本发明属于生物技术领域，涉及一种带有自发性kshv裂解复制的神经元细胞的构建方法。
背景技术：
卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(kaposi’ssarcoma-associatedherpesvirus，kshv)，又名人类8型疱疹病毒(humanherpesvirus-8，hhv-8)，属γ-疱疹病毒。是1994年chan等运用代表性差异分析(rda)的方法从aids相关型卡波氏肉瘤(kaposi’ssarcoma)病人皮损中发现的病毒，除ks外，kshv还能引发原发性渗出性淋巴瘤(primaryeffusionlymphoma,pel)和多中心castleman’s病(multicentriccastleman’sdisease,mcd)。目前已知kshv感染的细胞类型主要为上皮细胞、内皮细胞、b细胞以及巨噬细胞。
kshv可以通过性行为传播，但其主要的传播途径为非性行为传播，例如血液传播、器官移植和唾液接触传播。在宿主细胞内，kshv感染细胞后以两种方式存在，即持续的潜伏态和短暂的裂解态。在大多数感染细胞中，裂解态的病毒复制是造成细胞死亡的原因。目前研究发现的kshv感染细胞后，主要以潜伏态存在，其dna被运送到胞核，病毒基因组以共价环状形式持续游离于细胞染色体之外，仅表达有限的蛋白，以逃避宿主免疫应答，保护病毒的持续存在。裂解态的病毒基因组演变为线性dna，便于病毒大量快速的复制，kshv为保持持续存在，很少会自发进入裂解态。研究发现仅有约1％-5％的pel细胞和5％-10％的多中心castleman’s病细胞kshv会自发性的转变为裂解态。在特殊的环境和生理因素下，例如在缺氧、佛波酯(tpa)和丁酸钠(sb)等因素的刺激下，可能诱导隐藏的潜伏态病毒进入裂解复制期。
近年来研究报道，kshv所在的疱疹病毒家族表现出了嗜神经倾向，关于kshv是否能够造成中枢神经系统疾病目前还不明确。有少量的基于pcr技术的报道分析了kshv血清阳性患者的脑组织样本中存在kshv感染，但这些报道还不足以明确的说明kshv在脑实质细胞中发挥作用。
揭示kshv感染对神经元细胞的影响的特点，需要建立高感染率的细胞模型。人类的神经元细胞系非常有限，sh-sy5y神经母细胞瘤细胞系曾经被初步的证明了可以受到kshv的感染。然而，为更加全面的描述kshv对其感染的特点，确定其是否能成为kshv感染神经元细胞相关研究的模型，需要进一步检测该细胞的特点。我们用重组病毒rkshv.219感染sh-sy5y细胞。rkshv.219的特点是其自身带有反应病毒裂解态的pan启动子和反应潜伏态的ef-1a启动子，使得当病毒处于裂解态时，表达rfp显红色荧光，当病毒处于潜伏态时，表达gfp显绿色荧光，使用该病毒不但能够直接检测到病毒的感染而且可以反映出病毒的感染状态。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种带有自发性kshv裂解复制的神经元细胞的构建方法。sh-sy5y细胞感染后，发现该细胞出现了与其他细胞不同的特点，kshv在sh-sy5y细胞中在不加诱导剂的情况下能够出现自发性的裂解复制，采用流式技术分选出处于病毒裂解复制的细胞。处于裂解复制的细胞大都因裂解而死亡，然而本研究中分选到的细胞能够存活并能够持续培养，通过对其裂解态基因的表达、细胞增殖能力和裂解态荧光信号等的检测，说明了分选的此类细胞能够自发持续保持裂解态复制，并能够正常培养，是一种特殊类型的细胞，可以作为研究kshv裂解态和潜伏态转变机制的细胞模型，也可以作为kshv对神经元细胞作用机制研究的细胞模型。
其具体技术方案为：
一种带有自发性kshv裂解复制的神经元细胞的构建方法，包括以下步骤：
