MDBK驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺与流程

本发明涉及mdbk细胞驯化悬浮方法和悬浮mdbk细胞相关疫苗生产领域，本发明mdbk驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺两者在技术方案中可以同时存在也可以独立存在。具体涉及30l以上的生物反应器培养悬浮mdbk细胞、以二阶培养方法培养悬浮mdbk细胞以生产疫苗的工艺技术。

背景技术：

哺乳动物细胞大规模培养技术是生物制药企业下游通用技术之一，其在该行业发挥极为重要的作用。该项技术的关键在于实现哺乳动物细胞的悬浮无血清大规模培养，从而提高产能，降低成本，并易于放大。贴壁细胞培养时的通常做法是在培养基中添加一定量血清使细胞贴壁生长，而血清化学成分不确定，且质量不稳定，有批间差，用此种细胞生产的生物制品，质量难以控制，很难通过食品药品监督管理局的审批，而悬浮无血清培养相对常见的贴壁培养来说，单位体积能生长更多的细胞，从而能生产更多的生物制品。

mdbk细胞是从一只表观正常的成年牛肾脏建立的mdbk细胞株，中文名为牛肾细胞，该细胞是贴壁依赖性的肾上皮细胞。它能支持多种病毒的增殖，包括病毒性牛腹泻疫苗、牛传染性鼻气管炎疫苗等病毒。

现有的mdbk细胞驯化悬浮的缺陷在于：1、有的无法实现完全无血清培养；2、一般采用两步走的方法，即先降为无血清再悬浮培养，由于贴壁培养采用的培养基通常为基础培养基加血清，基础培养基营养成分较弱，驯化过程中贴壁培养表面积/体积比通常较小，限制了营养的摄入，整个驯化过程耗时长；3、基因修饰后驯化，即通过基因改造，为贴壁细胞株插入不利于贴壁的基因片段，改变原有的贴壁培养方式，使细胞悬浮生长，然后再通过培养基的不断优化与改变使细胞能够无血清高密度生长，此种办法容易实现，但是插入了外源基因片段，影响产品的质量。因此，需要对mdbk细胞的悬浮驯化和无血清驯化方法进一步研究，并克服以上三方面的缺陷。

在病毒接毒工艺方面，传统的病毒性疫苗生产工艺是指细胞生长到一定的密度后，换液再接毒或者直接接毒。截至目前，并未有关于悬浮mdbk细胞的二阶培养方法的相关报道。

技术实现要素：

本发明的第一方面涉及一种悬浮mdbk细胞疫苗生产的二阶培养方法，其包含如下步骤：

1)细胞生长：悬浮mdbk细胞在生长培养基中生长至2.0×10⁶细胞/ml～20.0×10⁶细胞/ml；

2)接毒：接毒量在10^-1～10^-5moi之间，或者在步骤3)之后按照此接毒量接毒；

3)稀释/补加生产培养基：用生产培养基稀释1～5倍，稀释后细胞密度到1.0×10⁶细胞/ml～10.0×10⁶细胞/ml；

4)二次生长：细胞二次生长；

5)任选地，收获病毒液纯化制苗。

在一些实施方案中，悬浮mdbk细胞生长为悬浮罐培养，培养工作体积为30l及以上。

在一些实施方案中，步骤1)中细胞密度在5.0×10⁶细胞/ml～16.0×10⁶细胞/ml，优选地，6.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml，最优选地，10.0×10⁶细胞/ml。

在一些实施方案中，步骤2)中细胞接毒量在10^-1～10^-4moi之间，更优接地，10^-1～10^-3moi，最优接地，10^-2moi。

在一些实施方案中，步骤3)中悬浮mdbk细胞生产培养基稀释为1～4倍，更优选地，1～3倍稀释，最优选为2倍稀释。

在一些实施方案中，步骤3)中接毒后细胞密度在1.0×10⁶细胞/ml～10.0×10⁶细胞/ml，优选地，4.0×10⁶细胞/ml～10.0×10⁶细胞/ml。

在一些实施方案中，悬浮mdbk细胞为疫苗生产所用的悬浮细胞，或是由贴壁mdbk细胞驯化而来、能够悬浮生长生产的悬浮mdbk细胞，优选地，悬浮mdbk细胞是由贴壁mdbk细胞经低血清驯化或无血清驯化而来，所述无血清驯化是指驯化后的mdbk细胞可在无血清存在的培养基中生长、增殖，和/或，优选地，悬浮mdbk细胞是由贴壁mdbk细胞经悬浮驯化而来。

在一些实施方案中，病毒为在对应悬浮mdbk细胞上敏感、能够生产出对应疫苗的病毒，优选地，病毒选自病毒性牛腹泻疫苗或牛传染性鼻气管炎疫苗。

在一些实施方案中，细胞生长温度在35℃～37℃，接毒后病毒生产温度在30℃～37℃。

在一些实施方案中，细胞生长接种密度在0.3×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml细胞，生长天数在2～8天达到最高细胞密度。

换言之，本发明解决的一个技术问题是克服现有技术的不足，提供一种贴壁mdbk细胞的低血清、无血清驯化和悬浮驯化方法，使该细胞生长状态稳定、分散性好，适用于规模化培养，并有利于病毒的复制和表达。

为此，本发明通过培养基的改变和培养方式的改变，使原有贴壁生长的细胞株能够低血清、无血清、悬浮高密度生长。其中，血清驯化包含：a：逐步降血清适应驯化方法，即，逐步降低细胞传代培养过程中培养基血清浓度，直至mdbk细胞适应低血清浓度下的培养条件；b：直接无血清驯化方法。用于低血清驯化的起始的处于最佳状态并稳定生长的mdbk细胞可以是从冻存的贴壁mdbk细胞复苏、恢复而来的mdbk细胞。

