外磁场辅助孵育装置、方法及其应用与流程

本发明涉及全自动医疗检测设备领域，特别提供了一种用于帮助循环肿瘤细胞与抗体磁珠结合的外磁场辅助孵育装置、方法及其应用。

背景技术：

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是指从肿瘤上脱落并进入循环系统的癌细胞，其可自发或通过诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶或转移灶)脱落，进入体循环系统(如外周血)。大部分CTC进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着病灶以外的组织或器官上，进而发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。这些细胞可以通过简单的血液检测来发现，可作为癌症的生物学标志物，指示体内是否存在肿瘤，以及它们的遗传状况和药物敏感性。与手术干预不同，CTC与纵向研究兼容，能够有效指导治疗。CTC检测可有效地应用于体外早期诊断、预后评价、个体化治疗(包括快速临床化疗药物筛选和耐药性的检测)、肿瘤复发监测及新的肿瘤药物开发等。但CTC检测步骤较多、操作繁琐，也阻碍了该项技术在临床上的推广。

目前常规的CTC检测分为两个步骤，即CTC富集(或捕获)步骤和CTC检测分析步骤。常用的CTC捕获技术有梯度密度离心技术、滤膜技术、流式细胞技术、微流控芯片技术和免疫磁珠技术。其中，免疫磁珠技术涉及试样的混匀、细胞磁吸附等步骤，适合在大体积上样条件下对少量的特殊细胞进行分离，对于CTC检测应用尤其有利，其操作步骤相对简单，易于实现自动化。

目前国内已上市的循环肿瘤细胞富集设备是强生公司的cellsearch系统和ctcbiopsy系统(非磁捕获系统，采用了物理过滤的方式)。为了更好地实现抗体磁珠与CTC细胞的结合，通常采用外磁场辅助孵育装置对混合物进行磁孵育。cellsearch系统就基于免疫磁珠分选原理，采用外磁体提升抗体磁珠对循环肿瘤细胞捕获效率。具体地利用外磁体在导轨上的周期往返运动，实现离心管中磁场的改变，但其结构比较复杂，且在对试样进行吸附观察时，发现磁珠与试样结合的效率比较低。此外，由于使用外磁体周期往返运动产生变化磁场，需要采用额外的电机对其进行驱动，而不利于设备的小型化和集成化。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种结构简单，便于设备集成化的外磁场孵育装置，高效快速精确地完成孵育过程。

技术实现要素：

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种外磁场辅助孵育装置，包括至少一组磁体组合，所述磁体组合由分立的多块柱状磁体组成，每组所述磁体组合呈夹状，其夹口形状适于多块所述柱状磁体同时靠近或抵靠盛放待孵育物的容器器壁，所有所述柱状磁体的同名磁极朝向所述夹口设置。

在本发明的一个较优实施例中，其孵育装置还包括驱动电机、离心装置，所述驱动电机与所述磁体组合连接，用于驱动所述磁体组合靠近或抵靠所述离心装置。其离心装置更进一步地采用步进电机驱动。

在本发明的一个较优实施例中，所述柱状磁体为钕铁硼磁体。

在本发明的一个较优实施例中，所述磁体组合的高度为所述盛放待孵育物的容器的1/3～2/3。柱状磁体的N-S方向为轴向，垂直于N-S方向为法向。由其由于盛放待孵育物的容器通常为管状物，而磁体提供的磁场需要覆盖所有管内液体，因此需要磁体在法向上具有一定的高度。

在本发明的一个较优实施例中，所述柱状磁体的数量为3。

本发明还提供了一种外磁场辅助的孵育方法，包括以下步骤：

磁体靠近离心管；

孵育；

搅拌混匀；

磁体离开离心管；

离心机转动至少一个工位；

重复上述步骤直至孵育过程完成。

本发明还提供了上述外磁场辅助孵育装置在循环肿瘤细胞检测系统中的应用。

本发明进一步提供了上述外磁场辅助孵育方法在循环肿瘤细胞检测系统中的应用。

技术效果

本发明提供了一种外磁场孵育装置及其使用方法，具有磁场强、装置结构简单的特点，通过将其与驱动电机和离心装置联用，提高了设备的集成化、自动化程度。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个优选实施例中的磁体与离心管的结构正视图；

图2是图1实施例中磁体与离心管的结构顶视图；

图3是图1的等同实施例中磁体与离心管对的结构顶视图；

图4是图1实施例的磁体组合安装于CTC肿瘤细胞检测系统中的结构顶视图。

附图标记：1-钕铁硼磁体，2-离心管，3-驱动电机，4-磁座，5-限位机构。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

本实施例提供了一种用于CTC循环肿瘤细胞检测系统中的外磁场辅助孵育装置，如图1所示，该孵育装置的功能部分结构单元由一组三联磁铁组成，三联磁铁的高度h约为试管长度的1/2，以此保证磁场对整个试管内盛发有抗体磁珠部分的全部覆盖。

该三联磁铁为三块柱状钕铁硼强磁铁1的N极互相靠近组成的夹状组合，由于同性相斥的作用，三块钕铁硼磁铁1彼此靠近而不接触，围成的夹口形状根据检测系统中使用的离心管2尺寸计算得到，如图2所示，其夹口大小恰好适合放入离心管2，同时保持与离心管2紧密接触，从而保持对离心管2内部抗体磁珠的引力，使得抗体磁珠在接近三联磁体时可保持定向移动。