从vero219细胞中提取带gfp(潜伏态)和rfp(裂解态)荧光标签的rkshv.219病毒，感染sh-sy5y细胞，采用流式技术分选带红色荧光(rfp)的细胞，命名为sk-rg，分析带绿色(gfp)荧光的细胞，命名为sk-g。分选后显微镜下分别观察细胞rfp和gfp情况，采用细胞计数检测细胞增殖情况。提取细胞的dna、rna和细胞上清液中的病毒dna。采用微滴式数字pcr(dropletdigitalpcr,ddpcr)和taqmanreal-timepcr检测kshv在细胞和上清液中的kshv的拷贝数，分析潜伏态的lana和裂解态的orf26的mrna表达水平。冻存分选细胞一月后复苏，再次检测细胞增殖能力，采用活细胞染色剂eflour670对新鲜分选的和冻存复苏的sk-rg细胞进行染色，采用流式细胞计数对比eflour670衰减和感染荧光信号变化的情况。最后用软琼脂集落形成实验检测细胞增殖能力，并检测sk-rg形成的克隆荧光信号的变化情况。
步骤1、细胞培养
sh-sy5y神经母细胞瘤细胞、vero219细胞、hek293t细胞采用dmem培养基、10％热灭活胎牛血清(fbs)、50mg/ml链霉素和50u青霉素培养。其中，vero219细胞培养基中加入了6μg/ml的嘌呤霉素，用于稳定感染的重组rkshv.219细胞的筛选。所有细胞在37℃、5％co2条件下培养。每3天更换一次。细胞计数采用台盼蓝染色法使用vi-cellxr计数仪计数。
步骤2、重组rkshv.219的诱导和滴度测定
将vero219细胞系传代，3.5×106/t75培养瓶接种，培养基20毫升/t75培养瓶。用5ml表达kshvrta的杆状病毒back50感染细胞4小时。除去杆状病毒并加入含有1.25mm丁酸钠的新鲜培养基。30小时后，除去含丁酸盐的培养基，并加入不含嘌呤霉素的新鲜培养基。通过离心(800rpm，5分钟)收集原始培养基中的细胞并放回锥形瓶中。72小时后，收集含有病毒的上清液，以800rpm离心10分钟，并通过0.45μm过滤器过滤。将澄清滤液中的病毒在4℃下以28000rpm离心2小时。将病毒颗粒重悬于200mldmem(含10％fbs、50mg/ml链霉素和50u青霉素)中，并储存于-80℃。在rkshv.219的滴度测定中，将hek293t细胞以每孔2.5×104接种到96孔板中，用100μl上清液(含病毒)感染，感染48h后，计数gfp阳性细胞/孔数。感染复数(moi)通过计算1mltcid50产生的gfp阳性细胞的数量来测定。
步骤3、kshv感染sh-sy5y细胞
用vero219细胞诱导的rkshv.219感染sh-sy5y细胞，通过hek293t细胞测定滴度。以moi为0.5的kshv感染sh-sy5y，培养2周。将kshv感染细胞命名为sh-kshvr219。rkshv.219的感染通过荧光显微镜测得gfp/rfp得到证实。
步骤4、dna提取和pcr
采用gentrapuregenedna提取试剂盒，按照说明书，从感染的sh-sy5y细胞中提取细胞dna。扩增orf26，使用以下循环条件进行:95℃5分钟；35个循环，95℃30s，56℃30s，72℃30s；随后在72℃下进行10分钟的最终延伸步骤。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色观察。
步骤5、上清液kshvdna的提取
在37℃条件下，首先用脱氧核糖核酸酶处理感染细胞的上清液以除去残留的细胞dna。然后用苯酚/氯仿从dna酶处理的kshv病毒中用乙醇沉淀法提取病毒dna。
步骤6、rna提取与实时聚合酶链反应
采用mirneasymini试剂盒，按照说明书制备总rna。采用superscripttmiii逆转录试剂盒将1μg量的纯化rna以20μl体积反向转录合成cdna的第一链。采用taqmanreal-timepcr和quantstudio3实时pcr检测系统进行。循环条件为:50℃，2min；95℃加热10分钟；40个循环，95℃15秒，60℃1分钟。结果使用quantstudio3软件进行分析。同时对每个实验设无模板对照。以pcr2.1-orf26质粒为kshv的标准品。用10倍的稀释倍数，把质粒从1.48×106拷贝/μl到1.48拷贝/μl做标准曲线进行分析。
