本发明属于医学和生物技术领域，具体地说，涉及一种慢病毒过表达载体介导的e6-ap促进结肠癌细胞生长和转移的实验方法。
背景技术：
人类乳头状瘤病毒相关蛋白(humanpapillomaviruse6-assiociatedprotein,e6ap)是细胞编码的一种相对分子质量为100×103的泛素蛋白连接酶。huibregtse等人认为，e6-ap调节高危型人类乳头状瘤病毒(hpv)16编码的原癌蛋白e6与p53的相互作用，导致宫颈癌的发生；研究发现，e6-ap是雄激素受体(ar)共调节因子，增强体内多种类固醇受体的转录活性，对前列腺癌、乳腺癌的发生和发展具有重要的生物学功能。同时e6-ap又是机体正常性腺发育和性成熟的关键蛋白，在体内多种器官中表达，如睾丸、前列腺、卵巢、子宫、乳腺、脑组织、胃等；目前，关于e6-ap在结肠癌恶性转化过程中的机制未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种慢病毒过表达载体介导的e6-ap促进结肠癌细胞生长和转移的实验方法，该方法运用westernblot方法检测不同结肠癌细胞株中e6-ap表达情况，筛选e6-ap低表达的结肠癌细胞，用慢病毒过表达载体特异性增强e6-ap低表达细胞中的e6ap蛋白表达，并且评估e6-ap表达上调对低表达结肠癌细胞生长、迁移和侵袭转移的影响，为结肠癌靶向治疗提供一个新的靶标。
其具体技术方案为：
一种慢病毒过表达载体介导的e6-ap促进结肠癌细胞生长和转移的实验方法，包括以下步骤：
步骤1、westernblot法检测e6ap在不同结肠癌细胞的表达水平：待lovo、ls174t、hct-116、ht-29、caco2、hct-8、sw480人结肠癌细胞长满后，去除培养皿中dmem培养基，用1×pbs洗1遍，用胰酶使贴壁细胞消化下来或者直接刮下，收集到ep管中，离心弃上清(3000rpm，5min)，在细胞沉淀中加入2～3倍细胞量的蛋白缓冲液(radioimmunoprecipitationassay,ripa)于冰上裂解30min，超声破碎后，离心吸取上清至ep管(4℃，12000rpm，10min)。马斯亮蓝染色法计算目的蛋白浓度，在目的蛋白中加入等量的2×sds蛋白上样缓冲液，充分混匀后，煮沸10～15min。取sds-page聚丙烯酰胺凝胶平行拔出梳子，固定在sds-page电泳槽中，加适量的电泳缓冲液(runningbuffer)。将变性好的目的蛋白离心(12000r/min2min)，取上清液上样至凝胶孔中，将电泳仪电压调至成低压状态(80v)，样品电泳通过积层胶，电压调至高电(120v)，继续电泳至分离胶。待sds-page电泳结束后，利用半干转膜仪电转，转膜仪电压调至15v，根据目的蛋白大小适当调节电转时间，使凝胶上目的蛋白转移至硝酸纤维素膜(nc)上。用1×tbst(封闭缓冲液)配制10％脱脂奶粉-tbst封闭液，将电转后的硝酸纤维素膜放入封闭液中封闭1h或4℃封闭过夜；随后，用10％脱脂奶粉-tbst封闭液按一定比例稀释小鼠抗人e6ap单克隆抗体、兔抗人gapdh抗体(1:1000)，室温摇床上轻摇孵育1～2h或4℃孵育过夜；用1×tbst洗膜，室温下摇床上轻摇5～7min，洗膜3次，洗净未结合的抗体。用10％脱脂奶粉-tbst封闭液按一定比例稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔igg(1:3000)，室温摇床上轻摇1～2h，tbst洗膜5min×3次，将western发光检测试剂盒中的两种液体按1:1混合，混合液均匀铺在nc膜上，显色5min，在暗室中压片，曝光时间5～15min(根据不同光强度而调整)，最后显影。鉴定出低表达的hct-116和hct-8结肠癌细胞用于后续实验；