具体而言，首先，a：逐步降血清适应驯化方法是将贴壁mdbk细胞低血清驯化，使得贴壁mdbk细胞在较低血清条件下(1％～3％)贴壁正常生长，再对适应低血清培养的贴壁细胞进行降血清至无血清悬浮生长；b：直接无血清驯化方法，系指将低血清培养基中培养的贴壁mdbk细胞直接置于无血清培养基中悬浮培养，筛选无血清培养基的同时让mdbk细胞适应悬浮培养，再开发出适用于悬浮mdbk细胞高密度悬浮培养的化学成分确定的无蛋白、无动物来源的无血清细胞培养基，如cdmdbk211(jsb-211)。例如，在mdbk细胞已完全适应贴壁低血清生长后，选择5～8种健顺生物cd系列无血清培养基进行无血清驯化和悬浮驯化，直到mdbk细胞完全适应悬浮培养方式，并且悬浮mdbk细胞能够开始稳定的传代生长，悬浮mdbk细胞密度能够达到2.0×10⁶细胞/ml～4.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在95％左右。

本发明还优化了培养基中氨基酸、维生素、微量元素、生长因子、水解物等成分，获得优化的悬浮mdbk细胞无血清细胞培养基，使悬浮mdbk细胞能够更高密度稳定生长传代，悬浮mdbk细胞最高密度能够达到6.0×10⁶细胞/ml～8.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在98％左右。

本发明还开发了悬浮mdbk细胞cd化学成分明确的无蛋白、无动物来源的无血清细胞培养基，其适用于悬浮mdbk细胞高密度全悬浮培养，悬浮mdbk细胞最高密度能够达到8.0×10⁶细胞/ml～15.0.0×10⁶细胞/ml之间，甚至20.0×10⁶细胞/ml，活率维持在98％左右。

本发明培养出的悬浮mdbk细胞生长状态稳定，分散性好且无较大团块、完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，并能够规模化生产，悬浮mdbk细胞密度能够达到8.0×10⁶细胞/ml～20.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在95％以上，甚至高达98％。

本发明中的悬浮mdbk细胞为适应无血清悬浮培养的悬浮mdbk细胞，既可以是市售可得的悬浮mdbk细胞，也可以是如上所述由贴壁mdbk细胞经低血清、无血清驯化和/或悬浮驯化而获得的悬浮mdbk细胞。本发明中的dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)基础培养基，bd004(jsb-dp049)低血清培养基，cdmdbk211(jsb-211)无血清培养基均为健顺生物商业化上市培养基。本发明与现有技术相比，有以下优点:本发明培养出的悬浮mdbk细胞生长状态稳定，分散性较好，完全适应在无血清且化学成分确定的培养基中进行悬浮培养，能够规模化生产。

本发明还提供了一种悬浮mdbk细胞相关疫苗生产的二阶培养方法，其包含如下步骤：

1)细胞生长：悬浮mdbk细胞在生长培养基中生长至2.0×10⁶/ml～20.0×10⁶/ml；

2)接毒：按照生产工艺，在细胞生长的第二天或者第三天，细胞密度达到6.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml，选择接毒量在10^-1～10^-5moi之间接毒，或者在稀释之后按照此接毒量接毒；

3)稀释/补加病毒生产培养基：用生产培养基稀释1～5倍，稀释后细胞密度到1.0×10⁶细胞/ml～10.0×10⁶细胞/ml；

4)二次生长：细胞二次生长；

5)任选地，收获病毒液纯化制苗。

在一些实施方案中，收获病毒液纯化制苗是指按照生产工艺收获病毒液纯化制苗，其中，所述生产工艺是指利用mdbk细胞生产相应疫苗的已知生产工艺。

在一些实施方案中，mdbk细胞生长为悬浮罐培养，培养工作体积为30l及以上，例如35l、40l、50l、100l、150l、200l、300l、400l、500l或更大。

在一些实施方案中，mdbk细胞的生长培养基为任何适用于mdbk细胞的生长的培养基，优选地，所述培养基为cdmdbk211(jsb-211)无血清培养基。

在一些实施方案中，步骤1)中细胞密度在5.0×10⁶细胞/ml～16.0×10⁶细胞/ml，优选地，8.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml，最优选地，10.0×10⁶细胞/ml。

在一些实施方案中，步骤2)中细胞接毒量在moi10^-1～10^-4moi之间，更优接地，10^-1～10^-3moi，最优接地，10^-2moi。

在一些实施方案中，步骤3)中mdbk细胞生产培养基稀释为1～4倍，更优选地，1～3倍稀释，最优选为2倍稀释。

在一些实施方案中，步骤3)中接毒后细胞密度在2.0×10⁶细胞/ml～7.0×10⁶细胞/ml，优选地，3.0×10⁶细胞/ml～5.0×10⁶细胞/ml。

在一些实施方案中，步骤4)中二次生长后的细胞密度为2.0×10⁶细胞/ml–20.0×10⁶细胞/ml，例如，2.0×10⁶细胞/ml、3.0×10⁶细胞/ml、4.0×10⁶细胞/ml、5.0×10⁶细胞/ml、6.0×10⁶细胞/ml、7.0×10⁶细胞/ml、8.0×10⁶细胞/ml、9.0×10⁶细胞/ml、10.0×10⁶细胞/ml、11.0×10⁶细胞/ml、12.0×10⁶细胞/ml、13.0×10⁶细胞/ml、14.0×10⁶细胞/ml、15.0×10⁶细胞/ml、16.0×10⁶细胞/ml、17.0×10⁶细胞/ml、18.0×10⁶细胞/ml、19.0×10⁶细胞/ml、20.0×10⁶/ml。

在一些实施方案中，mdbk细胞为疫苗生产所用的悬浮细胞，或由贴壁驯化而来、能够悬浮生长生产的悬浮细胞。

在一些实施方案中，病毒为在对应悬浮mdbk细胞上敏感、能够生产出对应疫苗的病毒。在一些实施方案中，病毒选自病毒性牛腹泻疫苗、牛传染性鼻气管炎疫苗

在一些实施方案中，细胞生长温度在35℃～37℃，接毒后病毒生产温度在30℃～37℃。

在一些实施方案中，细胞生长接种密度在0.3×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml，例如0.3×10⁶细胞/ml、0.4×10⁶细胞/ml、0.5×10⁶细胞/ml、0.6×10⁶细胞/ml、0.7×10⁶细胞/ml、0.8×10⁶细胞/ml、0.9×10⁶细胞/ml或1.0×10⁶细胞/ml，生长天数在3～8天达到最高细胞密度，例如3天、4天、5天、6天、7天或8天。