步骤7、细胞分选
为了检测不同细胞的特性，对rkshv.219感染的细胞进行分选。对rkshv.219感染的sh-sy5y细胞进行胰蛋白酶消化。将细胞重悬于含有1％fbs的pbs中。细胞分选使用bdfacsariaii和bdfacsdiva软件进行。通过使用fsc和ssc门对细胞进行分选以消除碎片，然后通过使用fsc-h门和fsc-w门来选择单线态。kshv感染的sh-sy5y细胞首先在此门内使用gfp(530/30nm)鉴定。使用gfp(530/30nm)和rfp(582/15nm)在这些门内识别细胞。还设置分类门以收集gfp+和gfp+/rfp+群体。使用100微米喷嘴在20psi进行分选。将分选的液滴收集到含有1mldmem的15mlfalcon管中。被检测为表达rfp和gfp的细胞群在下文中称为sk-rg，仅带有gfp的命名为sk-g。分选后，将细胞转移到6孔培养板上，使细胞生长。
步骤8、微滴式数字pcr
细胞kshvdna拷贝数和lana和orf26mrna的表达水平分别应用ddpcrsupermixforprobeskit和one-steprtddpcrkitforprobes进行检测。用qx100液滴发生器制备20倍滴稀释预扩增产物。然后将液滴分段的样品转移到96孔板中，密封并在ac1000touch热循环仪中循环(bio–radlaboratoriesinc.)。dna聚合酶在94℃，10min，随后进行40循环，94℃，30s，55℃，1min，然后在98℃，10min灭酶。mrna样品分别在30℃，10min、94℃，5min，然后分别在94℃，30s、55℃，30s、55℃，4min进行40次循环，循环后98℃保温10min。使用qx100液滴读取器(bio-radlaboratoriesinc.)在fam和hex通道上读取完成的扩增反应，并对所得数据进行定量软件分析。
步骤9、efluor670活细胞染色
为了检测sk-rg细胞培养中能否持续感染细胞，我们用活细胞染色剂efluor670染色，流式细胞仪检测细胞。用0.25％胰蛋白酶将sk-rg和sh-sy5y细胞消化成单个细胞，用pbs洗涤2次，除去血清。将细胞重悬浮在pbs中，并与10μm的活细胞染色剂efluortm670(thermofisherscienceinc.)在pbs中以1∶1混合，37℃避光孵育10分钟。加入5体积冷完全培养基(含10％血清)停止标记，并在冰上孵育5分钟，用完全培养基洗涤细胞3次，并在培养箱中培养细胞。
步骤10、流式细胞检测
为鉴定sk-rg细胞是否能像其他细胞一样冻存复苏，我们将sk-rg细胞冻存一个月，随后复苏，同时正常培养未冻存的新鲜细胞，将复苏的细胞命名为sk-rg-t。为进一步检测kshv的感染在细胞是否能够持续，我们将kshv感染的sk-rg细胞和对照细胞用0.25％胰蛋白酶从平板上分离用pbs洗涤。并每3天在bdaccuritmc6plus流式细胞仪上对gfp和efluortm670阳性细胞以及大小进行测定。使用accuric6plus，对数据进行分析。
步骤11、软琼脂形成实验
为了检测kshv感染的细胞从单个细胞到多个细胞的状态变化，并检测不同感染的细胞克隆形成能力，将含有0.7％琼脂糖和10％fbs的基层倒入每个60mm板中。琼脂凝固后，将sk-rg、sk-g和sh-sy5y细胞(3×103)胰蛋白酶消化，再悬浮于含有10％fbs的dmem中的4毫升0.35％琼脂糖中。接种后，将平板在37℃、5％co2温育21天。细胞每3-4天补充一次营养。实验结束时，用0.2％硝基蓝四唑染色菌落，拍照并计数。每个细胞实验重复三次。
步骤12、统计分析