步骤2、慢病毒过表达e6ap载体的包装：将贴壁的293ft细胞消化，接种于6孔板中，用含有10％胎牛血清的dmem培养基，常规培养，转染前观察细胞密度，待转染时293ft细胞贴壁密度达到60％～70％，包装前1h更换新鲜无双抗dmem。将megatyan1.0(8.4μl)慢病毒包装转染试剂与200μl无血清无双抗的新鲜dmem培养基混合，涡旋震荡10s，室温静置5min，期间再将pcdh-pcdna3.0-flag-e6-ap(1μg)与辅助质粒plp1(0.84μg)、plp2(0.4μg)、vsvg(0.56μg)加入到200μl无血清无双抗新鲜dmem培养基混合，涡旋震荡10s，室温静置5min，然后将上述两种溶液混合，涡旋震荡10s，室温放置15min，加入到含有10％胎牛血清的dmem培养基的293ft细胞中，转染48～72h后在生物安全柜中收取病毒上清，离心去除细胞碎片(4℃，3000r/min，10min)，0.22nm滤器过滤病毒上清，感染已接种的靶细胞，感染前细胞密度达到60％～80％；
步骤3、过表达e6ap的稳定结肠癌细胞株的获得：低表达e6ap的hct-116和hct-8细胞接种于6孔板中，用含有10％胎牛血清的dmem培养基常规培养，感染前观察细胞密度，细胞贴壁密度达70％～80％为宜。每个6孔板加入2ml含有过表达e6ap慢病毒和相应对照慢病毒上清培养基，6～8h小时后换新鲜dmem培养基，常规养培24h后，更换含2μg/ml嘌呤霉素(puromycin，puro)的dmem培养，3～4天后观察细胞死亡情况，待大部分细胞死亡后，感染病毒的单个细胞分裂繁殖并形成单个集落，将其消化、传代到6cm皿或10cm皿中，继续用含puro的培养基培养，直到获得稳定的混合克隆；
步骤4、rna提取及实时定量pcr：待6cm2培养皿中过表达e6ap的稳定表达hct-116和hct-8结肠癌细胞和相应对照的hct-116和hct-8结肠癌细胞长满后，去除培养皿中dmem培养基，用1×pbs洗1遍后吹去，加入500μltrizol，用枪轻轻吹打数次，混合均匀，吸入ep管中，室温静置裂解5min，按0.2ml氯仿/mltrizol加200μl氯仿，上下剧烈振荡15s，室温静置2～3min。离心取上层无色上清(4℃，12000r/min，15min)至另一新的ep管中，加入400μl异丙醇上下混匀，静置(-20℃,5～10min)，离心后弃上清(4℃，12000r/min，10min)，用1ml75％乙醇(depc水配制)洗一遍，温和振荡离心管，悬浮rna白色沉淀，离心弃上清(4℃，7500r/min，5min)。ep管口开向侧面，常温干燥。100μldepc水溶解rna白色沉淀，测a260/a280值定量rna浓度。取总rna2μg、六寡核苷酸苷酸oligo(dt)0.5μg、补h2o8.9μl至终体积20μl，混合均匀，70℃解链5分钟，迅速冰浴；加入5μl逆转录缓冲液m-mly、2.5μl10mmol/ldntp、0.6μlrna酶抑制剂rrnasin-inhibitor、1μl逆转录酶m-ml-rt至另一新的ep管中，将上述两混合物混匀，42℃逆转录60分钟，95℃5分钟逆转录酶失活，从而得到25μl的cdna第一链，用1/10te稀释1:20。取1μlcdna、10μl
表1引物及序列
步骤5、westernblot法验证过表达e6-ap的稳定细胞株中e6-ap表达效果及对p53、p27蛋白水平的影响，方法同(步骤1)；