本发明的创新性是在细胞生长到平台期前，细胞密度达到最高，然后稀释原有培养体积，再接种病毒的过程，经过稀释的细胞可从低密度二次生长，病毒也随之复制，最终提高病毒产量。本发明的mdbk细胞相关疫苗生产的二阶培养的优势在于：生产工艺简单；不浪费培养基；不换液；生产培养基和生长培养基可以为相同的培养基，也可以为不同的培养基。生产培养基和生长培养基按照比例混合，既可以达到细胞生长的作用，又可以达到病毒复制增殖的作用。

附图说明

图1显示了mdbk细胞在第三天细胞密度生长到7.0×10⁶/ml时，补加原有工作体积1倍的细胞培养基，把细胞密度稀释到3.1×10⁶/ml时，细胞又开始二次生长，经过2天细胞密度又生长到12.0×10⁶/ml。

图2显示了mdbk细胞在第三天细胞密度生长到8.0×10⁶细胞/ml时，接种bvdv病毒，吸附1h后补加原有工作体积2倍的细胞培养基，把细胞密度稀释到2.7×10⁶细胞/ml进行病毒生产，病毒滴度为tcid50log108.0/0.1ml。

图3：a-d显示了mdbk悬浮细胞在倒置显微镜下观察到的生长图片及感染bvdv病毒后病变图片。

具体实施方式

换言之，本发明的创新性在于：贴壁生长mdbk细胞利用本发明的低血清、无血清驯化方法和悬浮驯化方法驯化后，所获得的驯化细胞生长状态稳定、分散性好，适用于高密度、规模化培养，并有利于病毒的复制和表达。悬浮mdbk细胞在生长到平台期前时达到一定细胞密度，例如细胞密度在10.0×10⁶细胞/ml时，加入生产培养基稀释原有培养体积，再接种病毒。mdbk细胞稀释到低密度后又开始二次生长，病毒也随之复制，最终提高病毒产量。

为了达到以上生产优势，本发明首先提供了一种贴壁mdbk细胞株通过培养基的改变和培养方式的改变，使原有贴壁生长的细胞株能够低血清或无血清、悬浮高密度生长的驯化方法，所述低血清是指培养基中血清浓度低于未经驯化的贴壁mdbk细胞株正常生长、增殖时培养基中所需的血清浓度，例如，低血清是指培养基中血清浓度低于7％、6％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.5％或更低，优选地，血清浓度低于1.5％，更优选地，血清浓度低于1％。所述无血清是指培养基中不含有任何动物来源的血清或其成分。所述浓度为体积百分比浓度。所述贴壁mdbk细胞的低血清驯化包含逐步降低细胞传代培养过程中培养基血清浓度，直至mdbk细胞适应低血清浓度如1％的血清浓度下的培养条件。然后，适应低血清培养条件的贴壁mdbk细胞在低血清条件下进行悬浮培养适应，获得适应低血清悬浮培养的悬浮mdbk细胞。该悬浮mdbk细胞可继续进行无血清化学成分界定生长培养基的适应。具体而言，该低血清、悬浮、无血清驯化可以如下两个途径进行。1)使处于最佳状态并稳定生长的mdbk细胞依次在含10％、8％、5％动物血清如新生牛血清的适合mdbk细胞增殖、传代的细胞培养基如dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)培养基中传代、增殖，使之逐步适应含5％动物血清的培养基，此时贴壁mdbk细胞的倍增时间达到20h～25h，细胞状态良好。然后依次在含5％、3％、1％动物血清如新生牛血清的低血清培养基如bd004(jsb-dp049)培养基中传代1～4次，如3～4次，分别使细胞恢复到最佳状态并稳定生长，获得适应加1％动物血清的低血清培养基中增殖和传代的贴壁mdbk细胞，此时贴壁mdbk细胞的倍增时间达到20h～25h，细胞状态良好。然后，将获得的mdbk细胞继续在含0.3％～1％血清的低血清培养基如bd004(jsb-dp049)培养基中悬浮培养，细胞适应悬浮培养后，将获得的悬浮mdbk细胞于商业化无血清化学成分界定生长培养基如cdmdbk211(jsb-211)中进行适应，经多次(例如2～5次)增殖、传代，获得细胞密度可达到2.0×10⁶细胞/ml～4.0×10⁶细胞/ml，活率在95％以上，并分散性良好且无较大团块，即可连续传代30～120代，并可达到最高密度8.0×10⁶细胞/ml～15×10⁶细胞/ml的悬浮mdbk细胞，其适应无血清化学成分界定的生长培养基的培养。最初驯化时通常需要较高的接种密度，如0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml。如果mdbk细胞在最初的驯化中生长缓慢或者停滞生长，活率维持较低，可以选择3～5天进行传代，传代时采用离心换液的方法。如果驯化过程中细胞生长极其缓慢，可以适当调整培养体积，然后不定期进行补液。2)将贴壁mdbk细胞直接进行无血清悬浮驯化。具体而言，将液氮罐中冻存的贴壁mdbk细胞直接复苏在含有2％动物血清如新生牛血清的完全低血清培养基如bd004(jsb-dp049)中，每3～5天传代一次，经2～7代如3～5代适应性传代，获得稳定性传代、倍增时间稳定、细胞形态良好的贴壁mdbk细胞。然后，选择5～8种健顺生物系列无血清培养基进行无血清驯化和悬浮驯化。具体而言，所述无血清驯化包含使适应贴壁低血清生长的mdbk细胞在5～8种健顺生物系列无血清培养基中生长和传代(90％汇合状态时传代)，通过取样计数放弃无法直接适应驯化mdbk细胞生长的无血清培养基，其他能够适应驯化的mdbk细胞和对应无血清培养基进行不定期的传代，重复该步骤，直到mdbk细胞完全适应悬浮培养方式，并且悬浮mdbk细胞能够开始稳定的传代生长。待悬浮mdbk细胞密度能够生长维持在2.0×10⁶细胞/ml～4.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在95％左右时，固定细胞接种密度并定期传代，例如细胞接种密度为0.3×10⁶细胞/ml～0.5×10⁶细胞/ml之间，每3～4天进行传代。然后，通过优化悬浮mdbk细胞无血清细胞培养基，例如优化培养基中氨基酸、维生素、微量元素、生长因子、水解物等成分，使悬浮mdbk细胞能更高密度生长，悬浮mdbk细胞最高密度能够达到6.0×10⁶细胞/ml～8.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在98％左右。然后，开发悬浮mdbk细胞cdmdbk211(jsb-211)化学成分确定的无蛋白、无动物来源的无血清细胞培养基，其适用于悬浮mdbk细胞高密度培养，悬浮mdbk细胞密度能够达到8.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在98％左右。最初驯化时通常需要较高的接种密度，如0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml。如果mdbk细胞在最初的驯化中生长缓慢或者停滞生长，活率维持较低，可以选择3～5天进行传代，传代时采用离心换液的方法。如果驯化过程中细胞生长极其缓慢，可以适当调整培养体积，然后不定期进行补液。