使用spss16.0版进行统计分析。数据测量采用独立t检验和方差分析。定量值表示为平均标准差。差异有统计学意义(p<0.05)。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明的目的在于提供一种带有自发性kshv裂解复制的神经元细胞的构建方法。此类细胞能够自发持续保持裂解态复制，在未加入任何诱导剂的情况下，kshv感染的sh-sy5y细胞可自发的出现裂解态感染，这样其他感染的细胞系特点不同，另外，此类裂解态细胞可以被分选和培养，能够正常存活，并没有出现因病毒裂解态而细胞发生死亡的现象，因此可以作为研究kshv裂解态和潜伏态转变机制的细胞模型，也可以作为kshv对神经元细胞作用机制研究的细胞模型。
附图说明
图1a是rkshv.219感染sh-sy5y细胞后，荧光显微镜检测结果。发现感染细胞sh-kshvr219不仅仅表达代表潜伏态的gfp，在没有经过诱导的情况下，部分细胞自发的表达了代表裂解态的rfp。这意味着细胞自发性的出现裂解态。
图1b是提取感染细胞sh-kshvr219的dna，pcr检测ore26的结果。我们通过扩增orf26dna的方式来进一步验证kshv的感染成功。以含有kshv的bc3细胞的dna为阳性对照，不加dna模板改加蒸馏水为模板的反应体系为阴性对照。
图1c是感染细胞sh-kshvr219中kshv的dna拷贝数检测。与不带荧光标记的bc3中的kshv感染阳性的sh-sy5y细胞进行对比，发现，每个sh-kshvr219细胞中含有3-4个kshv拷贝数。
图1d是利用rt-pcr检测orf26mrna在sh-kshvr219中的表达。
图1e是利用rt-pcr检测lanamrna在sh-kshvr219中的表达。
图2a是流式技术检测rfp与gfp阳性细胞比例。发现带有rfp的细胞占1.2±0.22％，其自身仍然能表达gfp，只带gfp的潜伏态细胞占13.1±2.07％。
图2b是依据gfp和rfp利用流式分选技术，将潜伏态和裂解态的细胞分离开，分选后将带有rfp和gfp的裂解态细胞命名为sk-rg，尝试培养细胞，发现他们可以存活，随着细胞的增长，荧光信号也能保持。
图3a是采用流式技术比较分选后sk-rg与未感染细胞的大小。发现sk-rg细胞较未感染细胞体积大。
图3b是比较sk-rg、sk-rg和未感染细胞在1、3、5、7天的细胞生长情况。发现kshv感染的细胞增殖速率加快(p<0.05)。
图3c是采用软琼脂集落形成实验检测sk-rg、sk-g和未感染细胞培养21天后形成的克隆大小。发现sk-rg、sk-g形成的克隆明显大于未感染细胞。
图3d采用软琼脂集落形成实验检测sk-rg、sk-g和未感染细胞培养21天后形成的克隆数目。发现sk-rg、sk-g形成的克隆数多于未感染细胞(p<0.001)
图4a是检测sk-rg细胞培养上清液中kshv病毒拷贝数。我们提取了培养1、3、5、7天中sk-rg细胞上清液中的kshvdna，检测发现kshv的拷贝数在分选完第一天的上清液中为2.53728×105±38261，到第7天可以达到4.461590×106±508942，这明显高于sk-g细胞(p<0.001)。
图4b是检测不同培养时间sk-rg细胞中的kshv拷贝数，与sk-g细胞做比较。sk-rg细胞中的kshvdna拷贝数高于sk-g细胞(p<0.05)。
图4c是检测培养1、3、5、7天sk-rg、sk-g细胞中的orf26mrna的表达水平。sk-rg的表达水平可以高达1.078333×106±83864，明显高于sk-g细胞(p<0.001)。
图4d是检测培养1、3、5、7天sk-rg、sk-g细胞中的lanamrna的表达水平。sk-rg的表达水平可以高达3.64833×105±13881，明显高于sk-g细胞(p<0.001)。
