本发明涉及到肿瘤靶点myc的研究。
背景技术：
myc基因包括c-myc、n-myc和l-myc，分别位于8号染色体、2号染色体和1号染色体。myc基因属于编码核蛋白的癌蛋白。c-myc的扩增与肿瘤发生、转归和凋亡密切相关，n-myc的扩增对肿瘤预后判断有意义，l-myc扩增与肿瘤的易患性和预后在不同的肿瘤中表现不一样，难以治疗的癌症中有40%发生了myc基因突变。c-myc的过度表达见于很多种肿瘤，比如肺癌、乳腺癌、宫颈癌等。c-myc作为一个转录因子，调控着细胞内15%的基因表达，参与到细胞很多生命过程中。例如，有研究报道，myc基因改变了细胞线粒体的代谢，使得肿瘤细胞能依赖于谷氨酰胺生存，蛋白puma、noxa和trb3在肿瘤细胞依赖谷氨酰胺生存中发挥关键作用，而这三种蛋白都是myc的下游调控蛋白。剥夺谷氨酰胺后，myc基因突变的细胞通过一系列复杂的分子开关出现程序性死亡，puma、noxa和trb3三种蛋白和dna结合蛋白atf4在执行程序性死亡起重要作用。而atf4的强效激动剂或谷氨酰胺代谢抑制剂都能导致细胞死亡，一直转基因小鼠肿瘤生长，目前已经通过fda批准在进行临床试验。
所以研究myc基因，能够帮助我们更好的理解部分肿瘤的发生发展过程，也为我们预防、治疗肿瘤提供了一些思路和途径。然而myc作为转录因子，调控着下游很多基因表达，而myc本身也受很多调节蛋白的调控，比如β-catenin等。因此，myc处于一个复杂的调控网络中，我们建立的这个细胞系能稳定表达c-myc-er融合蛋白，当加入4-oht刺激该细胞时，c-myc-er就会从细胞胞浆转入核内，呈激活状态，定位到染色体上，发挥转录因子作用，调控下游基因的转录。
技术实现要素：
本发明构建了能稳定表达c-myc-er融合蛋白的u2os细胞株。c-myc作为一个癌基因，同时又是一个转录因子，能够调控细胞内15%的基因转录，参与到细胞内的很多生命活动中，比如细胞增殖、凋亡、等过程，也涉及到肿瘤的发生和进展等病理过程。该细胞可以通过加入4-oht，激活c-myc发挥转录因子活性。从而为开发c-myc相关的抗癌靶点提供一个方便稳定的平台。
附图说明
图1是构建c-myc-er融合蛋白表达质粒所用的pbabepuro病毒载体图
图2是加入4-oht处理细胞后，c-myc蛋白从胞浆内转入核内的westernblot检测结果
图3是加入4-oht处理细胞后，c-myc被激活调控下游基因表达的q-pcr检测结果
具体实施方式
结合以下具体步骤和附图，对本发明作进一步的详细说明，以下实例仅是说明性的，本发明的保护内容不局限于此。
实验材料与方法
1.实验材料
pbabepuro病毒载体购于addgene公司，置于-20°c保存，见图1。
2.细胞培养
病毒包装细胞plat-e细胞（购于赛业生物科技有限公司），骨肉瘤u2os细胞（购于atcc），培养于dmem培养基中（含10%肽牛血清、100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素），将培养瓶放置于37°c、5%co2饱和湿度培养箱中培养，每1-2天更换培养基一次。当细胞生长到覆盖瓶底壁80%时，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞，传代后继续放置于培养箱中。
3.重组质粒构建
c-myc-er基因片段合成（生工生物工程（上海）有限公司），经pcr扩增后，用bamhi和ecori双酶切pcr产物和pbabe质粒，然后用t4连接酶连接片段和质粒，置于12°c过夜，第二天用感受态细菌e.colidh5α转化，涂抹于含青霉素（100ug/ml）的lb琼脂糖培养板，置于37°c培养箱培养12-14小时，挑取单克隆，用含青霉素的lb培养液中培养12-14小时，转速为280rpm，培养温度为37°c。用质粒小提试剂盒（购于天根生化科技（北京）有限公司）提取质粒后用bamhi和ecori酶切鉴定并送测序。
4.病毒感染和抗生素筛选
将病毒质粒用lipofectamine2000（invitrogen）转染plate细胞，转染4小时后换液，48小时后收集细胞上清液，过滤后加到u2os细胞上，继续置于细胞培养箱中培养48小时换液，并加入puromycin（thermofisherscientific）进行筛选，两周后将存活的细胞培养于96孔板，稀释至每孔约1个细胞，10天后挑出单克隆细胞，并进行下一步细胞鉴定。
5.细胞株检测
将所获得的细胞分别通过westernblot和q-pcr鉴定c-myc核转移以及下游基因转录情况，见图2和图3。图2中，用4-oht处理细胞，分别抽提细胞总蛋白、胞浆蛋白和核蛋白，用westernblot检测c-myc水平。发现4-oht处理后，c-myc被激活，向细胞核内转移。如图3所示，由于c-myc可能对自身转录还有正反馈作用，cyclind2、odc1和cycline1都能被c-myc上调，而c-myc会下调itgav、itga5、itgb3和itgb5的转录表达，所以我们通过q-pcr检测c-myc自身以及受c-myc所调控的下游基因的mrna水平，来确定c-myc被4-oht活化的情况。从结果中可以看到，c-myc上调c-myc、cyclind2、odc1和cycline1，而下调itgav、itga5、itgb3和itgb5基因转录，所以说该细胞株稳定表达的融合蛋白c-myc-er能够被4-oht激活发生核转移，并成功调解下游基因表达。