用于低血清驯化的起始的处于最佳状态并稳定生长的mdbk细胞可以是从冻存的贴壁mdbk细胞复苏、恢复而来的mdbk细胞。具体而言，该复苏、恢复涉及使冻存的贴壁mdbk细胞复苏后，在含正常浓度的血清，如10％胎牛血清或新生牛血清，的完全基础培养基(如dmem(高葡萄糖)(jsb-66001))中培养，在细胞达到90％汇合状态时传代，连续传代2～4次，直至细胞恢复到最佳状态并稳定生长。

在一些实施方案中，所述低血清或其无血清驯化和/或悬浮培养驯化包含如下步骤：

对于逐步降血清适应驯化方法其内容主要包含如下步骤：

(1)将冻存在液氮罐中的贴壁mdbk细胞(细胞株来源：美国atcc，ccl-22)直接复苏，置于含10％新生牛血清(nbcs)的dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)完全基础培养液中培养，待72h～96h后，显微镜下观察mdbk细胞长满单层时，加入0.25％trypsin-edta消化液，常温消化1～3min后弃去胰酶消化液，用含10％新生牛血清的dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)完全基础培养液终止消化，并吹散成单个细胞悬液，计数后以消化前贴壁mdbk细胞体积和消化后贴壁mdbk细胞体积比为1:5～1:10进行消化传代，培养容器和培养体积等都可以根据实际操作选择不同规格的培养皿或培养瓶对应不同的培养体积，然后将细胞放于37℃、5％co2的培养箱中静止培养；

(2)重复步骤(1)消化传代培养，经过3～5代适应性传代，贴壁mdbk细胞能够稳定传代，倍增时间稳定，显微镜下观察细胞形态，待贴壁mdbk细胞整体恢复最佳生长状态后，分步将dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)培养基中的血清降至10％、8％、5％重复步骤(1)消化传代方法传代培养；

(3)2～3天传代一次，直至培养2～3代后细胞能够按照1:5～1:10进行消化稳定传代，倍增时间能够达到20h～25h，显微镜下观察细胞状态良好，即mdbk细胞适应含5％新生牛血清的dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)培养基；

(4)将适应5％新生牛血清dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)培养基的贴壁mdbk细胞按照步骤(1)消化传代的方法传至加5％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)的低血清培养基中，培养容器和培养体积等都可以根据实际操作选择不同规格的培养皿或培养瓶，然后将细胞放于37℃、5％co2的培养箱中静止培养；

(5)2～3天传代一次，分步将bd004(jsb-dp049)培养基中的血清降至5％、3％、1％，重复步骤(1)消化传代方法进行传代培养，培养容器可以根据实际操作选择不同规格的培养皿或培养瓶，然后将细胞放于37℃、5％co2的培养箱中静止培养；

(6)2～3天传代一次，直至培养2～3代后细胞能够按照1:5～1:10进行消化稳定传代，倍增时间能够达到20h～25h，显微镜下观察细胞状态良好，即mdbk细胞适应加1％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)培养基；

(7)将适应加1％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)培养基的贴壁mdbk细胞重复步骤(1)消化方法，制备成单个细胞悬液，取样计数，1000rpm，5min离心，离心后弃去上清，保留mdbk细胞沉淀；

(8)步骤(7)中的mdbk细胞沉淀用含0.3％～1％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)培养基重悬，置125mlshaker摇瓶中，培养体积30ml～50ml，放于37℃、5％co2、湿度≥80％、转速为110～130rpm摇床中培养。这种情况下，由于只有接种的部分细胞可能适应一个新的生长环境，所以最初驯化时通常需要更高的接种密度，如0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml，这有利于增加在后续传代中活细胞的数目。建议在小规模的培养条件下，例如：125mlshaker摇瓶进行驯化，培养体积30ml～40ml，培养体积是培养容器的1/3～1/4。驯化过程中需要定期取样计数，此期间细胞活率可能会下降到很低的水平，这是驯化必经的一个阶段，体现了细胞的适应性；

(9)开始驯化，每隔4～5天传代，温和地收集步骤(8)悬浮mdbk细胞(1000rpm，5min离心以去除原培养基)。弃上清，轻柔地将离心所得悬浮mdbk细胞重悬于商业化无血清化学成分界定生长培养基cdmdbk211(jsb-211)中，重悬细胞至125ml悬浮培养摇瓶中，注意吹散细胞团使得细胞呈分散状态，调整细胞接种密度在0.3×10⁶细胞/ml～1.5×10⁶细胞/ml，优选0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml，培养体积30ml～50ml，放于37℃、5％co2、湿度≥80％、转速为110rpm～130rpm摇床中培养；