图5a是冻存一月和未冻存的新鲜sk-rg细胞的增殖情况检测。为鉴定sk-rg细胞是否能像其他细胞一样冻存复苏，我们将sk-rg细胞冻存一个月，随后复苏，将复苏的细胞命名为sk-rg-t，与新鲜细胞作比较，发现冻存与未冻存的细胞均可以正常生长。细胞计数测细胞增殖情况，发现复苏细胞和未冻存的细胞具有共同的生长趋势，生长速率快于未感染组(p<0.001)。
图5b是冻存一月和未冻存的新鲜sk-rg细胞大小的检测。采用流式技术比较冻存一月复苏的sk-rg-t细胞和未冻存的sk-rg细胞及未感染细胞sh-sy5y的大小，发现sk-rg-t与sk-rg细胞较未感染细胞体积大。
图5c是通过efluor670染色及gfp信号检测，说明kshv在细胞中持续感染情况。用efluor670对于未冻存和冻存复苏的细胞进行染色，每3天流式测信号强度，持续第二周时，efluor670随着细胞的生长已经完全衰减，但冻存和未冻存的sk-rg细胞仍然能够保持荧光信号，说明sk-rg细胞能够正常培养，并保持感染。
图6kshv感染的裂解态的sk-rg细胞可以循环的出现潜伏态和裂解态。采用软琼脂集落形成实验，我们固定观察sk-rg细胞形成的克隆的荧光信号变化，观察拍照6天，并持续21天，发现带有rfp荧光信号的sk-rg细胞在培养中可以进入潜伏态，rfp信号减弱，但经过3-4天后，rfp信号重新出现，如此循环往复，推测sk-rg细胞可能通过这种循环自我激活再进入潜伏态的方式逃避细胞的杀伤，保持存活，而不是裂解死亡。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
图1a：培养细胞，sh-sy5y神经母细胞瘤细胞、vero219细胞、hek293t细胞采用dmem培养基、10％热灭活胎牛血清(fbs)、50mg/ml链霉素和50u青霉素培养。其中，vero219细胞培养基中加入了6μg/ml的嘌呤霉素，用于稳定感染的重组rkshv.219细胞的筛选。所有细胞在37℃、5％co2条件下一起培养。每3天更换一次。将vero219细胞系传代，接种3.5×106/t75培养瓶细胞，培养基20毫升。用5ml表达kshvrta的杆状病毒back50感染细胞4小时。除去杆状病毒并加入含有1.25mm丁酸钠的新鲜培养基。30小时后，除去含丁酸盐的培养基，并加入不含嘌呤霉素的新鲜培养基。通过离心(800rpm，5分钟)收集原始培养基中的细胞并放回锥形瓶中。72小时后，收集含有病毒的上清液，以800rpm离心10分钟，并通过0.45μm过滤器过滤。将澄清滤液中的病毒在4℃下以28000rpm离心2小时。将病毒颗粒重悬于200mldmem(含10％fbs、50mg/ml链霉素和50u青霉素)中，并储存于-80℃。在rkshv.219的滴度测定中，将293t细胞以每孔2.5×104接种到96孔板中，用100μl上清液(含病毒)感染，感染48h后，计数gfp阳性细胞/孔数。moi通过计算1mltcid50产生的gfp阳性细胞的数量来测定。用从vero.219细胞产生的标记的rkshv.219感染sh-sy5y细胞，通过293细胞滴定测定，感染倍数(moi)为0.5。感染的sh-sy5y，培养2周。将kshv感染细胞命名为sh-kshvr219。rkshv219的感染通过荧光显微镜测得gfp/rfp得到证实。
图1b：采用gentrapuregenedna提取试剂盒，按照说明书，从感染的sh-sy5y细胞中提取细胞dna。扩增orf26、beta-actin扩增使用以下循环条件进行:95℃5分钟；35个循环，95℃30s，56℃30s，72℃30s；随后在72℃下进行10分钟的最终延伸步骤。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色观察。
图1c：采用gentrapuregenedna提取试剂盒，按照说明书，从感染的sh-sy5y细胞(包括sh-kshvr219和sh–kshvbc3)中提取细胞dna。orf26实时pcr使用taqman通用pcr主混合物和quantstudio3实时pcr检测系统进行。循环条件为:50℃，2min；95℃加热10分钟；40个循环95℃15秒，60℃1分钟。结果使用quantstudio3软件进行评估。同时对每个实验进行无模板对照。以pcr2.1-orf26质粒为kshv的标准品。用10倍的稀释倍数，把质粒从1.48×106拷贝/μl到1.48拷贝/μl做标准曲线进行分析。
