专利名称：非小细胞肺癌中miR-10a基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种非小细胞非癌中miRNA基因的应用。
背景技术：
微 RNA( microRNA，miRNA )功能调控是当前生命科学的重要前沿。微RNA是一类长度为21-22 nt的非编码RNA分子，其通过转录后基因沉默调控靶基因的活性。通过对miRNA生物学功能及其调控的靶基因的研究表明，miRNA在肿瘤发生过程中起重要作用，miRNA很有可能成为癌症治疗新的途径。miRNA与靶基因mRNA的非编码序列(3' -UTR或5' -UTR)存在着一对多的关系。miRNA通常是在细胞核内由RNA聚合酶II转录，初产物为pri一miRNA, pri一miRNA被核酸酶RNase III Drosha和其辅助因子Drasha加工成为发卡型前体miRNA(pre—miRNA),pre一miRNA被转运蛋白Exportin 5从细胞核输出到细胞质，之后被Dicer酶复合物剪切成为短的miRNA双链，在解旋酶的帮助下miRNA双链被解离，成熟的miRNA和RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合。miRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 3' - UTR中的互补序列相结合，随即依据miRNA与其靶基因序列的互补性高低，或是抑制蛋白质翻译延伸，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。肺癌是导致全球癌症死亡的最主要原因，每年因肺癌死亡的人数超过100万，并且每年新增病例120万。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常见的癌症,其中约80%的肺癌是非小细胞肺癌(non- small cell lung cancer, NSCLC)，其5年存活率仅为15%，主要原因是缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段。miRNA通过调控靶基因mRNA的翻译，在肺癌发生、发展及转移发挥重要作用。miRNA可能成为新的肺癌早期诊断和癌症进程相关的标记物，有助于疾病的准确诊断及个性化治疗。这一切设想的实现必须建立在miRNA靶基因功能研究工作的基础上。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种非小细胞肺癌中miR-lOa基因在抑制癌细胞的增殖中的应用。本发明的目的之二在于提供一种miR-lOa基因在促进癌细胞的凋亡中的应用。本发明的目的之三在于提供一种miR-lOa基因在下调H1299细胞系中非小细胞肺癌旁组织的表达中应用。本发明首先分别从正常肺组织和非小细胞肺癌的肺组织中提取RNA。通过反转录构建二者的cDNA文库，利用solexa测序技术，得到二者的miRNA表达图谱。第二步，分析得到的数据，鉴定出二者有显著表达差异的miRNA，并从中选择了miR-10ao第三步，利用qRT-PCR的技术检测多种非小细胞肺癌细胞系中的miR-lOa的表达量变化，并从中选择一种miR-10a表达下调的非小细胞肺癌细胞系,在此细胞系中过表达miR-lOa以检测其功能。
第四步，利用流式细胞仪技术和MTS技术，分别检测过表达HiiR-IOa后H1299细胞的凋亡和增殖情况的变化。第五步,通过Targetscan软件预测miR-lOa的祀基因，并将其m RNA的3' -UTR连接pGL-3载体。将miR-lOa与重组质粒共转入HEK-293T细胞48h后检测荧光。第六步，在H1299细胞中过表达miR-10a，检测MAP3K7编码的蛋白含量变化。H1299细胞系中miR-lOa基因通过与其靶基因MAP3K7的mRNA的:V -UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶基因的mRNA。结合生理生化试验，确定了在H1299细胞系中miR-lOa与MAP3K7有相互作用。这种相互作用影响了 H1299细胞的增殖、凋亡等生命活动。本实验通过软件预测、solexa测序分析，并构建载体，在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了 MAP3K7是miR-lOa的靶基因，并在H1299细胞中利用过表达和western-blot的技术,进一步验证了该发现。所公开的为在H1299细胞系中MAP3K7是miR-lOa的靶基因的首次报道，该发明在临床上为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。·
图I solexa测序结果
图2 H1299细胞中miR-lOa的相对表达含量 图3过表达miR-lOa后促进H1299细胞凋亡 图4过表达miR-lOa后抑制H1299的增殖 图5 MAP3K7是miR-lOa的靶基因。
具体实施例方式下面将结合具体实例进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一根据solexa测序结果,确定miR-10a抑制非小细胞肺癌生长
本发明所用到的k-ras基因突变小鼠肺癌模型(L703T2)和正常肺癌模型(L1805)由中科院生化细胞所季宏斌教授课题组提供。将正常小鼠的肺组织和患有非小细胞肺癌的小鼠的肺组织取样，用TRIZOL法裂解组织，加入氯仿，待蛋白与核酸分层，离心之后吸取上清并加入异丙醇沉淀。再次离心后以乙醇洗涤沉淀，晾干，获得总RNA。利用TaKaRa公司的反转录试剂盒构建两种组织的cDNA文库，以oligo dt为引物进行反转录,通过变性反应和反转录2步获得后续实验的cDNA。将样品利用solexa方法测序(Solexa测序由华大基因公司完成)，参见图I和图2。利用得到的数据，分析后发现在非小细胞肺癌肺组织中miR-lOa的表达显著的下调，参见表1，说明miR-lOa具有抑制非小细胞肺癌的作用。表I miR-lOa的表达丰度及变化___
miRNANon-tumorlungtissuesNSCLC Foldchange(Log2)
权利要求
1.一种非小细胞肺癌中miR-lOa基因在抑制癌细胞的增殖中的应用。
2.一种非小细胞肺癌中miR-lOa基因在促进癌细胞的凋亡中的应用。
3.一种非小细胞肺癌中miR-lOa基因在下调H1299细胞系中非小细胞肺癌旁组织的表达中应用。
全文摘要
本发明涉及一种非小细胞非癌中miRNA基因的应用。H1299细胞系中miR-10a的一种靶基因，miR-10a通过与靶基因mRNA的3′-UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶基因的mRNA。结合生理生化试验，确定了在H1299细胞系中miR-10a与MAP3K7有相互作用。这种相互作用影响了H1299细胞的增殖、凋亡等生命活动。本实验通过软件预测、solexa测序分析，并构建载体，在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了MAP3K7是miR-10a的靶基因，并在H1299细胞中利用过表达和western-blot的技术，进一步验证了该发现。所公开的为在H1299细胞系中MAP3K7是miR-10a的靶基因的首次报道，该发明在临床上为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。
文档编号A61P35/00GK102743765SQ201210162999
公开日2012年10月24日 申请日期2012年5月24日 优先权日2012年5月24日
发明者侯品品, 王德韬, 金由辛, 韦嘉励, 马中良 申请人:上海大学