步骤6、细胞生长曲线实验：取对数生长期过表达e6ap的稳定表达hct-116和hct-8结肠癌细胞和相应对照的hct-116和hct-8结肠癌细胞，无菌操作下用胰酶消化使贴壁细胞成单细胞悬液，将单细胞悬液梯度稀释，通过细胞计数板进行细胞计数，每孔2000～3000个细胞的密度，接种于96孔板中，每组设3个复孔，分别在24h、48h、72h、96h检测细胞增殖活性，加入cck-8(1/10溶于dmem中)后37℃，5％co2饱和湿度的培养箱孵育1h，用酶联免疫检测仪测定450nm波长下的吸光度a值，以培养时间为横轴坐标，a值平均值为纵轴坐标绘制细胞增殖曲线；
步骤7、划痕愈合(woundhealing)实验：将稳定表达对照组和过表达组的hct-116和hct-8细胞按60～70％密度接种于6孔板中，放置于37℃，5％co2饱和湿度的细胞培养箱中常规培养，直到形成细胞单层。待细胞密度汇合度接近95％，用200μl黄色枪头沿直线匀速划过细胞，pbs冲洗掉落的胞，更换5％的低浓度血清的dmem培养基。在倒置显微镜下观察，挑取宽度一致的划痕在显微镜下拍照并作标记，常规培养24h后，在原标记点拍照记录细胞迁移情况，并绘制半定量分析柱状图；
步骤:8、transwelltm实验取100μl液化的基质胶，铺于小室中，室温下静置15～30min，放入24孔板中，用无血清的dmem将细胞密度稀释成1～105个/ml。下室孔加入100ml含100％血清浓度的dmem，培养24h。将下层细胞固定，把小室移到另一个24孔板中，3％多聚甲醛固定细胞30min，用pbs洗1～2次，加500ml0.5％结晶紫ddh2o进行染色1h，pbs洗涤3遍，移入新的24孔板中，用棉棒擦除上室的基质胶及未迁移的细胞，显微镜下观察并进行拍照计数，并绘制半定量分析柱状图；
步骤9、统计学分析采用spss13.0统计学软件。用x±s表示e6-ap、p53、p27表达量及相关定量数据；t检验比较两样本组间均数的差异，p<0.05提示有统计学意义。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明运用westernblot方法检测不同结肠癌细胞株中e6-ap表达情况，筛选e6-ap低表达的结肠癌细胞，用慢病毒过表达载体特异性增强e6-ap低表达细胞中的e6ap蛋白表达，并且评估e6-ap表达上调对低表达结肠癌细胞生长、迁移和侵袭转移的影响，为结肠癌靶向治疗提供一个新的靶标。
本发明证实慢病毒介导的过表达e6-ap能有效地抑制p53、p27蛋白表达水平，从而抑制结肠癌细胞凋亡，增强结肠癌细胞生长、迁移和侵袭转移，据此推测e6-ap的生物学功能在结肠癌恶性转化过程中发挥重要作用。针对e6-ap为靶点的结肠癌基因诊断、治疗提供后续研究奠定基础。
附图说明
图1是westernblot检测不同结肠癌细胞株中e6-ap表达水平的代表性图像；
图2是过表达e6-ap对e6-ap表达效果及对p53、p27蛋白水平的影响，
图2a:qrt-pcr检查hct-116细胞溶解曲线和扩增曲线的代表性图像；图2b:qrt-pcr检测hct-8细胞溶解曲线和扩增曲线的代表性图像；图2c：qrt-pcr检查hct-116细胞e6-apmrna表达水平的代表性图像；图2d：qrt-pcr检查hct-8细胞e6-apmrna表达水平的代表性图像；图2e：westernblot方法检测hct-116细胞e6-ap蛋白表达水平的代表性图像；图2f：westernblot方法检测hct-8细胞e6-ap蛋白表达水平的代表性图像；其中，1：emptyvector；2：flag-e6ap；*p<0.05vs1.
图3是cck-8实验检测过表达e6-ap对hct-116和hct-8细胞生长的影响；
图3a:过表达e6-ap对hct-116细胞生长影响的代表性图像；图3b过表达e6-ap对hct-8细胞生长影响的代表性图像；其中，1：emptyvector；2：flag-e6ap；*p<0.05vs1.