(10)摇瓶培养的细胞悬液离心，去上清收集mdbk细胞，重复步骤(9)，每3天按照0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml传代一次，观察细胞结团以及细胞分散情况，直至培养三天后细胞密度可达到2.0×10⁶细胞/ml～4.0×10⁶细胞/ml，活率在95％以上，并分散性良好且无较大团块，即可连续传代30～120代，并可达到最高密度8.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml，即悬浮mdbk细胞适应无血清化学成分确定培养基，以10.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml冻存，使用程序降温盒于-80℃冰箱中24h，次日转移冻存管至液氮罐中保存。如上所述的步骤(1)～(10)中的百分比浓度均为体积浓度。

对于直接无血清驯化方法，其内容主要包含如下步骤：

(1)将液氮罐中冻存的贴壁mdbk细胞(来源如上)直接复苏在含有2％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)完全低血清培养液中进行培养，待48h～72h后，显微镜下观察mdbk细胞长满单层时，加入0.25％trypsin-edta消化液，常温消化1～3min后弃去胰酶消化液，用含有2％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)完全低血清培养液终止消化并吹散成单个细胞悬液，计数后以消化前贴壁mdbk细胞体积和消化后贴壁mdbk细胞体积比为1:5～1:10进行消化传代培养，培养容器和培养体积等都可以根据实际操作选择不同规格的培养皿或培养瓶对应不同的培养体积，然后将细胞放于37℃、5％co2的培养箱中静止培养；

(2)每三天进行传代，重复步骤(1)消化传代培养，经过3～5代适应性传代，贴壁mdbk细胞能够稳定性传代，倍增时间稳定，显微镜下观察细胞形态，待贴壁mdbk细胞整体恢复最佳生长状态后，将最后一次培养的贴壁mdbk细胞弃除旧培养基并加入2ml0.25％trypsin-edta使mdbk细胞消化脱离培养瓶表面，然后加入含有2％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)完全低血清培养液终止胰酶消化，1000rpm离心10min，去上清收集mdbk细胞沉淀；

(3)选择5～8种健顺生物cd系列无血清培养基(cdmdck、cdeb66、cd022、cd024、cd012、cdhek293)，直接进行筛选驯化,将步骤(2)中的mdbk细胞沉淀分别用健顺生物cd系列无血清培养基重悬置至125ml悬浮培养摇瓶中，注意吹散细胞团使得细胞呈分散状态，调整细胞接种密度在0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml，培养体积30ml～50ml，放于37℃、5％co2、湿度≥80％、转速为110～130rpm摇床中培养。这种情况下，由于只有接种的部分细胞可能适应一个新的生长环境，所以最初驯化时通常需要更高的接种密度，如0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml，这有利于增加在后续传代中活细胞的数目。建议在小规模的培养条件下，例如：125mlshaker摇瓶进行驯化，培养体积30ml～40ml，培养体积是培养容器的1/3～1/4。驯化过程中需要定期取样计数，此期间细胞活率可能会下降到很低的水平，这是驯化必经的一个阶段，体现了细胞的适应性，也会出现细胞完全无法适应在某个cd系列无血清培养基中生长而死亡，这也是最初筛选培养基的一个必经过程；

(4)将步骤(3)悬浮培养的mdbk细胞根据定期计数结果判断，放弃无法适应无血清培养基的mdbk细胞，将能够适应的mdbk细胞和对应cd系列无血清培养基进行不定期的传代，如mdbk细胞在最初的驯化中生长缓慢或者停滞生长，活率维持较低，可以选择3～5天进行传代换液；

(5)温和地收集步骤(4)的悬浮mdbk细胞(1000rpm，5min离心以去除原培养基)。弃上清，轻柔地将离心所得mdbk细胞重悬于对应的无血清培养基中，接种密度可以根据mdbk细胞驯化生长情况适当调整，介于0.3×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml之间。一些情况下也可以选择不离心传代的方式，如：驯化过程中细胞生长极其缓慢情况下，可以适当调整培养体积，然后不定期进行补液，即加入新鲜无血清培养基调整细胞密度在0.3×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml培养，每天定时取样计数；

(6)重复步骤(5)，不定期将悬浮mdbk细胞传代，每天取样计数，直到mdbk细胞完全适应悬浮培养方式，及悬浮mdbk细胞能够稳定的传代生长，悬浮mdbk细胞密度能够生长维持在2.0×10⁶细胞/ml～4.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在95％左右，此时需要固定细胞接种密度并定期传代，如：细胞接种密度按照0.3×10⁶细胞/ml～0.5×10⁶细胞/ml，每隔3～4天进行传代，每天定时取样计数；

(7)优化悬浮mdbk细胞无血清细胞培养基，通过优化培养基中氨基酸、维生素、微量元素、生长因子、水解物等成分让步骤(6)中的悬浮mdbk细胞能够更高密度生长，悬浮mdbk细胞最高密度能够达到6.0×10⁶细胞/ml～8.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在98％左右；

(8)开发适应悬浮mdbk细胞的化学成分确定的无蛋白、无动物来源的无血清细胞培养基cdmdbk211(jsb-211)，其适用于悬浮mdbk细胞高密度培养，悬浮mdbk细胞最高密度能够达到8.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在98％左右,以10.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml冻存细胞建种子库，使用程序降温盒于-80℃冰箱中24h，转移冻存管至液氮罐中保存，如上所述的步骤(1)～(10)中的百分比浓度均为体积浓度。

此外，为了达到以上生产优势，本发明还提供一种关于mdbk细胞相关疫苗生产的二阶培养工艺方法，具体过程和步骤如下：

1)细胞生长：mdbk细胞在生长培养基如cdmdbk(jsb-211)中生长，密度达到2.0×10⁶细胞/ml～20.0×10⁶细胞/ml间；优选细胞密度在6.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml，更优选地，9.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml，最优选细胞密度为12.0×10⁶细胞/ml；

2)接毒：按照生产工艺，细胞接毒量在10^-1～10^-5moi之间，优选接毒量在10^-1～10^-4moi，更优接毒量在10^-1～10^-3moi，最优接毒量在10^-2moi；