图1d-e：采用mirneasymini试剂盒，按照说明书提取总rna。采用superscripttmiii逆转录试剂盒将1μg量的纯化rna以20μl体积反向转录合成cdna链。扩增orf26、lana、beta-actin扩增使用以下循环条件进行:95℃5分钟；35个循环，95℃30s，56℃30s，72℃30s；随后在72℃下进行10分钟的最终延伸步骤。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色观察。
图2a：将rkshv.219感染的sh-sy5y细胞进行胰蛋白酶消化，并将细胞重悬于含有1％fbs的pbs中。细胞分选使用bdfacsariaii和bdfacsdiva软件进行。通过使用fsc和ssc门对细胞进行分选以消除碎片，然后通过使用fsc-h门和fsc-w门来选择单线态。kshv感染的sh-sy5y细胞首先在此门内使用gfp(530/30nm)鉴定。使用gfp(530/30nm)和rfp(582/15nm)在这些门内识别细胞。还设置分类门以收集gfp+和gfp+/rfp+群体。使用100微米喷嘴在20psi进行分选。将分选的液滴收集到含有1mldmem的15mlfalcon管中。
图2b：将表达rfp和gfp的细胞群sk-rg分选后，1000rpm，5min，转移到6孔培养板上，采用dmem培养基、10％热灭活胎牛血清(fbs)、50mg/ml链霉素和50u青霉素培养。37℃、5％co2条件下一起培养。每3天更换一次，并采用荧光显微镜观察拍照。
图3a：将kshv感染的sk-rg细胞和对照sh-sy5y细胞用0.25％胰蛋白酶从培养皿上分离用pbs洗涤，于在bdaccuritmc6plus流式细胞仪上对细胞进行大小测定。
图3b：细胞计数，采用台盼蓝染色法使用vi-cellxr计数仪计数1、3、5、7天sk-rg、sk-g、sh-sy5y细胞数量。
图3c：为了检测sk-rg、sk-g和未感染的sh-sy5y细胞克隆形成能力，将含有0.7％琼脂糖和10％fbs的基层倒入每个60mm板中。琼脂凝固后，将sk-rg、sk-g和sh-sy5y细胞(3×103)胰蛋白酶消化，再悬浮于含有10％fbs的dmem中的4毫升0.35％琼脂糖中。接种后，将平板在37℃、5％co2温育21天。细胞每3-4天补充一次营养。实验结束时，用0.2％硝基蓝四唑染色菌落，拍照。
图3d：为了检测sk-rg、sk-g和未感染的sh-sy5y细胞克隆形成数目，将含有0.7％琼脂糖和10％fbs的基层倒入每个60mm板中。琼脂凝固后，将sk-rg、sk-g和sh-sy5y细胞(3×103)胰蛋白酶消化，再悬浮于含有10％fbs的dmem中的4毫升0.35％琼脂糖中。接种后，将平板在37℃、5％co2温育21天。细胞每3-4天补充一次营养。实验结束时，用0.2％硝基蓝四唑染色菌落，进行克隆计数。每个细胞系实验重复三次。
图4a：于60mm培养皿中，接种5×103细胞/皿，sk-rg、sk-g各接种4皿，于1、3、5、7天分别收集细胞培养上清液，提取上清液中的病毒dna。具体方法为在37℃条件下，首先用脱氧核糖核酸酶处理感染细胞的上清液以除去残留的细胞dna。然后用苯酚/氯仿从dna酶处理的kshv病毒中用乙醇沉淀法提取病毒dna。以上清液提取的dna为模板，采用taqmanrealtimepcr和quantstudio3实时pcr检测系统进行orf26的检测，从而对上清液的病毒载量进行测定。循环条件为:50℃，2min；95℃加热10分钟；40个循环95℃15秒，60℃1分钟。结果使用quantstudio3软件进行评估。对每个引物对的所有样品进行复杂的检查，同时对每个实验进行无模板对照。以pcr2.1-orf26质粒为kshv的标准品。用10倍的稀释倍数，把质粒从1.48×106拷贝/μl到1.48拷贝/μl做标准曲线进行分析。