图4是划痕试验检测过表达e6-ap对hct-116和hct-8细胞体外迁徙能力的影响；
图4a:过表达e6-ap对hct-116细胞体外迁徙能力影响的代表性图像，图像右边为hct-116细胞迁移能力的半定量分析；图4b：过表达e6-ap对hct-8细胞体外迁徙能力影响的代表性图像，图像右边为hct-8细胞迁移能力的半定量分析.其中图中相差显微镜，200×光镜放大倍数；其中，1：emptyvector；2：flag-e6ap；*p<0.05vs1.
图5是检测过表达e6-ap对hct-116和hct-8细胞体外侵袭能力的影响。
图5a:过表达e6-ap对hct-116细胞体外侵袭能力影响的代表性图像，图像右边为hct-116细胞侵袭能力的半定量分析；图5b：过表达e6-ap对hct-8细胞体外侵袭能力影响的代表性图像，图像右边为hct-8细胞侵袭能力的半定量分析；其中图中结晶紫染色，200×光镜放大倍数；.*p<0.05vs1。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1.e6ap在不同结肠癌细胞株中表达情况
westernblot检测不同结肠癌细胞株e6-ap的表达水平。结果显示(图1)：e6-ap在结肠癌细胞lovo、ls174t、hct-116、ht-29、caco2、hct-8、sw480中均有表达，hct-116和hct-8细胞中的e6-ap表达量较低。因此选择e6-ap低表达的结肠癌细胞hct-116和hct-8作为细胞模型，进行下一步过表达实验。
2.检测过表达e6-ap的稳定细胞株中e6-ap表达效果及对p53、p27蛋白水平的影响
采用qrt-pcr对e6-ap和β-actin的特异引物进行反应，分析e6-apmrna表达水平的改变，结果显示(图2a、图2b、图2c、图2d)：与稳定表达对照组相比，过表达e6-ap的hct-116和hct-8细胞中e6-apmrna水平表达显著增强(p<0.05)，此实验重复三次。提取细胞总蛋白进行western印迹检测，用gapdh作为内参，e6ap抗体反应，结果表明：与稳定表达对照组相比，过表达e6-ap增强e6-ap蛋白表达水平，抑制p53、p27蛋白表达(图2e、图2f)。
3.过表达e6-ap对结肠癌细胞恶性生物学行为的影响
3.1过表达e6-ap促进hct-116和hct-8细胞生长
通过cck-8实验，得到细胞生长曲线(图3a、图3b)培养12h时，过表达e6-ap组a值与稳定表达对照组之间无明显差异；在培养第24h、48h、72h、96h时过表达e6-ap组与稳定表达对照组相比差异具有显著性(p<0.05)，此实验重复三次。说明过表达e6-ap促进hct-116和hct-8细胞生长。
3.2过表达e6-ap可以增强hct-116和hct-8细胞体外迁移能力
将稳定表达对照组和过表达组细胞接种于6孔板。待细胞密度汇合度接近95％，用枪头沿直线匀速划过细胞，冲洗掉落的细胞，更换低浓度血清的dmem培养。显微镜下拍照并作标记，24h后，在原标记点拍照记录细胞迁移情况，实验重复三次。结果发现，与稳定表达对照组相比，过表达e6-ap的细胞划痕间隙明显变窄(p<0.05)(图4a、图4b)。
3.3过表达e6-ap增强hct-116和hct-8细胞的侵袭能力
对过表达e6-ap的hct-116和hct-8细胞进行侵袭试验，通过细胞计数板计数，1×105个细胞密度接种至小室内培养24h，固定下层细胞，结晶紫染色后光镜下观察并计数。结果显示(图5a、图5b)，过表达e6-ap的hct-116和hct-8细胞穿过基质胶的细胞数明显增多(p<0.05)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110>江西中医药大学第二附属医院
<120>一种慢病毒过表达载体介导的e6-ap促进结肠癌细胞生长和转移的实验方法
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<213>人工序列(artificialsequence)
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