3)补液：补加生产培养基，补加原有生长培养基体积1～5倍的新鲜生产培养基，优选地，1～4倍，更优选地，1～3倍，最优选为2倍，使细胞密度达到1.0×10⁶细胞/ml～10.0×10⁶细胞/ml，优选地，1.0×10⁶细胞/ml～5.0×10⁶细胞/ml，最优选地，5.0×10⁶细胞/ml；

4)二次生长：细胞继续生长，

在一些实施方案中，在步骤4)二次生长的细胞密度达到工艺要求后，包括按照生产工艺收获病毒液纯化制苗的步骤，其中，所述生产工艺是指利用mdbk细胞生产相应疫苗的已知生产工艺。

其中步骤1)中细胞生长温度在35～37℃，例如35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃。所述悬浮mdbk细胞是如上所述低血清或其无血清驯化和/或悬浮培养驯化的悬浮mdbk细胞。

其中步骤2)中接毒量在10^-1～10^-5moi之间，具体由生产工艺以及病毒和细胞之间的关系控制，病毒生产温度在30～37℃之间，例如30℃、32℃、33℃、34℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃。

其中步骤3)中补加生产培养基量为原有生长培养基的1～5倍。

其中，“生长培养基”是指用于细胞从低密度生长到高密度的低血清或无血清细胞培养基。

“生产培养基”是指可以满足病毒有效复制的病毒生产培养基。

本发明的“生长培养基”和“生产培养基”可以是本领域已知的任何可以用于悬浮mdbk细胞生长和生产的培养基。

在本发明的一些实施方案中，所述“生长培养基”与“生产培养基”是同一种培养基，例如都为健顺生物商业化cdmdbk211无血清细胞培养基，编号为jsb-211。在本发明的另一些实施方案中，所述“生长培养基”与“生产培养基”是不同的培养基，例如“生长培养基”与“生产培养基”比例1:1、1；2、1:3、1:4、1:5。

本发明涉及mdbk细胞的低血清培养和无血清培养，用于生产的病毒包括病毒性牛腹泻疫苗、牛传染性鼻气管炎疫苗在内的所有在mdbk细胞上能够感染的病毒。

其中，所述“低血清培养”是指在培养过程中添加0.1％～3％的牛血清以满足细胞的生长的培养方式，例如0.5％、1％或1.5％。

“无血清培养”是指在培养过程中不添加动物血清如牛血清，或其成分，只靠培养基提供的营养成分满足细胞的生长的培养方式。

其中所述生产工艺为30l及以上的生物反应器，包含搅拌式生物反应器和激流式生物反应器，例如50l、100l、200l、300l、400l、500l、1000l、2000l、3000l、4000l、5000l、10000l甚至更大的生物反应器。

二阶培养方法是指，mdbk细胞从接种密度通过2～8天的生长，可以生长到2.0×10⁶细胞/ml～20.0×10⁶细胞/ml之间，然后接病毒吸附0.5～2h，优选0.6～1.5h，更优选0.7～1.2h，更优选0.8～1.1h，最优选1h，再补加原有工作体积的1～5倍的生产培养基，使细胞密度降低到1.0×10⁶细胞/ml～10.0×10⁶细胞/ml之间，通过1～7天的病毒生产，收获毒液制苗。当然，也可以在补加原有工作体积的1～5倍的生产培养基后再接毒。该技术适用于人用疫苗和兽用疫苗的生产。

其中，“接种密度”通常是指，当细胞生长到高密度，培养基营养成分不能满足细胞的生长时，再把高密度的细胞按照比例稀释成低密度的过程，一般接种密度在0.1～2.0×10⁶细胞/ml。

本发明所述的“平台期”是指细胞到达最高的密度的时间，“平台期前”是指细胞达到最高密度之前。

本发明所述的“细胞密度达到最高”是指培养基能够满足细胞生长的最高生长密度。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通知识和惯用方法，在不脱离本发明基本技术思想前提下，还可以做出多种形式的修改和变更。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1逐步降血清使贴壁mdbk细胞适应低血清、无血清和悬浮培养

1、实验材料

细胞株：来源于atcc的mdbk细胞株(ccl-22)。

培养基：dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)完全基础培养液，bd004(jsb-dp049)，商业化无血清化学成分界定生长培养基cdmdbk211(jsb-211)，均已上市。

2、方法

包括以下步骤：

(1)将冻存在液氮罐中的贴壁mdbk细胞(细胞株来源：美国atcc，ccl-22)直接复苏，置于含10％新生牛血清(nbcs)的dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)完全基础培养液中培养，待72h～96h后，显微镜下观察mdbk细胞长满单层时，加入0.25％trypsin-edta消化液，常温消化1～3min后弃去胰酶消化液，用含10％新生牛血清的dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)完全基础培养液终止消化，并吹散成单个细胞悬液，计数后以消化前贴壁mdbk细胞体积和消化后贴壁mdbk细胞体积比为1:5～1:10进行消化传代，培养容器和培养体积等都可以根据实际操作选择不同规格的培养皿或培养瓶对应不同的培养体积，然后将细胞放于37℃、5％co2的培养箱中静止培养；

(2)重复步骤(1)消化传代培养，经过3～5代适应性传代，贴壁mdbk细胞能够稳定传代，倍增时间稳定，显微镜下观察细胞形态，待贴壁mdbk细胞整体恢复最佳生长状态后，分步将dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)培养基中的血清降至10％、8％、5％，重复步骤(1)消化传代方法传代培养；

(3)2～3天传代一次，直至培养2～3代后细胞能够按照1:5～1:10进行消化稳定传代，倍增时间能够达到20h～25h，显微镜下观察细胞状态良好，即mdbk细胞适应含5％新生牛血清的dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)培养基；

(4)将适应5％新生牛血清dmem(高葡萄糖)(jsb-66001)培养基的贴壁mdbk细胞按照步骤(1)消化传代的方法传至加5％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)的低血清培养基中，培养容器和培养体积等都可以根据实际操作选择不同规格的培养皿或培养瓶，然后将细胞放于37℃、5％co2的培养箱中静止培养；

