仪工作站测定诱导的ca2+释放。
实验结果参见图5，由实验结果可见：histamine可以明显激活hrh1诱导的ca2+释放。说明该细胞模型具有良好的传代稳定性。
实施例3基于本发明细胞模型的药物筛选方法的评估
建立筛选模型的目的是筛选活性物质，反映该物质所具有的生物活性，因此，对筛选模型能否准确地反映受试物的生物活性，必须进行客观地评价。评价一个筛选模型的优劣有很多指标，如模型的稳定性、灵敏性、特异性等。除此之外，为了使模型能够达到筛选的要求，还需要对筛选模型进行定量评价，主要分析该模型能否有效地反映样品的活性。评价药物筛选模型的常用的定量技术参数，主要如下：
(1)信号本底比(signaltobackground,s/b)
信号本底比反映的是药物筛选模型获得的数据(msignal)与本底数据
(mbackground)之间的距离。一般来讲，这种比值越大，信号与本底的距离越大，在反映样品作用方面有越大的范围，易于反映样品作用。
一般情况下，信号本底比的数值应大于3，当值小于3时，就不能有效地反映样品的生物活性。
信号本底比的计算公式如下：
s/b＝msignal/mbackground
(2)信噪比(siganltonoise,s/n)
信噪比是仪器分析中常用的方法评价参数，噪音通常是指在同样测定条件下，本底所产生的记录信号。通常情况下，信噪比要大于10才能认为是可以应用的方法。信噪比的计算公式如下：
s/n＝(msignal-mbackground)/sdbackground
其中sdbackground表示本底数据标准差。
(3)z‵因子
z‵因子综合考虑了信号的变化和波动范围，它只与实验的重现性与可靠性有关而与实验的内容无关，因而在评价高通量药物筛选模型的稳定性和可靠性中得到广泛的应用，z‵因子是没有单位的统计学参数，其值在0～1之间，z‵因子<0.5表示稳定性差，实验的可靠性低，这样的模型不能用于药物筛选，z‵因子在0.5～1时，模型稳定性高，可以充分确保建立的模型用于药物的筛选。z‵因子的计算公式如下：
msignal表示筛选模型获得的数据、mbackground表示本底数据、sdbackground表示本底数据标准差、sdsignal筛选模型获得的数据标准差。
为了评估本筛选方法是否稳定地适用于高通量筛选，在经优化所得到的筛选条件下随机选取96孔板中的60个孔，30个孔为一组，以浓度为10-4m的histamine为阳性对照，不加histamine的作为阴性对照，根据公式分别计算s/b，s/n和z‵因子，以对方法进行定量评估。
采用的三个评价指标计算结果是s/b＝9.65，s/n＝28.65，z‵＝0.525，说明本方法具有很好的稳定性和可靠性(图6)。本发明的高效表达细胞模型可同时稳定表达histamine受体，以便于检测hrh1在受到正向刺激引起的信号分子应答反应。
由上实例可见：本发明细胞模型能够高通量地准确筛选抗神经性疾病药物，其制备方法简单科控，成本低廉：本发明药物筛选方法步骤简单，成本低廉，准确性高，具有很好的稳定性和可靠性，可实现高通量的筛选，为抗神经性疾病药物的筛选提供了新的选择。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。
以下序列表之序列1是hrh1基因的核苷酸序列。
sequencelisting
<110>华中科技大学鄂州工业技术研究院
<120>一种细胞模型及其构建方法和筛选hrh1靶点药物之应用
<130>2017
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>4578
<212>dna
<213>人类
<400>1
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