将该结构单元安装于CTC循环肿瘤细胞检测系统中，可以利用与离心装置的联用提高设备的集成化程度。如图3所示，将4组三联磁铁安装于磁座4之上，由驱动电机3带动磁座4与三联磁铁进行运动，驱动电机3推动磁座4运动至最远端时，可接近抵靠离心管2下端，三联磁铁产生的强磁场，管中的抗体磁珠在磁场的作用下定向运动能力提高，捕获全血样品中的分析物或提取物。而后，驱动电机3回复至起始位，该起始位位置由限位机构5进行限定，限位机构5同轨道上的凸起配合限制了磁座4的移动行程，可配合驱动电机3实现在工作位置和起始位置的迅速转移。图3中仅给出了离心装置中与磁座4配合的部分，本实施例中的离心平台可容纳12只离心管2，两两一组，离心平台采用步进电机驱动，因此可在每次完成磁珠定向移动后，迅速撤回磁座4，同时离心机构旋转两个工位，使下两组离心管2进入工作位置，同时将三联磁铁抵靠至离心管2管壁。在离心管2随离心盘缓慢运动时，管中磁场消失；对管内液体进行搅拌混匀后，当离心管2再次运动靠近该辅助装置时，实现与上述相同的功能。依次类推，通过磁珠数次反复的定向运动，提高磁珠对分析物或提取物的结合概率/捕获效率。整个过程可通过步进电机和驱动电机3的移动速度，自动化地快速地完成抗体磁珠与CTC细胞结合的孵育过程。

以下详述使用本实施例中的外磁场辅助孵育装置完成CTC细胞和抗体磁珠结合过程的孵育过程的方法，方法包括以下步骤：

将盛发有待孵育物的离心管放入离心平台的对应位置；

入位检测；

驱动电机驱动三联磁体靠近离心管至工作位置，完成抗体磁珠定向移动；

保持一定时间的同时，利用搅拌装置对非工作位置的离心管进行搅拌混匀；

驱动电机驱动三联磁体离开离心管至起始位置；

离心机旋转两个工位，使另外四只离心管进入工作位置；

重复以上步骤，持续一定时间，直至整个孵育过程完成。

实施例2

将实施例1中的装置用于提高抗体磁珠对分析物或提取物的捕获效率，其中所述分析物或提取物为循环肿瘤细胞。

通过下面的试验验证后证实，本发明的装置与cellsearch系统中的同功能结构相比，可以大大提高抗体磁珠的捕获效率，尤其是在全血样品中捕获循环肿瘤细胞的能力，便于对其进行进一步的磁富集。

试验目的和设计：在全血基质中手动提取CTC，对比不同外加磁场对CTC回收率的影响。

试验分组设置如下：

组1：采用强生试剂，全血加入人乳腺癌细胞SKBR3后加入混合的样品稀释缓冲液(DB)，磁珠，增强剂溶液，孵育条件三联磁铁磁场作用2min，滴管反复吹打混匀1min，静置2min，做12个循环，用双头磁棒进行提取，设置双孔实验；

组2：全血加入SKBR3细胞后，加入混合好的强生DB、强生磁珠和Genovo增强剂，孵育条件：搅拌棒在全血不同位置间隔搅拌60min，用磁棒进行提取，设置双孔实验。

组3：采用强生试剂，全血加入SKBR3后加入混合的DB，磁珠，增强剂溶液，孵育条件强生磁铁磁场作用2min，滴管反复吹打混匀1min，静置2min，做12个循环，用双头磁棒进行提取，设置双孔实验；

所使用的试验材料参见下表1。

表1试验材料

操作步骤包括：

1.准备：向用到的96孔板、14mL圆底离心管加入2％牛血清白蛋白(BSA)，室温封闭10min，移液器吸头使用前均在2％BSA中吹打5次。

2.细胞计数：吸尽并回收封闭96孔板的BSA，分别取50uL稀释并染色好的SKBR3细胞，加入至封闭好的96孔板中，静置，用EVOS(thermo公司生产的一台全自动显微成像系统，可以自动对细胞进行成像扫描，并进行半自动计数)扫描并计数。

3.孵育：将计数好的细胞中加入清洗后的全血中，按照试验组的要求添加试剂，并进行孵育1h。

4.吸附：放入磁棒进行吸附，条件：磁棒在全血四个位置(每次移动距离为1.25cm)各静置15分钟，共吸附1h。

5.清洗：将磁棒转移到含有5mL磷酸缓冲液(PBS)的24孔深孔板中进行漂洗。

6.保存：将清洗后的磁棒转移到含有3mL PBS的14mL圆底离心管中，等待计数。

实验结果及讨论：

表2各组试验结果对比

从表2中可以看出，在无外磁体的情况下，捕获效率为79.7％；在使用强生外磁体时，捕获效率为88.7％；而使用本发明的外磁体时，捕获效率为103.5％。由此可知，本发明的外磁体可以大大提高捕获效率。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。