(5)2～3天传代一次，分步将bd004(jsb-dp049)培养基中的血清降至5％、3％、1％，重复步骤(1)消化传代方法进行传代培养，培养容器可以根据实际操作选择不同规格的培养皿或培养瓶，然后将细胞放于37℃、5％co2的培养箱中静止培养；

(6)2～3天传代一次，直至培养2～3代后细胞能够按照1:5～1:10进行消化稳定传代，倍增时间能够达到20h～25h，显微镜下观察细胞状态良好，即mdbk细胞适应加1％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)培养基；

(7)将适应加1％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)培养基的贴壁mdbk细胞重复步骤(1)消化方法，制备成单个细胞悬液，取样计数，1000rpm，5min离心，离心后弃去上清，保留mdbk细胞沉淀；

(8)步骤(7)中的mdbk细胞沉淀用含0.3％～1％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)培养基重悬，置125mlshaker摇瓶中，培养体积30ml～50ml，放于37℃、5％co2、湿度≥80％、转速为110～130rpm摇床中培养。这种情况下，由于只有接种的部分细胞可能适应一个新的生长环境，所以最初驯化时通常需要更高的接种密度，如0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml，这有利于增加在后续传代中活细胞的数目。建议在小规模的培养条件下，例如：125mlshaker摇瓶进行驯化，培养体积30ml～40ml，培养体积是培养容器的1/3～1/4。驯化过程中需要定期取样计数，此期间细胞活率可能会下降到很低的水平，这是驯化必经的一个阶段，体现了细胞的适应性；

(9)开始驯化，每隔4～5天传代，温和地收集步骤(8)悬浮mdbk细胞(1000rpm，5min离心以去除原培养基)。弃上清，轻柔地将离心所得悬浮mdbk细胞重悬于商业化无血清化学成分界定生长培养基cdmdbk211(jsb-211)中，重悬细胞至125ml悬浮培养摇瓶中，注意吹散细胞团使得细胞呈分散状态，调整细胞接种密度在0.3×10⁶细胞/ml～1.5×10⁶细胞/ml，优选0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml，培养体积30ml～50ml，放于37℃、5％co2、湿度≥80％、转速为110rpm～130rpm摇床中培养；

(10)摇瓶培养的细胞悬液离心，去上清收集mdbk细胞，重复步骤(9)，每3天按照0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml传代一次，观察细胞结团以及细胞分散情况，直至培养三天后细胞密度可达到2.0×10⁶细胞/ml～4.0×10⁶细胞/ml，活率在95％以上，并分散性良好且无较大团块，即可连续传代30～120代，并可达到最高密度8.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml，即悬浮mdbk细胞适应无血清化学成分确定培养基，以10.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml冻存，使用程序降温盒于-80℃冰箱中24h，次日转移冻存管至液氮罐中保存。如上所述的步骤(1)～(10)中的百分比浓度均为体积浓度。

实施例2直接驯化贴壁mdbk细胞适应低血清、无血清和悬浮培养

1、实验材料

细胞株：来源于atcc的mdbk细胞株(ccl-22)。

培养基：bd004(jsb-dp049)，cd系列无血清培养基(cdmdck、cdeb66、cd022、cd024、cd012、cdhek293)，商业化无血清化学成分界定生长培养基cdmdbk211(jsb-211)，均已上市。

2、方法

包括以下步骤：

(1)将液氮罐中冻存的贴壁mdbk细胞直接复苏在含有2％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)完全低血清培养液中进行培养，待48h～72h后，显微镜下观察mdbk细胞长满单层时，加入0.25％trypsin-edta消化液，常温消化1～3min后弃去胰酶消化液，用含有2％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)完全低血清培养液终止消化并吹散成单个细胞悬液，计数后以消化前贴壁mdbk细胞体积和消化后贴壁mdbk细胞体积比为1:5～1:10进行消化传代培养，培养容器和培养体积等都可以根据实际操作选择不同规格的培养皿或培养瓶对应不同的培养体积，然后将细胞放于37℃、5％co2的培养箱中静止培养；

(2)每三天进行传代，重复步骤(1)消化传代培养，经过3～5代适应性传代，贴壁mdbk细胞能够稳定性传代，倍增时间稳定，显微镜下观察细胞形态，待贴壁mdbk细胞整体恢复最佳生长状态后，将最后一次培养的贴壁mdbk细胞弃除旧培养基并加入2ml0.25％trypsin-edta使mdbk细胞消化脱离培养瓶表面，然后加入含有2％新生牛血清的bd004(jsb-dp049)完全低血清培养液终止胰酶消化，1000rpm离心10min，去上清收集mdbk细胞沉淀；

(3)选择5～8种健顺生物cd系列无血清培养基(cdmdck、cdeb66、cd022、cd024、cd012、cdhek293)，直接进行筛选驯化,将步骤(2)中的mdbk细胞沉淀分别用健顺生物cd系列无血清培养基重悬置至125ml悬浮培养摇瓶中，注意吹散细胞团使得细胞呈分散状态，调整细胞接种密度在0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml，培养体积30ml～50ml，放于37℃、5％co2、湿度≥80％、转速为110～130rpm摇床中培养。这种情况下，由于只有接种的部分细胞可能适应一个新的生长环境，所以最初驯化时通常需要更高的接种密度，如0.5×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml，这有利于增加在后续传代中活细胞的数目。建议在小规模的培养条件下，例如：125mlshaker摇瓶进行驯化，培养体积30ml～40ml，培养体积是培养容器的1/3～1/4。驯化过程中需要定期取样计数，此期间细胞活率可能会下降到很低的水平，这是驯化必经的一个阶段，体现了细胞的适应性，也会出现细胞完全无法适应在某个cd系列无血清培养基中生长而死亡，这也是最初筛选培养基的一个必经过程；

(4)将步骤(3)悬浮培养的mdbk细胞根据定期计数结果判断，放弃无法适应无血清培养基的mdbk细胞，将能够适应的mdbk细胞和对应cd系列无血清培养基进行不定期的传代，如mdbk细胞在最初的驯化中生长缓慢或者停滞生长，活率维持较低，可以选择3～5天进行传代换液；