图4b：在图4a相应的细胞收集完上清液后，消化、取出皿中一半细胞，采用gentrapuregenedna提取试剂盒，抽提相应细胞中dna，以细胞中的dna为模板，采用taqman实时定量pcr和quantstudio3实时pcr检测系统进行orf26的检测，从而对上清液的病毒载量进行测定。循环条件为:50℃，2min；95℃加热10分钟；40个循环95℃15秒，60℃1分钟。结果使用quantstudio3软件进行评估。对每个引物对的所有样品进行复杂的检查，同时对每个实验进行无模板对照。以pcr2.1-orf26质粒为kshv的标准品。用10倍的稀释倍数，把质粒从1.48×106拷贝/μl到1.48拷贝/μl做标准曲线进行分析。
图4c-d：在图4a相应的细胞收集完上清液后，消化、取出皿中另一半细胞，采用mirneasymini试剂盒，按照说明书提取总rna。细胞kshvlana和orf26mrna表达水平分别应用ddpcrsupermixforprobeskit和one-steprtddpcrkitforprobes进行定量化。用qx100液滴发生器产生一20倍滴稀释预扩增产物。然后将液滴分段的样品转移到96孔板中，密封并在ac1000touch热循环仪中循环(bio–radlaboratoriesinc.)。dna聚合酶在94℃活化10min，随后进行40循环94℃活化30s，55℃活化1min，然后在98℃后循环10min灭酶。mrna样品分别在30℃保温10min、94℃保温5min，然后分别在94℃保温30s、55℃保温30s、55℃保温4min进行40次循环，循环后98℃保温10min。使用qx100液滴读取器(bio-radlaboratoriesinc.)在fam和hex通道上读取完成的扩增反应，并对所得数据进行定量软件分析。
图5a：将sk-rg细胞冻存，一个月后复苏，命名为sk-rg-t，采用台盼蓝染色法使用vi-cellxr计数仪计数1、3、5、7天sk-rg-t、sk-rg、sh-sy5y细胞数量。
图5b：将sk-rg-t、sk-rg、sh-sy5y细胞用0.25％胰蛋白酶从培养皿上分离用pbs洗涤，于在bdaccuritmc6plus流式细胞仪上对细胞进行大小测定。
图5c：为了检测sk-rg细胞培养中能否持续感染细胞，我们用活细胞染色剂efluor670染色，流式细胞仪检测细胞。用0.25％胰蛋白酶将sk-rg和sh-sy5y细胞消化成单个细胞，用pbs洗涤2次，除去血清。将细胞重悬浮在pbs中，并与10μm的活细胞染色剂efluortm670(thermofisherscienceinc.)在pbs中以1∶1混合，37℃避光孵育10分钟。加入5体积冷完全培养基(含10％血清)停止标记，并在冰上孵育5分钟，用完全培养基洗涤细胞3次，并在培养箱中培养细胞，并每3天在bdaccuritmc6plus流式细胞仪上对gfp和efluortm670阳性细胞以及大小进行测定。使用accuric6plus，对数据进行分析。
图6：为了检测kshv感染的细胞从单个细胞到多个细胞的状态变化并检测不同感染的细胞克隆形成能力，将含有0.7％琼脂糖和10％fbs的基层倒入每个60mm板中。琼脂凝固后，将sk-rg、sk-g和sh-sy5y细胞(3×103)胰蛋白酶消化，再悬浮于含有10％fbs的dmem中的4毫升0.35％琼脂糖中。接种后，将平板在37℃、5％co2温育21天。细胞每3-4天补充一次营养。试验结束时，用0.2％硝基蓝四唑染色菌落，显微镜下拍照。
结果
1.rkshv.219感染的sh-sy5y细胞中存在自发性裂解复制的细胞
我们用rkshv.219感染sh-sy5y细胞后，命名为sh-kshvr219，发现此细胞不仅仅表达代表潜伏态的gfp。有趣的是没有经过诱导，部分细胞自发的表达了代表裂解态的rfp(图.1a)。这意味着细胞自发性的出现裂解态。除了荧光观察，我们通过扩增orf26dna的方式来验证感染成功(图.1b-c)。我们进一步检测证明了裂解态orf26(图.1d)和潜伏态lana(图.1e)的mrna在此类细胞中能够同时表达。
2.rkshv.219感染的自发性裂解复制的细胞可以被分选和培养
为了研究rfp阳性的裂解态细胞能否存活，我们依据gfp和rfp利用流式分选技术，将潜伏态和裂解态的细胞分离开，发现带有rfp的细胞占1.2±0.22％，其自身仍然能表达gfp，只带gfp的潜伏态细胞占13.1±2.07％(图.2a)。将带rfp的裂解态细胞命名为sk-rg。只带gfp的细胞命名为sk-g。分选后尝试培养细胞，发现他们可以存活，随着细胞的增长，荧光信号也能保持(图.2b)。
3.kshv感染的裂解态细胞增殖速率加快
采用流式技术比较分选后sk-rg与未感染细胞的大小，发现sk-rg细胞较未感染细胞体积大(图.3a)。比较sk-rg、sk-rg和未感染细胞在1、3、5、7天的细胞生长数目，发现kshv感染的细胞增殖速率加快(p<0.05)(图.3b).采用软琼脂集落形成实验检测sk-rg、sk-g和未感染细胞培养21天后形成的克隆数目和克隆大小，发现sk-rg、sk-g形成的克隆数多于未感染细胞，克隆也明显大于未感染细胞(p<0.001)(图.3c-d)。
4.自发性裂解态的sk-rg细胞可以产生kshv病毒，表达高水平的orf26和lana.
为检测裂解态的sk-rg细胞是否能够产生和释放kshv病毒，我们提取了细胞上清液中的kshvdna，检测发现kshv的拷贝数在分选完第一天为2.53728×105±38261，到第7天可以达到4.461590×106±508942，明显高于sk-g细胞(p<0.001)(图.4a)。sk-rg细胞中的kshvdna拷贝数也远高于sk-g细胞(p<0.05)(图.4b)。sk-rg细胞中的orf26mrna的表达水平可以高达1.078333×106±83864(图.4c).lanamrna的表达水平可以高达3.64833×105±13881。明显高于sk-g细胞(p<0.001)(图.4d)。所有这些都说明sk-rg细胞大量的复制kshv病毒并可以释放入上清液中。
5.kshv感染的裂解态细胞可以持续的培养
为鉴定sk-rg细胞是否能像其他细胞一样冻存复苏，我们将sk-rg细胞冻存一个月，随后复苏，将复苏的细胞命名为sk-rg-t，为与新鲜细胞作比较，我们同时正常培养未冻存的细胞，结果发现冻存与未冻存的细胞均可以正常生长。细胞计数测细胞增殖情况，发现复苏细胞和未冻存的细胞具有共同的生长趋势，生长速率快于未感染组(p<0.001)(图.5a)。采用流式技术比较复苏细胞sk-rg-t和未冻存的细胞sk-rg与未感染细胞sh-sy5y的大小，发现sk-rg-t与sk-rg细胞较未感染细胞体积大(图.5b)。用efluor670对于未冻存和冻存复苏的细胞进行染色，每3天流式测信号强度，持续第二周时，efluor670已经完全衰减，但未冻存和冻存的sk-rg细胞仍然能够保持荧光信号图.5c)，说明sk-rg细胞能够正常培养，并保持感染。
6.kshv感染的裂解态的sk-rg细胞可以循环的出现潜伏态和裂解态
采用软琼脂集落形成实验，我们固定观察sk-rg细胞形成的克隆的荧光信号变化，观察拍照6天，并持续培养21天，发现带有红色荧光信号的sk-rg细胞在培养中可以进入潜伏态，rfp信号减弱，但经过3-4天后，rfp信号重新出现，如此循环往复，推测sk-rg细胞可能通过这种循环自我激活的方式保持存活，而不是裂解死亡。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。