(5)温和地收集步骤(4)的悬浮mdbk细胞(1000rpm，5min离心以去除原培养基)。弃上清，轻柔地将离心所得mdbk细胞重悬于对应的无血清培养基中，接种密度可以根据mdbk细胞驯化生长情况适当调整，介于0.3×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml之间。一些情况下也可以选择不离心传代的方式，如：驯化过程中细胞生长极其缓慢情况下，可以适当调整培养体积，然后不定期进行补液，即加入新鲜无血清培养基调整细胞密度在0.3×10⁶细胞/ml～1.0×10⁶细胞/ml培养，每天定时取样计数；

(6)重复步骤(5)，不定期将悬浮mdbk细胞传代，每天取样计数，直到mdbk细胞完全适应悬浮培养方式，及悬浮mdbk细胞能够稳定的传代生长，悬浮mdbk细胞密度能够生长维持在2.0×10⁶细胞/ml～4.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在95％左右，此时需要固定细胞接种密度并定期传代，如：细胞接种密度按照0.3×10⁶细胞/ml～0.5×10⁶细胞/ml，每隔3～4天进行传代，每天定时取样计数；

(7)优化悬浮mdbk细胞无血清细胞培养基，通过优化培养基中氨基酸、维生素、微量元素、生长因子、水解物等成分让步骤(6)中的悬浮mdbk细胞能够更高密度生长，悬浮mdbk细胞最高密度能够达到6.0×10⁶细胞/ml～8.0×10⁶细胞/ml之间，活率维持在98％左右；

(8)开发适应悬浮mdbk细胞的化学成分确定的无蛋白、无动物来源的无血清细胞培养基cdmdbk211(jsb-211)，其适用于悬浮mdbk细胞高密度培养，悬浮mdbk细胞最高密度能够达到8.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶/ml之间，活率维持在98％左右,以10.0×10⁶细胞/ml～15.0×10⁶细胞/ml冻存细胞建种子库，使用程序降温盒于-80℃冰箱中24h，转移冻存管至液氮罐中保存，如上所述的步骤(1)～(10)中的百分比浓度均为体积浓度。

实施例3悬浮mdbk细胞的二阶培养工艺测试

1、实验材料

细胞株：来源于atcc的mdbk细胞株(ccl-22)，经健顺生物自主驯化可悬浮生长，驯化条件如上所述。

培养基：cdmdbk211化学成分确定的无蛋白、无动物来源无血清化学成分确定细胞培养基，健顺生物自主开发(jsb-211)，已上市。

2、方法

包括以下步骤

(一)细胞的复苏、传代

(1)培养基的配制：按照说明书配制液体培养基cdmdbk21120l，除菌过滤后4℃避光保存。

(2)细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存细胞株，37℃融化后加入到30ml培养基中，1000rpm/min离心，丢弃上清液，重悬细胞于新鲜1×的无血清培养基cdmdbk211中，置于37℃，5％co2培养箱进行培养。

(3)传代：新复苏的细胞实验前需要传代3～4次，每隔3天传代一次，接种密度是1.0×10⁶细胞/ml，连续传代3天，然后进行实验。

(4)如图1所示，在第三天细胞密度生长到7.0×10⁶细胞/ml时，补加原有工作体积1倍的细胞培养基，把细胞密度稀释到3.1×10⁶细胞/ml时，接种病毒，细胞又开始二次生长，经过2天细胞密度生长到12.5×10⁶细胞/ml。

由图1可见，mdbk细胞生产工艺二阶培养技术的优越性。高密度生长，低密度接毒，细胞由开始二次生长。节省了生产成本，提高病毒滴度。

实施例4牛腹泻病毒bvdv在mdbk细胞上的生产

1、实验材料

细胞株：来源于atcc的mdbk细胞株(ccl-22)，经健顺生物自主驯化可悬浮生长，驯化条件如上所述。

培养基：cdmdbk211化学成分确定的无蛋白、无动物来源的无血清细胞培养基，健顺生物自主开发(jsb-211)。

牛腹泻病毒：bvdv(华农(肇庆)生物产业技术研究院)

2、方法

包括以下步骤

(一)细胞的复苏、传代

(1)培养基的配制：按照说明书配制液体培养基cdmdbk21120l，除菌过滤后4℃避光保存。

(2)细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存细胞株，37℃融化后加入到30ml培养基cdmdbk211中，1000rpm/min离心，丢弃上清液，重悬细胞于新鲜1×的cdmdbk211培养基中，置于37℃，5％co2培养箱进行培养。

(3)传代：新复苏的细胞实验前需要传代3～4次，每隔3天传代一次，接种密度是1.0×10⁶细胞/ml，连续传代3天。

(4)接毒：细胞传代至第4代第3天时，细胞密度达到8.0×10⁶细胞/ml，计划细胞接毒密度为2.7×10⁶细胞/ml，在细胞密度为8.0×10⁶细胞/ml时接毒，吸附1h后补加2倍的cdmdbk211培养基至细胞密度为2.7×10⁶细胞/ml。

(5)测毒，按照半数组织(细胞)培养感染剂量测试病毒的tcid50，结果见图2。

实验结果

由图2可见，bvdv病毒采用mdbk悬浮细胞生产工艺二阶培养技术所生产的病毒效价tcid50为log108.0/0.1ml，病毒产量高于常规方法1个滴度(采用常规方法获得的病毒效价一般为tcid50log107.0/0.1ml)。图3a-d显示了mdbk悬浮细胞在倒置显微镜下观察到的生长图片及感染bvdv病毒后病变图片。其创新点在于mdbk悬浮细胞在cdmdbk211无血清培养基中第3天高密度(8.0×10⁶细胞/ml)生长，2倍稀释后低密度(2.7×10⁶细胞/ml)感染bvdv病毒，在接毒后本发明细胞又开始二次生长，节省了生产成本，提高了病毒滴度。